專利名稱：：檢測(cè)藥物防癌效果的非損傷性分子方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是一種藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
的檢測(cè)方法，具體是一種用腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變作為檢測(cè)藥物防癌效果的非損傷性分子方法。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是引起臨床死亡的重要原因之一。結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率居第三位的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類健康。結(jié)腸癌的高危因素主要是高脂、高蛋白、低纖維飲食、超重、吸煙與運(yùn)動(dòng)量低等。近年來，隨著生活水平提高，我國結(jié)腸癌的發(fā)病率在逐年增加。有效的藥物預(yù)防結(jié)腸癌的方法可以降低結(jié)腸癌的發(fā)病率。開發(fā)簡(jiǎn)單、高效的檢測(cè)藥物防癌效果的方法具有重要意義。目前，檢測(cè)臨床藥物防癌效果的方法為流行病學(xué)方法，給受試人群服用可能的藥物防癌劑，對(duì)受試人群進(jìn)行10-20年的追蹤觀察，和未用藥物防癌劑的人群相比，以腫瘤發(fā)生率的下降作為評(píng)判藥物防癌效果的指標(biāo)。這種方法耗時(shí)、耗力且涉及到倫理學(xué)問題，不能用于對(duì)未知藥物防癌效果的篩查。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Shimizu等在《CancerLett》(《癌快報(bào)》)(2006年第1期第135-142頁)上發(fā)表"Dietaryart印illinCsuppressestheformationofaberrantcryptfociinducedbyazoxymethaneinmousecolon"(阿替匹林對(duì)氧化偶氮甲垸誘導(dǎo)鼠異常隱窩病灶的抑制作用)，該文中提出，異常隱窩病灶(aberrantcryptfoci，ACF)是人與嚙齒類動(dòng)物目前能觀察到的最早的結(jié)腸癌癌前病變?；瘜W(xué)致癌劑A0M(氧化偶氮甲烷)、DMH(二甲肼)等可以誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生異常隱窩病灶，對(duì)化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)的大鼠給予藥物防癌劑，其異常隱窩病灶的減少可以作為檢測(cè)藥物防癌效果的指標(biāo)，該模型目前已被廣泛應(yīng)用于對(duì)結(jié)腸癌藥物防癌效果的檢測(cè)。該方法的缺陷在于為了檢測(cè)藥物防癌效果，必須處死、解剖動(dòng)物取出動(dòng)物全結(jié)腸，亞甲藍(lán)染色，顯微鏡下觀察藥物防癌劑處理的動(dòng)物異常隱窩病灶數(shù)量的下降，是一種嚴(yán)重?fù)p傷性的檢測(cè)方法。無侵入性且費(fèi)用小的檢測(cè)藥物防癌效果的方法是目前藥物研發(fā)領(lǐng)域迫切需要的。動(dòng)物腸道內(nèi)共生著種類約一千種，數(shù)量在10"左右的微生物，它們的組成與動(dòng)物的生理狀態(tài)以及疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。糞便菌群結(jié)構(gòu)可以反映腸道菌群結(jié)構(gòu)。Moore等人在《ApplEnvironMicrobiol》(《應(yīng)用環(huán)境微生物》)(1995年第湖第3202-3207頁)上發(fā)表的"Intestinalflorasofpopulationsthathaveahighriskofcoloncancer"(結(jié)腸癌高危人群的腸道菌群)中提出，采用培養(yǎng)的方法對(duì)結(jié)腸癌高危人群與健康個(gè)體的腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌高危人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)與健康個(gè)體的腸道菌群結(jié)構(gòu)具有明顯差異。提示，對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)改變的監(jiān)測(cè)具有作為檢測(cè)藥物防癌效果的潛能。但由于腸道微生物群落包含復(fù)雜的微生物組成，其中很多都是不可培養(yǎng)的微生物，單純用培養(yǎng)的方法會(huì)喪失不可培養(yǎng)的微生物的信息。為了克服培養(yǎng)方法的缺陷，研究腸道微生物群落可以通過分子生態(tài)學(xué)的方法解析群落基因組(也稱為元基因組)，以獲得該群落的結(jié)構(gòu)與功能的信息。具體為提取糞便微生物基因組DNA，用分子生態(tài)學(xué)的方法研究糞便微生物組成。目前用于研究微生物群落結(jié)構(gòu)特征的分子生態(tài)學(xué)方法包括PCR-DGGE/TGGE(變性梯度凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳)指紋圖譜技術(shù)，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)等。