專利名稱：：利用銨離子調(diào)控林可霉素發(fā)酵過程及提高林可霉素產(chǎn)量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種優(yōu)化的林可霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
：林可霉素(Lincomycin)屬林可胺類抗生素，林可鏈霉菌(5Yre;z^歷7ce51"/7C0^7e7^A，5".7i/cW/7e/L5i5)生產(chǎn)林可霉素的發(fā)酵過程非常復(fù)雜，其生物合成路線目前尚不清楚，僅有文獻報道過推測的途徑。目前，僅有在搖瓶規(guī)模上關(guān)于林可霉素發(fā)酵過程影響因素的研究，但由于混合和取樣等方面的限制，使得搖瓶發(fā)酵既不能充分發(fā)揮林可鏈霉菌的生產(chǎn)潛力，又不能及時反饋發(fā)酵過程的動態(tài)調(diào)節(jié)信息。而目前還沒有在較大規(guī)模的生物反應(yīng)器中對林可霉素發(fā)酵的影響因素進行研究的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種優(yōu)化的林可霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種利用林可鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素的方法，所述方法包括(1)調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57土5mmol/L，在適宜條件下培養(yǎng)林可鏈霉菌；(2)當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為0.2-1.5mmol/L時，補加銨離子，之后控制發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度2-5mmol/L至發(fā)酵結(jié)束。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為0.5-lmmol/L時，補加銨離子。在另一優(yōu)選例中，調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57土3mraol/L;更優(yōu)選的是57土2誦ol/L;最優(yōu)選的是57±lmmol/L。在另一優(yōu)選例中，補加銨離子之后控制發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為3-4tnmol/L。在另一優(yōu)選例中，在步驟(2)中，通過補加硫酸氨來調(diào)節(jié)銨離子濃度。在另一優(yōu)選例中，調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57±lmmol/L;優(yōu)選的是57±0.5mmol/L;在培養(yǎng)第20-24小時，當(dāng)氨基氮[NH2-N]《0.35g/L時，補加硫酸銨1.067g/L培養(yǎng)基；在培養(yǎng)第2440小時，當(dāng)氨基氮《0.55g/L時，補加硫酸銨0.8g/L培養(yǎng)基；在培養(yǎng)第40140小時，當(dāng)氨基氮《0.55g/L時，補加硫酸銨0.533g/Li肯養(yǎng)基；在培養(yǎng)第140小時放罐，當(dāng)氨基氮《0.55g/L時，補加硫酸銨0.267g/L培養(yǎng)基。在另一優(yōu)選例中，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中硝酸銨為2±0.2g/L，硫酸銨3±0.2g/L。優(yōu)選的，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中硝酸銨為2±0.lg/L，硫酸銨3±0.lg/L;更優(yōu)選的，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中硝酸銨為2±0.05g/L，硫酸銨3±0.05g/L。在另一優(yōu)選例中，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中含有以下成分淀粉6土lg/L，葡萄糖47士5g/L，黃豆餅粉28土3g/L，玉米漿12土lg/L，氯化鈉5土0.5g/L，硝酸鈉6±0.5g/L，磷酸二氫鉀0.3±0.03g/L，碳酸鈣8±0.8g/L，硝酸銨2±0.2g/Lg/L，硫酸銨3±0.2g/L。優(yōu)選的，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中含有淀粉6±0.5g/L，葡萄糖47±2.5g/L，黃豆餅粉28±1.5g/L，玉米漿12±0.5g/L，氯化鈉5±0.25g/L，硝酸鈉6±0.25g/L，磷酸二氫鉀0.3±0.015g/L，碳酸鈣8±0.4g/L,硝酸銨2±0.lg/Lg/L，硫酸銨3±0.lg/L。