專利名稱：：用于多種腫瘤抑瘤基因檢測的cDNA芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物芯片，尤其涉及DNA芯片。技術(shù)背景3號染色體短臂的雜合性丟失(lossofheterozygosity,LOH)是包括鼻咽癌在內(nèi)多種腫瘤中的常見事件，其中又尤以3p21區(qū)域LOH頻率為高。根據(jù)Knudson的"兩次突變"學(xué)說，某一抑瘤基因經(jīng)胚性突變以野生型/突變型的雜合狀態(tài)傳給子代，然后通過細胞有絲分裂過程中的突變，轉(zhuǎn)為半合性(野生型等位基因丟失)或純合型(突變/突變型)，致使正常抑瘤基因不再表達，就可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。如果抑瘤基因的突變或多態(tài)性等位基因型，如單核苷酸多態(tài)(singlenucleotidepolymorphisms/SNP)存在家族與人群聚集性，可顯著提高患腫瘤的風(fēng)險，該基因即為腫瘤遺傳易感基因。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種用于多種腫瘤抑瘤基因表達檢測的cDNA芯片，利用該芯片，能夠同時檢測從正常組織到癌變組織的多個基因表達水平的變化，能開展腫瘤多基因表達的動態(tài)研究。本發(fā)明的芯片包括基片及固定于基片上的cDNA探針，所述cDNA探針由從人類染色體3p上選取的如表1所述的288個基因，以及對照點探針組成。本發(fā)明在對照探針的選擇上，可以選擇看家基因作為陽性對照。由于本發(fā)明中所選取的288個基因都是與多種腫瘤密切相關(guān)的抑瘤基因，因此，利用本發(fā)明的芯片能同時檢測從正常組織到癌變組織的和多種腫瘤密切相關(guān)的多個基因的表達水平的變化。與現(xiàn)有的單個基因功能研究相比，利用本發(fā)明的芯片，能開展腫瘤多基因表達的動態(tài)研究，它簡化了基因表達檢測的過程，節(jié)約了實驗時間和實驗成本。與全基因組表達譜芯片相比，它針對性更強，縮小了多種腫瘤抑瘤基因篩選的范圍，在篩選多種腫瘤抑瘤基因方面具有更大的實用價值，同時節(jié)省了大量的人力、財力和物力。具體實施方式實施例l:本發(fā)明芯片的制備1.克隆如表1所述的288個基因，各基因符號和gi號見表1。具體克隆過程為(1)收集人胚來源的人胚鼻咽、胃、食管、肺、肝、心、脾、肌肉、腎、皮膚等組織，液氮保存。用Trizol試劑盒提取成人胚胎鼻咽、胃、食管、月市、肝、心、脾、肌肉、腎、皮膚總RNA，混合各組織RNA樣本。把液氮凍存的組織放到冰凍的碾缽中碾碎，加入適量的Trizol試劑(Trizol試劑加入量為lml/100mg組織)，裂解組織，冰上放置5min。吸入1.5ml離心管中，加入氯仿(氯仿加入量為0.2ml/mlTrizol)，冰上放置5min。10000xg離心15min，吸取上清于另一離心管，加入等體積的異丙醇，室溫放置10min。10000xg離心15min，去上清，70%乙醇洗滌沉淀，室溫風(fēng)干，加DEPC處理的雙蒸水溶解。用紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。(2)用DNase-I消化RNA中痕量的DNA:反應(yīng)體積100^1，總RNA10嗎、DNase陽I10u、RNasin200u、Tris.Cl(pH8.3)10mM、MgCl210mM，37°C，lh，等體積苯酚氯仿抽提，乙醇沉淀，RNA溶于DEPC處理的水中。(3)為288個基因設(shè)計引物以基因的mRNA序列的3'末端設(shè)計引物。以人胚各組織混合的RNA為模板，進行PCR擴增，膠回收目的片段。PCR條件為94。C變性30sec，60。C退火30sec，72。C延伸50sec，進行35個循環(huán)，以達到富集表達片段。取8^1PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。上海華舜公司的膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，每個基因片斷回收20管50^1PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物割膠純化后直接測序驗證，并輸入NCBI/Blast進行序列匹配，保證PCR序列的唯一性。2.點制芯片-288個基因克隆產(chǎn)物重復(fù)兩次點樣，37個看家基因(參見表2)作重復(fù)點樣兩次作為74個陽性對照點，以未加DNA的點樣液作為16個空白對照點。用點樣儀在基片上進行點樣，基片可以是各種用于作為生物芯片的片基，如玻片或塑料片，在本發(fā)明的實施中采用硅垸化玻片。點樣后玻片經(jīng)水合2h、室溫干燥0.5h，UV交聯(lián)，再分別用2g/L的SDS、水及2g/L硼氫化鈉處理10min，晾干，即制得本發(fā)明的芯片。