用分子生態(tài)學(xué)方法研究健康動(dòng)物、結(jié)腸癌前病變動(dòng)物與藥物防癌劑干預(yù)動(dòng)物的腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變規(guī)律，為檢測(cè)結(jié)腸癌藥物防癌效果提供有效的非損傷性分子方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)藥物防癌效果的非損傷性分子方法。本發(fā)明應(yīng)用分子生態(tài)學(xué)技術(shù)如指紋圖譜技術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析方法，對(duì)癌前病變動(dòng)物、藥物防癌劑干預(yù)動(dòng)物與健康動(dòng)物的腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比分析，獲得與藥物防癌有效性相關(guān)的腸道菌群結(jié)構(gòu)信息，為對(duì)結(jié)腸癌的藥物防癌效果提供一種非損傷性的分子檢測(cè)方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，包括如下步驟(1)收集糞便樣本，并提取糞便微生物基因組總DNA;所述的糞便微生物基因組總DNA，具體為收集健康動(dòng)物、具有癌前病變動(dòng)物以及藥物防癌劑干預(yù)動(dòng)物的糞便樣本并提取這些糞便樣本的微生物基因組總DNA。(2)使用指紋圖譜分析技術(shù)如16SrDNAV3區(qū)PCR-TGGE/DGGE(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-溫度/變性梯度凝膠電泳)，對(duì)各組動(dòng)物腸道微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行平行比較；所述的16SrDNAV3區(qū)PCR-TGGE/DGGE，具體為擴(kuò)增糞便樣本微生物基因組總DNA的16SrDNAV3區(qū)，并通過TGGE/DGGE技術(shù)分析比較健康動(dòng)物、具有癌前病變動(dòng)物以及藥物防癌劑干預(yù)動(dòng)物的糞便樣本微生物群落結(jié)構(gòu)的差別。(3)對(duì)指紋圖譜進(jìn)行主成分分析，偏最小二乘判別分析，尋找與藥物防癌有效性相關(guān)的重要指紋譜帶；所述的對(duì)指紋圖譜進(jìn)行主成分分析，偏最小二乘判別分析，具體為使用軟件MATLAB7.0版本對(duì)TGGE/DGGE數(shù)據(jù)做主成分分析，偏最小二乘判別分析，比較健康動(dòng)物、具有癌前病變動(dòng)物以及藥物防癌劑干預(yù)動(dòng)物的糞便樣本微生物群落結(jié)構(gòu)指紋圖譜的差別。所述的尋找與檢測(cè)藥物防癌相關(guān)的重要指紋譜帶，具體為找到在健康動(dòng)物與具有癌前病變動(dòng)物之間有穩(wěn)定差異、并且在藥物防癌有效組動(dòng)物中向健康動(dòng)物水平恢復(fù)的條帶，即為藥物防癌有效性相關(guān)的重要指紋譜帶。(4)對(duì)重要指紋譜帶所代表的微生物進(jìn)行鑒定，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)針對(duì)這些微生物的種特異性引物和探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，對(duì)健康動(dòng)物、具有癌前病變動(dòng)物以及藥物防癌劑干預(yù)動(dòng)物間的這些重要微生物數(shù)量上的差異進(jìn)行比較，在健康動(dòng)物與藥物防癌有效組動(dòng)物中無區(qū)別，而均與癌前病變動(dòng)物具有差異的微生物為檢測(cè)藥物防癌效果的指示微生物。本發(fā)明應(yīng)用分子生態(tài)學(xué)方法如指紋圖譜技術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR等對(duì)健康動(dòng)物、具有癌前病變動(dòng)物以及藥物防癌劑干預(yù)動(dòng)物的糞便樣本微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行平行測(cè)定，結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)方法尋找與藥物防癌有效性相關(guān)的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)信息，為藥物防癌劑的篩選提供依據(jù)。本發(fā)明能克服現(xiàn)有判斷藥物防癌劑方法的不足，為檢測(cè)對(duì)結(jié)腸癌的藥物防癌效果提供一種非損傷性的分子方法。圖1二甲肼誘發(fā)結(jié)腸癌癌前病變組大鼠與健康對(duì)照組大鼠在實(shí)驗(yàn)第9周16SrDNAV3區(qū)PCR-DGGE圖譜。圖2二甲肼誘發(fā)結(jié)腸癌癌前病變組大鼠與健康對(duì)照組大鼠在實(shí)驗(yàn)第9周16SrDNAV3區(qū)PCR-DGGE圖譜的主成分分析得分圖。圖3二甲肼誘發(fā)結(jié)腸癌癌前病變組大鼠與健康對(duì)照組大鼠在實(shí)驗(yàn)第9周16SrDNAV3區(qū)PCR-DGGE圖譜的主成分分析載量圖。圖4二甲肼誘發(fā)結(jié)腸癌癌前病變組大鼠與健康對(duì)照組大鼠在實(shí)驗(yàn)第9周16SrDNAV3區(qū)PCR-DGGE圖譜的最小二乘判別分析載量圖。圖5二甲肼誘發(fā)結(jié)腸癌癌前病變組大鼠與黃連吳茱萸組大鼠在實(shí)驗(yàn)第9周16SrDNAV3區(qū)PCR-DGGE圖譜。圖6二甲肼誘發(fā)結(jié)腸癌癌前病變組大鼠與金復(fù)康組大鼠在實(shí)驗(yàn)第9周16SrDNAV3區(qū)PCR-DGGE圖譜。