在另一優(yōu)選例中，在發(fā)酵過程中還補加葡萄糖和玉米漿。優(yōu)選的，在采用初始的發(fā)酵培養(yǎng)基進行培養(yǎng)后，當(dāng)測定出還原糖含量在5g/L培養(yǎng)基以下時開始補糖，20-40小時，按20±2g/L-h補加葡萄糖；40-140小時，按10土lg/L'h補加葡萄糖;140-結(jié)束，按5土0.5g/L'h補加葡萄糖。優(yōu)選的，在發(fā)酵起始后80-168小時補玉米漿，補加速率為0.2g/Lh。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟(3)從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離林可霉素。在另一優(yōu)選例中，發(fā)酵培養(yǎng)基中每分鐘空氣的通氣量是1.4±0.3L/L;優(yōu)選1.4±0.2L/L;更優(yōu)選1.4±0,1L/L。在另一優(yōu)選例中，發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度是30±2°C;優(yōu)選30士rC;更優(yōu)選30士0.5°C。在另一優(yōu)選例中，培養(yǎng)的時間是150-200小時。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖1顯示了不同培養(yǎng)方式下林可鏈霉菌發(fā)酵液中銨離子的含量變化。圖2顯示了不同培養(yǎng)方式下第1次補糖前發(fā)酵液總糖含量的變化。圖3顯示了不同培養(yǎng)方式下林可鏈霉菌菌濃(DCW)與生物效價變化圖。圖4顯示了不同培養(yǎng)方式下前50h發(fā)酵液的在線攝氧率(0UR)變化圖。具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究和試驗，首次在較大規(guī)模水平上研究了林可鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素的影響因素，總結(jié)出了一種優(yōu)化的林可霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法。利用本發(fā)明的方法可使得林可鏈霉菌生長良好，林可霉素的產(chǎn)量大大提高，生物效價達到7000U/ml以上。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，銨離子(NH4+)作為一種微生物易利用的氮源，在林可鏈霉菌的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素過程中是影響產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。并且，在發(fā)酵的不同時間段銨離子的添加方法和加入量是影響發(fā)酵過程至關(guān)重要的因素。也即并非在整個過程中始終控制相同的銨離子濃度才能獲得良好的效果。因此，本發(fā)明提供一種利用林可鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素的方法，所述方法包括(1)調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57±5mmol/L，在適宜的條件下培養(yǎng)林可鏈霉菌；(2)當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為O.2-1.5mmol/L時，補加銨離子，之后控制發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度2-5mmol/L至發(fā)酵結(jié)束。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，林可鏈霉菌氨同化銨離子主要經(jīng)丙氨酸脫氫酶(ADH)途徑和谷氨酰胺合成酶(GS)/谷氨酸合酶途徑，在發(fā)酵開始的一段時間(約14h)，ADH保持較高的酶活力，而GS的酶活力較小，主要依靠ADH對銨離子進行同化，此期間，菌濃(DCW)迅速增加，林可霉素的合成受抑制，在隨后的發(fā)酵過程中，應(yīng)將銨離子限制在較低濃度狀態(tài)，此時ADH的酶活力受抑制，而GS的酶活力較高，利于林可霉素的合成。若基礎(chǔ)培養(yǎng)基中銨離子含量過高或發(fā)酵過程中銨離子補入速率太大，則會抑制蛋白水解酶及淀粉水解酶的活性，并抑制GS的活性。發(fā)酵前期，在發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度降低到0.2-1.5mmol/L并補加銨離子后，林可霉素效價可較快升高，原因在于補銨離子前菌體將銨離子消耗至較低濃度，解除了高濃度的銨離子對GS的抑制作用，而GS是菌體合成抗生素時參與細胞成分如細胞壁、蛋白質(zhì)、酶和輔酶的維持代謝的關(guān)鍵酶，它的酶活力大小與林可霉素的產(chǎn)量呈正相關(guān)；補加銨離子之后，將發(fā)酵液中的銨離子濃度控制在25mmol/L范圍內(nèi)，可使GS的酶活力穩(wěn)定在較高水平；而如果補入銨離子量過多，GS的活性則將被高濃度的銨離子抑制。