表l作為本發(fā)明芯片探針的3p段上的288個基因<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>SS18L2NM—016305synovialsarcomatranslocationgeneonchromosome18-like2NKTR畫—005385naturalkiller-tumorrecognitionsequenceKIAA1190NM—145166hypotheticalproteinKIAA1190SRYPNM—152393sarcosynapsinKIAA1173NM—020707KIAA1173proteinFLJ25467NM—144719hypotheticalproteinFLJ25467HIGlNM—014056likelyorthologofmousehypoxiainducedgene1CCBP2NM—001296CCBP2畫—001296chemokinebindingprotein2CYP犯1NM—004391cytochromeP450,family8，subfamilyB，polypeptide1DKFZP434B172XM—046264DKFZP434B172proteinFLJ14566NM—032806hypotheticalproteinFLJ14566SNRKNM—017719SNF-lrelatedkinaseFLJ10375畫一O18075hypotheticalproteinFLJ10375ABHD5(CGI-58)NM—016006abhydrolasedomaincontaining5DKFZp313畫21NM—173826hypotheticalproteinDKFZp313N0621LOC285345XM—211854hypotheticalproteinLOC285345LOC285346XM—209579hypotheticalproteinLOC285346ZFP觀一O18651zincfingerproteinFLJ36870NM—173658hypotheticalproteinFLJ36870ZNF197NM—006991zincfingerprotein197ZNF35NM—003420zincfingerprotein35(cloneHF.10)FLJ14855NM—033210hypotheticalproteinFLJ14855MGC21738畫一l45044zincfmgerproteinMGC21738KIAA1143NM—020696KIAA1143proteinKNSL7NM—020242kinesin-like7MGC29956NM—144638hypotheticalproteinMGC29956TGM4NM—003241transglutaminase4(prostate)FLJ20209畫一l94276hypotheticalproteinFLJ20209ZDHHC3NM—016598zincfinger,DHHCdomaincontaining37<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>HYPBNM—014159huntingtininteractingproteinBFLJ39534XM211852hypotheticalproteinFLJ39534KIF9畫—022342kinesinfamilymember9KIAA0795NM025010KIAA0795proteinPTPN23NM—015466proteintyrosinephosphatase,non-receptortype23SCAP畫—012235SREBPCLEAVAGE-ACTIVATINGPROTEINFLJ20211NM—017713hypotheticalproteinFLJ20211CSPG5畫—006574chondroitinsulfateproteoglycan5(neuroglycanC)SMARCC1NM—003074SWI/SNFrelated,matrixassociated，actindependentregulatorofchromatin,subfamilyc，member1DHX30NM—014966DEAH(Asp-Glu-Ala-His)boxpolypeptide30transcriptvariant2DHX30NM—138614DEAH(Asp-Glu-Ala-His)boxpolypeptide30transcriptvariant3MAP4畫—002375microtubule-associatedprotein4，transcriptvariant1CDC25A畫—001789celldivisioncycle25ACAMPNM—004345cathelicidinantimicrobialpeptideSZF1NM—016089KRAB-zincfingerproteinSZF1-1NME6畫—005793non-metastaticcells6,proteinexpressedin(nucleoside-diphosphatekinaseLOC285231XM一211813hypotheticalproteinLOC285231PLXNB1麵—002673plexinB1FLJ12436畫—024661hypotheticalproteinFLJ12436TREX1NM—033629threeprimerepairexonuclease1,轉(zhuǎn)錄本1TREX1麗—016381threeprimerepairexonuclease1，轉(zhuǎn)錄本2TREX1畫—032166threeprimerepairexonuclease1，轉(zhuǎn)錄本3TREX1NM一130384threeprimerepairexonuclease1，轉(zhuǎn)錄本4TREX1NM—130384threeprimerepairexonuclease1，轉(zhuǎn)錄本4TREX1雨—033628threeprimerepairexonuclease1，轉(zhuǎn)錄本5TREX1畫—033627threeprimerepairexonuclease1，轉(zhuǎn)錄本6TREX1畫—033627threeprimerepairexonuclease1，轉(zhuǎn)錄本6SCOTINNM—016479scotinPFKFB4畫—0045676-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase4SRPNM—033199stresscopin-relatedpeptideCOL7A1麗—000094collagen,typeVII，alpha1(epidermolysisbullosa,dystrophic,dominantandrecessiveUQCRC1NM一003365ubiquinol-cytochromecreductasecoreproteinISLC26A6NM—022911solutecarrierfamily26,member6CELSR3NM—001407cadherin，EGFLAGseven-passG-typereceptor3(flamingohomolog,DrosophilaAF3P21畫—016453SH3proteininteractingwithNck，90kDaIHPK2NM一O16291inositolhexaphosphatekinase2PRKAR2ANM—004157proteinkinase,cAMP-dependent,regulatory,type11，alphaSLC25A20畫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ncfingerprotein174(ZNF174),mRNAHomosapienscyclin-dependentkinase9(CDC2-relatedkinase)(CDK9),mRNAHomosapiensmRNAfordermatan/chondroitinsulfate2-sulfotransferase，completecds.HomosapienscDNAFLJ32260fis，clonePROST1000334Homosapiensubiquitinspecificprotease22(USP22),mRNAHomosapienssolutecarrierfamily17(anion/sugartransporter),member5(SLC17A5),mRNAHomosapienscDNA:FLJ21605fis,cloneCOL07274,highlysimilartoAF070416HomosapiensUMP-CMPkinasemRNAKIAA0416AB0078762887452'HomosapiensKIAA0416mRNA,partialcds實施例2:應(yīng)用本發(fā)明的芯片檢測差異表達基因在鼻咽和其他組織中的相對表達水平1.抽提、純化和擴增鼻咽癌、非腫瘤鼻咽上皮組織標(biāo)本RNA:(1)對保存于RNAlater中的23例鼻咽癌和非腫瘤鼻咽上皮組織標(biāo)本用LeicaCM1800冰凍切片機冰凍切片、HE染色，顯微鏡觀察，根據(jù)鼻咽癌患者標(biāo)本中癌細胞分布情況、慢性鼻咽炎患者或正常鼻咽部標(biāo)本中鼻咽粘膜柱狀細胞所占比例，用《鼻咽癌組織的顯微切割及其RNA線性擴增》(生物化學(xué)與生物物理進展，2005(05):463-467)—文所公開的方法對組織標(biāo)本進行顯微切割。分離鼻咽癌標(biāo)本中的純凈癌細胞，鼻咽部非癌標(biāo)本中的純凈粘膜柱狀細胞，顯微切割標(biāo)本后提取總RNA。Trizol試劑盒提取總RNA的具體步驟為把液氮凍存的組織放到冰凍的碾缽中碾碎，加入適量的Trizol試劑(lml/100mg組織)裂解組織，冰上放置5min。吸入1.5ml離心管中，加入氯仿(0.2ml/mlTrizol)，冰上放置5min。