同時，銨離子被同化后發(fā)酵液中將生成氫離子(H+)，使pH降低，在低pH值條件下，糖代謝酶的活性可能會受到抑制，因而需要控制銨離子的加入量。當(dāng)加入銨離子過少時，由于銨離子濃度太低，GS對銨離子同化生成谷氨酰胺的速率較小，而谷氨酰胺是細胞壁、蛋白質(zhì)和酶等合成的首選供體，從而導(dǎo)致林可鏈霉菌生產(chǎn)遲緩及林可霉素的產(chǎn)量降低。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為0.5-lmmol/L時，補加銨離子。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，補加銨離子之后控制發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為3-4mmol/L。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57±3mmol/L;更優(yōu)選的是57±2mmol/L;最優(yōu)選的是57±lmmol/L。本發(fā)明的方法中，可以選擇合適的無機氮源作為銨離子的供體。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的銨離子來源于硫酸銨和硝酸氨。優(yōu)選的，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中硝酸銨為2±0.2g/L，硫酸銨3土0.2g/L;更優(yōu)選的，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中硝酸銨為2±0.lg/L,硫酸銨3±0.lg/L;進一步優(yōu)選的，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中硝酸銨為2士0.05g/L，硫酸銨3±0.05g/L。在一個優(yōu)選的實施方案中，在后續(xù)的培養(yǎng)過程中，不補加硝酸氨而僅通過補加硫酸氨來調(diào)節(jié)銨離子濃度。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述方法是調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57±lmmol/L(優(yōu)選的是57±0.5誦ol/L);在培養(yǎng)第20-24小時，當(dāng)[跳-N]《0.35g/L時，硫酸銨補加量為1.067g/L;在培養(yǎng)第2440小時，當(dāng)NH2-N]《0.55g/L時，硫酸銨補加量為0.8g/L;在培養(yǎng)第40140小時，當(dāng)[NH廠N]《0.55g/L時，硫酸銨補加量0.533g/L;在培養(yǎng)第140小時放罐，當(dāng)[NH2-N]《0.55g/L時，硫酸銨補加量O.267g/L。在發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，還可包括步驟從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離林可霉素。從培養(yǎng)產(chǎn)物中分離或純化林可霉素可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。例如可采用硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose離子交換、UltrogelAcA34凝膠過濾三步法純化；或采用Ni-IDA親和層析一步法純化。用于配制發(fā)酵培養(yǎng)基的其它原料(如碳源、磷源、有機氮源、無機鹽、微量元素)及其使用量均可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)用于發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素的原料及使用量而定。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中含有以下成分淀粉6±lg/L，葡萄糖47±5g/L，黃豆餅粉28±3g/L，玉米漿12±lg/L，氯化鈉5±0.5g/L，硝酸鈉6±0.5g/L，磷酸二氫鉀O.3±0.03g/L，碳酸鈣8±0.8g/L，硝酸銨2士0.2g/Lg/L，硫酸銨3土0.2g/L;在發(fā)酵過程中，當(dāng)測定出還原糖含量在5g/L培養(yǎng)基以下時開始補糖，20-40小時，按20士2g/L'h補加葡萄糖；40-140小時，按10土lg/L'h補加葡萄糖;140-結(jié)束，按5±0.5g/L'h補加葡萄糖；在發(fā)酵起始后80-168小時補玉米漿，補加速率為0.2g/Lh。培養(yǎng)林可鏈霉菌的其它條件，如溫度、濕度、通氣量等，可采用本領(lǐng)域已知的條件。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，發(fā)酵培養(yǎng)基中空氣的通氣量是1.4土0.3L/L培養(yǎng)基；優(yōu)選1.4±0.2L/L;更優(yōu)選1.4±0.1L/L。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度是30土2。C;優(yōu)選30±1。C;更優(yōu)選30土0.5°C。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，培養(yǎng)的時間是150-200小時。在本發(fā)明的實施例中，本發(fā)明人采用50L全自動控制發(fā)酵罐，以林可鏈霉菌L-427為生產(chǎn)菌發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素。在50L發(fā)酵罐中采用4種硫酸銨補料工藝發(fā)酵制備林可霉素。將林可霉素的發(fā)酵生產(chǎn)過程分為初期(024h)、前期(2440h)、中期(40140h)和后期(140h放罐)，通過多參數(shù)的采集與分析，從而找出了銨離子對林可霉素生物合成過程產(chǎn)生重要影響的規(guī)律。與采用小規(guī)模培養(yǎng)(如搖瓶培養(yǎng))方法來分析培養(yǎng)基各因素對發(fā)酵的影響相比，本發(fā)明更加準(zhǔn)確，更能夠反映現(xiàn)實發(fā)酵生產(chǎn)中的規(guī)律。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)首次在較大規(guī)模水平上研究了林可鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素的影響因素，總結(jié)出了一種優(yōu)化的林可霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，利用該方法可使得林可鏈霉菌生長良好，林可霉素的產(chǎn)量大大提高，生物效價達到7000U/ml以上，而現(xiàn)有技術(shù)中目前可達到的較好的生物效價僅為約3000U/ml。(2)本發(fā)明人揭示了不同時間段上添加銨離子的較佳方式，可操作性強，有利于指導(dǎo)實際生產(chǎn)。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。儀器與材料1.儀器與試劑FUS-50L多參數(shù)全自動控制發(fā)酵罐(上海國強生化工程裝備有限公司)。林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)。2.菌種與培養(yǎng)基林可f連毒菌(5Yrepz^/zyces^Vco7/7e/7W^)L—427禾口藤黃八疊球菌(5krci"a7〃t朋，CMCC(B)28001)均購自江西國藥有限責(zé)任公司。種子培養(yǎng)基(g/L):淀粉18.7，葡萄糖24.3，黃豆餅粉22.3，硝酸銨1.33，硫酸銨2，玉米漿26，碳酸鈣7，氯化鈉0.7，磷酸二氫鉀0.045，硝酸鈉0.85。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):淀粉6，葡萄糖47，黃豆餅粉28，玉米漿12,氯化鈉5，硝酸鈉6，磷酸二氫鉀0.3,碳酸鈣8，硝酸銨2，硫酸銨(F1罐7，F(xiàn)2、F3、F4罐均為3)，配料體積24L。在發(fā)酵過程中需要補加的原料為葡萄糖、硫酸銨和玉米槳。在采用初始的發(fā)酵培養(yǎng)基進行培養(yǎng)后，當(dāng)測定出還原糖含量在5g/L以下時開始補糖，20-40小時，按20g/L'h補加葡萄糖;40-140小時，按10g/L'h補加葡萄糖;140-結(jié)束，按5g/Ivh補加葡萄糖。在發(fā)酵起始后80-168小時補玉米漿，補加速率為O.2g/L'h。實施例150L發(fā)酵罐培養(yǎng)接種量20%;每分鐘通入單位體積(L)發(fā)酵液的空氣體積(VVM)為1.4L;攪拌轉(zhuǎn)速300550r/min;培養(yǎng)溫度30°C;罐壓0.05MPa;起始培養(yǎng)液體積30L;培養(yǎng)周期184h。測定方法細胞干重(DCW):吸取發(fā)酵液10ml，稱濕重，布氏漏斗抽濾，濕固形物水洗3次后80。C恒溫烘12h,稱重，計算DCW(g/L)。林可霉素效價中國藥典(2005版)二部管碟法。NH/含量利用苯酚-次氯酸鹽反應(yīng)測定銨離子[參見徐晨東等，利用苯酚-次氯酸鹽反應(yīng)測定銨離子方法的探討[J];無錫輕工大學(xué)學(xué)報食品與生物技術(shù)，1998，17(1):34-38]。氨基氮(NH2-N)含量甲醛氧化法[參見北京大學(xué)生物系生化教研室；生物化學(xué)實驗指導(dǎo)[M];北京高等教育出版社；1986:92-96]?？偺?TS)和還原糖(RS)含量斐林氏法[參見北京大學(xué)生物系生化教研室；生物化學(xué)實驗指導(dǎo)[M];北京高等教育出版社；1986:92-96]。