lOOOOg離心15min，吸取上清于另一離心管，加入等體積的異丙醇，室溫放置10min。lOOOOg離心15min，去上清，70%乙醇洗滌沉淀，室溫風(fēng)干，加DEPC處理的雙蒸水溶解。用紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。(2)選取6株腫瘤細胞系(參見表3)作為共同對照樣本(CommonReferencecelllines),抽提、純化和擴增共同對照樣本的RNA。采用Trizol試劑裂解細胞后進行RNA抽提，具體步驟與上述組織RNA抽提步驟相同。表3共同對照樣本名稱細胞來源ATCC號MCF7乳腺癌來源的細胞系A(chǔ)TCCHTB-22Hela宮頸腺癌來源的細胞系A(chǔ)TCCCCL-2RajiBurkitt淋巴來源的細胞系A(chǔ)TCCCCL-86MG-63骨肉瘤細胞系A(chǔ)TCCCRL-1427HNE1鼻咽癌細胞系U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤來源的細胞系18(3)DNase-I處理消化DNA。運用MessageAmpaRNAKit(Ambion，Austin,TX，USA)進行T7-basedRNA擴增，每樣本擴增一輪大約能產(chǎn)生10-15ug擴增的RNA(aRNA)。2.芯片雜交3.0ug左右的鼻咽癌、非腫瘤鼻咽上皮組織的aRNA用Cy5-dCTP標(biāo)記，等量commonreferenceaRNApool用Cy3-dCTP標(biāo)記，雜交。具體步驟為配制預(yù)雜交液，即將雜交試劑加入到的Eppenderf管中，振蕩混勻。將配制好的預(yù)雜交液放入95"C水浴鍋內(nèi)變性2min,將待預(yù)雜交的玻片放入95'C水浴鍋內(nèi)變性30sec，玻片取出后即放入無水乙醇中30sec,晾干。將己變性的預(yù)雜交液加到玻片的點樣區(qū)域內(nèi)，蓋上蓋玻片，放入雜交箱內(nèi)42'C預(yù)雜交56h。在冰浴中標(biāo)記探針于一已滅菌的1.5mLEppendorf管內(nèi)依次加入以下試劑(反應(yīng)終體積為50uL，以下試劑均為RNase—free):ddH20:23ul;逆轉(zhuǎn)錄引物5ul;總RNA:30-50ul振蕩混勻，置于70'C水浴10min。取出后，迅速置于冰上。分別加入以下試劑逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液10Ul;DTT:5ul;DNTPs:4ul，而后在暗室中加入以下試劑逆轉(zhuǎn)錄酶2ul;Cy5-dCTP或Cy3-dCTP:3ul。用手指彈打管壁以混勻樣品，手浴2min。將Eppendorf管置于42'C水浴2h后進行標(biāo)記。使用DNA純化柱(或乙醇沉淀)純化DNA。加入標(biāo)記試劑8ul，真空抽干。雜交在抽干的探針管中加6.5UL雜交試劑，充分混勻，使探針溶解。將預(yù)雜交的玻片取出，用ddH20沖去蓋玻片。將探針置于95"C水浴中變性2min;玻片置于95'C水浴中變性30sec,玻片取出浸無水乙醇30sec，探針取出后迅速置于冰上。將探針置于芯片上，用蓋玻片覆蓋，置于雜交艙中，用Parafilm密封，放入42'C雜交箱內(nèi)雜交過夜(1618h)，然后洗片，晾干后掃描。3.信號掃描和數(shù)據(jù)標(biāo)準化利用(ScanArray4000，GeneralScanningInc.)軟件對芯片進行灰度掃描；通過芯片圖像分析軟件GenepixPro3.0(AxonInstruments)對芯片灰度掃描圖進行分析，可以得到芯片上每個基因點的原始信號值，包括前景信號值和背景信號值。根據(jù)這些原始信號值進行后續(xù)的數(shù)值分析。用基因點Cy5信號的前景信號值減去它的背景信號值，得到該基因點的Cy5信號的實際強度值(以下簡稱為信號值)；并且，為了避免弱信號對實驗結(jié)果的干擾，將所有小于200的Cy5信號值用200替代。用基因點Cy3信號的前景信號值減去它的背景信號值，得到該基因點的Cy3信號值。為了校正Cy5、Cy3標(biāo)記體系間的系統(tǒng)誤差，實驗數(shù)據(jù)要進行均一化處理。均一化處理時先依據(jù)以下2個原則篩選出參與均一化處理的有效基因點l)該基因點的Cy3、Cy5信號值皆大于200，或者其中之一大于800;2)該基因點的Cy5信號值/Cy3信號值的比值在0.1-10之間。計算每個有效基因點Cy5信號值/Cy3信號值的比值，然后求出其相應(yīng)的自然對數(shù)值r=ln(Cy5/Cy3)，算出全部有效基因點r值的平均值R，將所有基因點的Cy3信號值乘上均一化系數(shù)，得出調(diào)整后的Cy3、并且，為了避免弱信號對實驗結(jié)果的干擾，將所有小于200的Cy34直以200取代。