實施例2NH4+對氮源代謝的動態(tài)影響本發(fā)明人確定了四種典型的補硫酸銨方案(表1)，以考察NH/對發(fā)酵過程的影響。為考察基礎(chǔ)培養(yǎng)基中NH/含量較高時發(fā)酵過程的變化，將F1罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基中硫酸銨的含量設(shè)為7g/L(相當(dāng)于103.139mmol/L);為考察發(fā)酵初期和前期補入硫酸銨的速率較高時發(fā)酵過程的動態(tài)變化，設(shè)計了F3罐補料工藝；為考察發(fā)酵初期和前期補入硫酸銨的速率較低時發(fā)酵過程的動態(tài)變化，設(shè)計了F4罐補料工藝。其中[NH2-N]起每隔2小時時間檢測一次。表l硫酸銨的補料工藝方案<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>NH4+對氮源代謝的動態(tài)影響發(fā)酵過程中，每一罐中NH/含量變化曲線分別如圖l所示。對Fl罐，0h時NH/和氨基氮含量分別為103.139mmol/L、0.19mg/ml，全程未補加硫酸銨，NH/和氨基氮含量分別在25mmol/L和110mg/100ml以上，全程消耗硫酸銨5.318g/L(40h后的消耗量約0.669g/L)，未消耗的硫酸銨為0.283g/L。對F2罐，20h時NH/和氨基氮含量分別降為0.823mmol/L、30.8mg/100ml，隨后第一次補入硫酸銨；24184h，最低麗4+濃度(每次補硫酸銨之前的測定值)約為3.04.O畫ol/L，全程消耗硫酸銨14.936g/L(40h后的消耗量約10.134g/L)。對F3罐，16h時NH/和氨基氮含量分別為3.676mmol/L、50.7mg/100ml，隨后第一次補入硫酸銨；40h后未補加硫酸銨，但全程的NH/濃度均在19.5mmol/L以上，氨基氮含量在94mg/100ml以上；全程消耗硫酸銨9.403g/L(40h后的消耗量約0.447g/L)，未消耗的硫酸銨為1.541g/L。對F4罐，16h時NH4+和氨基氮含量分別為3.836mmol/L、51.8mg/100ml，隨后第一次補入硫酸銨，最低NH/濃度在40h時降為0.543mmol/L;40h以后，最低NH/濃度基本在1.502.50mmol/L的范圍內(nèi)；全程消耗硫酸銨10.116g/L(40h后的消耗量約6.108g/L)。與F2罐相比，F(xiàn)l和F3罐NH/含量很高，而消耗硫酸銨的總量卻比F2罐少，說明高濃度的NH4+可抑制林可鏈霉菌對NH/的利用；F3罐40h后未補加硫酸銨，但消耗硫酸銨的量極少，進一步說明發(fā)酵前期產(chǎn)生的NH/阻遏效應(yīng)很難解除，會降低后續(xù)發(fā)酵過程中菌體消耗氮源的能力。另外，40h前F2罐硫酸銨的消耗量比F4罐的僅多0.794g/L，但40h后F2罐的消耗量比F4罐的多4.026g/L，前者的干重也較后者平均多2g/L左右(圖4)，NH/的這種調(diào)節(jié)作用類似信號的放大作用，此處簡稱"NH4+放大效應(yīng)"。綜上，第一次補硫酸銨以前，待發(fā)酵液中的順4+消耗至很低濃度(<1.0mmol/L，如F2罐)后，林可鏈霉菌對NH/的消耗速率和消耗量增大，說明低濃度的NH/促進了催化銨同化的酶的大量合成；發(fā)酵初期和前期補入硫酸銨的平均速率過大或偏小(本工藝以F2罐的為最佳)時均會導(dǎo)致后續(xù)發(fā)酵過程的"NH/放大效應(yīng)"。實施例3冊4+對糖代謝的動態(tài)影響根據(jù)測定，0h時，4罐培養(yǎng)液的總糖含量分別為6.3、6.52、6.32和6.78g/100ml。16h前F2、F3和F4罐的總糖消耗速率變化基本相當(dāng)，16h后按表l補加硫酸銨F3和F4罐均在16h開始第一次補硫酸銨，前者補硫酸銨的速率較后者的大，導(dǎo)致前者的總糖消耗速率比后者的大；F2罐在20h才開始補入硫酸銨，1620h，其NH/濃度比F3和F4罐的低，總糖消耗速率也較低(圖2)，說明NH4+濃度與葡萄糖降解酶的酶活力正相關(guān)。對F1罐，總糖消耗速率最慢，在44h時總糖含量降至16.7g/L，由于起始培養(yǎng)基中含47g/L的葡萄糖，僅含6g/L的淀粉，說明過高濃度的NH4+會抑制葡萄糖降解酶的酶活力。因此，在一定濃度范圍內(nèi)，增大NH/的供給速率可提高葡萄糖降解酶的活性；當(dāng)NH/的濃度過高時(如F1罐，〉25mmol/L)，葡萄糖降解酶的酶活力會受到抑制。補葡萄糖后的影響整個發(fā)酵過程中Fl罐的最低NH/濃度為25.3mmol/L，葡萄糖的降解速率均很低，說明NH/濃度持續(xù)在25mmol/L以上時會抑制葡萄糖降解酶的酶活力。對F2罐，24h時第一次補入葡萄糖，2428h平均耗糖速率為2.0g/(h'L)[或0.0499g'(h'g干重)—']，24h補加硫酸銨后NH/的最高瞬時濃度為12.5mmol/L，此后，平均耗糖速率逐漸降低，但降幅較小。對F3罐，19h時第一次補入葡萄糖，1925h，平均耗糖速率為2.15g/(h'L)[或0.05g'(h'g干重)—J，較F2罐的高，而在19h和22h兩次補硫酸銨后NH/的最高瞬時濃度分別為19.lmmol/L禾P19.9mmol/L，說明NH/的最高瞬時濃度約為19.0mmol/L時葡萄糖降解酶的酶活力較最高瞬時濃度為12.5mmol/L時的高；2528h平均耗糖速率為1.644g/0rL)，較第一時段下降0.467g/0vL)[F2罐第二時段相對第一時段下降0.222g/0vL)]，說明F3罐由于補入硫酸銨速率過快而抑制了葡萄糖降解酶在此時段的酶活力，即當(dāng)NH/濃度達到20.927mmol/L(2528h的最高瞬時濃度)時葡萄糖降解酶的活性會受到抑制；31h后，平均耗糖速率下降很快，進一步說明過高濃度的NH/會對葡萄糖降解酶產(chǎn)生明顯的抑制作用。鑒于此，可取19.0腿ol/L作為NH4+抑制葡萄糖降解酶的濃度臨界點。因此，發(fā)酵初期(從第l次補硫酸銨開始)和前期抑制葡萄糖降解酶活性的NH/濃度臨界點為19.0圓ol/L，即臨界值以下，NH/濃度與葡萄糖降解酶的活力呈正相關(guān)。實施例4對次級代謝的動態(tài)影響林可鏈霉菌進行旺盛的次級代謝主要需具備兩方面的條件具有較高的生物量積累及合適的環(huán)境條件；林可霉素合成酶的量很大且活性很高。由圖3可見，40h后，F(xiàn)l罐的菌濃(DCW)最低，F(xiàn)2罐的DCW最高最穩(wěn)定，維持在43.5g/L左右；F4罐的DCW維持在41.4g/L左右；而F3罐的DCW呈下降趨勢。Fl、F2、F3和F4罐發(fā)酵液在24h時的生物效價分別為0、376、145和259u/ml，在40h時分別為286、1223、598和834u/ral，F(xiàn)2罐起步效價最高，2440h其生物效價的漲幅也最大，說明F2罐在發(fā)酵初期林可霉素合成途徑中的一些關(guān)鍵調(diào)控酶(統(tǒng)稱林可霉素合成酶)可能被大量誘導(dǎo)或激活，并且一經(jīng)合成后就不受NH4+抑制或所受抑制作用很??；16h前，F(xiàn)2與F4罐各項參數(shù)變化很接近，16h時F4罐以很小的速率補入硫酸銨，而F2罐是在NH/消耗至1.Ommol/L以下(20h)才補入硫酸銨，1620h，F(xiàn)2罐的NH/濃度變化范圍為3.00.8mmol/L，F(xiàn)l罐的為3.12.5mmol/L，這說明NH/濃度在2.5mmol/L以下有利于林可霉素合成酶的大量合成。F2罐全程的補硫酸銨速率比F4罐的大，前160h，每24h林可霉素效價的漲幅均在1000u/ml以上，但F4罐在前88h林可霉素效價漲幅僅在600u/ml左右，以后每24h的漲幅約為800u/ml左右，進一步說明發(fā)酵初期林可霉素合成酶一經(jīng)合成后即不受NH/濃度的影響。Fl和F3罐的起步效價低說明高濃度的NH/會抑制林可霉素合成酶的合成；二者的DCW逐漸降低，顯微鏡下可觀察到菌絲提前斷裂及自溶，說明高濃度的NH/抑制了糖代謝酶及氮源代謝酶的活性，使得林可鏈霉菌的初級代謝強度變得很弱，次級代謝水平低。因此，第一次補硫酸銨以前，待NH/消耗至很低的濃度(〈1.0mmol/L)，有利于林可霉素合成酶的大量合成，該酶合成后可能不受NH/濃度(〈19.0mmol/L)的影響；限制硫酸銨的補入速率，使發(fā)酵液保持穩(wěn)定的NH/濃度壓力(最低濃度范圍為3.04.Ommol/L)，可使林可鏈霉菌的維持代謝和次級代謝保持較高水平。實施例5前50h的攝氧率(OUR)曲線與菌絲形態(tài)變化分析菌體的OUR受多種因素的影響，如罐壓、空氣流量、轉(zhuǎn)速、營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和環(huán)境條件等，OUR的變化與菌絲形態(tài)的變化也有密切的關(guān)聯(lián)性。Fl、F2、F3和F4罐的在線0UR曲線如圖4所示。與其它3罐相比，F(xiàn)1罐的0UR水平最低；對F2、F3和F4罐，前16h三者的OUR曲線變化趨勢基本一致，16h后則有了差異F2罐的0UR曲線較平穩(wěn)，24h后雖然呈下降趨勢，但與其它罐相比，基本保持在最高水平(發(fā)酵旺盛期40140h)2030mmol/(L'h)內(nèi)(50h后數(shù)據(jù)未列出);F3罐的OUR在25h前較高，此后緩慢下降，31h后降幅明顯增大；F4罐的0UR也較穩(wěn)定，但比F2罐的低。就菌絲特征而言，F(xiàn)2、F3和F4罐的菌絲在16h時均開始出現(xiàn)原生質(zhì)收縮現(xiàn)象，1620h，對F2罐，該現(xiàn)象逐漸消失，發(fā)酵液密度增大，菌絲長而舒展；對F3罐，該現(xiàn)象很快消失，但發(fā)酵液密度減小，菌絲出現(xiàn)膨脹現(xiàn)象；對F4罐，該現(xiàn)象一直存在。發(fā)酵前期和后續(xù)發(fā)酵過程中，F(xiàn)2罐的菌絲形態(tài)穩(wěn)定；而F3罐在31h以后斷裂的菌絲段明顯增多；40h前F4罐的菌絲逐漸變得較細而短，40h以后，菌絲隨著硫酸銨補料量的增加逐漸變得較長較粗，0UR與F2罐靠近；Fl罐從20h開始即有許多斷裂的菌絲段。