芯片間可重復(fù)率除點樣時的壞點(包括殘點，融點，漏點)和陽性、陰性、空白對照以外，兩次重復(fù)實驗中Cy5、Cy3兩種熒光信號強度均>200的稱為有效點，設(shè)其數(shù)目為N;兩張芯片上的同一有效點在兩次重復(fù)實驗中ratio值(Cy3/Cy5)的比值(ratio1/ratio2)在0.52.0之間的稱為可重復(fù)點，設(shè)其數(shù)目為n;芯片間可重復(fù)率二！xl00%N芯片內(nèi)可重復(fù)率參考芯片間可重復(fù)率，即3p21區(qū)域288個陽性克隆及對照系統(tǒng)共兩次重復(fù)共800個點中，除點樣時的壞點(包括殘點，融點，漏點)夕卜，Cy5、Cy3兩種熒光信號強度均〉200的稱為有效點，設(shè)其數(shù)目為N;同一有效點在同一芯片兩次重復(fù)檢測中兩個ratio值(Cy3/Cy5)的比值芯片內(nèi)可重復(fù)率二丄x100^N(ratiol/ratio2)在0.52.0之間的稱為可重復(fù)點，設(shè)其數(shù)目為n;4.運用T-test統(tǒng)計學(xué)方法尋找3p21段鼻咽癌表達差異基因利用Genesis軟件選取Cy3、Cy5信號值皆大于200，Cy3或Cy5信號值大于800。取中值，標(biāo)化數(shù)據(jù)。通過T-test的方法p<0.05水平篩選表達差異基因。5.半定量RT-PCR計算各差異表達基因在鼻咽和其他組織中表達的相對水平首先用DNase-I消化RNA中痕量的DNA:反應(yīng)體積100iU，總RNA10Ug、DNase畫I10u、RNasin200u、Tris.Cl(PH8.3)10mM、MgCl210mM，37°C，lh,等體積苯酚氯仿抽提，乙醇沉淀，RNA溶于DEPC處理的水中。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序作逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體積20ix1，模板RNA2lig。反應(yīng)結(jié)束后，98°C，5min終止反應(yīng)。50u1PCR反應(yīng)體系中含KC150mmol/L，MgCl21.5mmol/L，dNTP200mmol/L，Tris.HCl10mmol/L，PH8.0,目的片段上下游引物0.1mmol/L，模板cDNA5ul，TaqDNA聚合酶3ul，石臘油覆蓋。為較客觀地反映mRNA表達的相對水平，在目的基因及內(nèi)對照GAPDH的PCR平臺期前結(jié)束PCR。采用下列參數(shù)進行差異PCR:94。C，30sec;59°C，30sec;72°C，30min;5個循環(huán)后加入5mmol/LGAPDH上下游引物混合液1lU，繼續(xù)進行23個循環(huán)終止。1.5°/。瓊脂糖凝膠電泳，上樣量5ul，溴乙錠染色，紫外燈下照相。RT-PCR結(jié)果的瓊脂糖電泳照片用TIPAS98圖像分析儀的圖像分析系統(tǒng)進行灰度掃描，灰度掃描值(光密度掃描值)為IA，它代表凝膠上目的條帶的亮度，即反應(yīng)目的條帶的量。PCR產(chǎn)物的相對量(IA比值k目的片段的IA內(nèi)對照GAPDH的IA通過上述公式計算各鼻咽差異表達cDNA片段在成人鼻咽、胃、食管、肺、肝、心、脾、肌肉、腎、皮膚中的IA比值，該比值即為RT-PCR產(chǎn)物的相對量。CIA代表腫瘤組織目的片段的含量，NIA代表正常組織目的片段的含量，CIA和NIA二者相除得到的數(shù)值即各差異表達基因在鼻咽和其他組織中表達的相對水平。權(quán)利要求1.一種用于多種腫瘤抑瘤基因檢測的cDNA芯片，包括基片和基片上的探針，其特征在于所述探針由從人類染色體3p上選取的如表1所列的288個基因以及對照點探針組成。2.如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于所述對照點探針由如表2所列的37個看家基因，以及空白對照點組成。3.如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于所述探針均至少重復(fù)點樣兩次。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于多種腫瘤抑瘤基因檢測的cDNA芯片，該芯片的探針由從人類染色體3p上選取的288個基因以及對照點探針組成。利用該芯片能同時檢測到組織中和多種腫瘤密切相關(guān)的多個基因的表達水平的變化，從而便于開展腫瘤多基因表達的動態(tài)研究，篩選出腫瘤遺傳易感基因；它簡化了基因表達檢測的過程，節(jié)約了實驗時間和實驗成本。與全基因組表達譜芯片相比，它針對性更強，縮小了腫瘤易感基因篩選的范圍，節(jié)省了大量的人力、財力和物力。文檔編號C12Q1/68GK101245386SQ20081003091公開日2008年8月20日申請日期2008年3月26日優(yōu)先權(quán)日2008年3月26日發(fā)明者周艷宏,張文玲,曾朝陽,李小玲,李桂源,煒熊,羅曉敏,嵐肖申請人:中南大學(xué)