因此，NH/供給速率過高可導(dǎo)致菌絲膨脹；第一次補硫酸銨以前，待林可鏈霉菌將NH/消耗至很低濃度(〈1.0mmol/L)，可使遲效碳、氮源得到充分利用(原生質(zhì)收縮現(xiàn)象逐漸消失)；在林可霉素生產(chǎn)旺盛期(40140h)應(yīng)全面調(diào)控，使OUR保持在2030mmol/(L'h)的范圍內(nèi)。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種利用林可鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素的方法，其特征在于，所述方法包括(1)調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57±5mmol/L，在適宜條件下培養(yǎng)林可鏈霉菌；(2)當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為0.2-1.5mmol/L時，補加銨離子，之后控制發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度2-5mmol/L至發(fā)酵結(jié)束。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為0.5-l,ol/L時，補加銨離子。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57±3mmol/L。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，補加銨離子之后控制發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為3-4mmol/L。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的銨離子來源于硫酸銨和硝酸氨。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57士lmmol/L;在培養(yǎng)第20-24小時，當(dāng)氨基氮[NH2-N]《0.35g/L時，補加硫酸銨1.067g/L;在培養(yǎng)第2440小時，當(dāng)氨基氮《0.55g/L時，補加硫酸銨0.8g/L;在培養(yǎng)第40140小時，當(dāng)氨基氮《0.55g/L時，補加硫酸銨0.533g/L;在培養(yǎng)第140小時放罐，當(dāng)氨基氮《0.55g/L時，補加硫酸銨0.267g/L。7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中硝酸銨為2±0.2g/L，硫酸銨3±0.2g/L。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中含有以下成分淀粉6士lg/L，葡萄糖47士5g/L，黃豆餅粉28土3g/L,玉米漿12士lg/L，氯化鈉5±0.5g/L，硝酸鈉6士0.5g/L，磷酸二氫鉀0.3±0.03g/L，碳酸鈣8±0.8g/L，硝酸銨2土0.2g/Lg/L，硫酸銨3±0.2g/L。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基中每分鐘空氣的通氣量是:1.4±0.3L/L。10.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度是30土2。C。全文摘要本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，公開了一種優(yōu)化的林可霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，所述方法包括調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57±5mmol/L，培養(yǎng)林可鏈霉菌；當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為0.2-1.5mmol/L時，補加銨離子，之后控制發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度2-5mmol/L至發(fā)酵結(jié)束。本發(fā)明人首次在較大規(guī)模水平上研究了林可鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素的影響因素，總結(jié)出了優(yōu)化的林可霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，利用該方法可使得林可霉素的產(chǎn)量大大提高。文檔編號C12P17/16GK101220385SQ20081003295公開日2008年7月16日申請日期2008年1月23日優(yōu)先權(quán)日2008年1月23日發(fā)明者炬儲,夏建業(yè),莊英萍,張嗣良,嘯李,杭海峰,王永紅,郭美錦申請人:華東理工大學(xué)