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例為對(duì)經(jīng)二種配伍的中藥干預(yù)，引起異常隱窩灶數(shù)量減少的大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，進(jìn)一步描述本發(fā)明。(1)動(dòng)物模型的構(gòu)建27只雄性Wistar大鼠(80100g)，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，詞養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。室內(nèi)溫度2025。C，相對(duì)濕度4070%，12小時(shí)循環(huán)照明。動(dòng)物在無底不銹鋼絲網(wǎng)籠中喂養(yǎng)。動(dòng)物日常護(hù)理及實(shí)驗(yàn)條件均符合《中華人民共和國衛(wèi)生部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)》。大鼠隨機(jī)分為4組健康對(duì)照組6只、結(jié)腸癌癌前病變模型組7只、黃連吳茱萸水提取物處理組7只、中藥成藥金復(fù)康處理組7只。動(dòng)物自購入起適應(yīng)1周后隨機(jī)分組，在第2周第1天，給健康對(duì)照組大鼠皮下注射等劑量的緩沖液(25mMEDTA+137mMNaCl)，給其余三組大鼠頸背部皮下注射DMH(二甲肼)(30mg/kg體重)。1周后各組按上述方法重復(fù)皮下注射1次。黃連吳茱萸水提取物處理組從初次DMH注射起開始灌胃劑量為生藥量各0.3g/kg體重的黃連吳茱萸水提取物(每日l次)，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；中藥成藥金復(fù)康處理組大鼠是從初次DMH注射起開始灌胃劑量為1.33ml/kg體重的金復(fù)康(每日1次)，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。動(dòng)物共飼養(yǎng)9周，實(shí)驗(yàn)第10周處死動(dòng)物，游離出全結(jié)腸，在10%中性甲醛溶液中固定過夜，然后浸于0.2%亞甲藍(lán)溶液中染色1020分鐘后在倒置顯微鏡(X40倍)下觀察ACF的數(shù)量(ACF數(shù)目/全結(jié)腸)。正常對(duì)照組大鼠未見明顯ACF，模型組平均每只大鼠形成(37.7±2.6)個(gè)ACF/全結(jié)腸，而黃連吳茱萸水提取物處理組平均每只大鼠形成(16.7土1.2)個(gè)/全結(jié)腸，成藥金復(fù)康處理組平均每只大鼠形成(15.1±2.9)個(gè)/全結(jié)腸。采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，Mann-Whitney檢驗(yàn)，黃連吳茱萸水提取物處理組與成藥金復(fù)康處理組均能顯著減低ACF數(shù)量(P《0.05)。(2)糞便樣本的收集以及糞便微生物基因組總DNA的提取收集四組動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)第9周的新鮮糞便樣本，凍存于-2(TC冰箱內(nèi)。糞便微生物基因組總DNA提取試劑盒法提取糞便微生物基因組總DNA。根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)結(jié)腸癌藥物防癌效果的的非損傷性分子方法，其特征是，所述的16SrDNAV3區(qū)PCR-TGGE/DGGE指紋圖譜，用其比較健康動(dòng)物、具有癌前病變動(dòng)物以及藥物防癌劑干預(yù)動(dòng)物的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)差異，25ul的16SrDNAV3區(qū)PCR體系包括25Pmol/L的引物P2和P3各0.5U1，其序列分別為5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'，5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3'，2.5mmol/L的dNTPs2ul，模板DNA20ng，rTaqDNA聚合酶0.625U以及配套1X反應(yīng)緩沖液(3)16SrDNAV3區(qū)的擴(kuò)增優(yōu)勢(shì)菌的擴(kuò)增，主要通過16SrDNAV3區(qū)來反映，擴(kuò)增所用的引物參考Muyzer等人的文獻(xiàn)報(bào)道，PCR擴(kuò)增體系為25ul的16SrDNAV3區(qū)PCR體系包括25Umol/L的引物P2和P3各0.5ii1，其序列分別為5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'，5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3',2.5誦1/L的dNTPs2li1，模板DNA20ng,rTaqDNA聚合酶0.625U以及配套1X反應(yīng)緩沖液。擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性4分鐘，然后進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C變性1分鐘，退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，前20個(gè)循環(huán)內(nèi)，退火溫度每?jī)蓚€(gè)循環(huán)降低l'C，從65°C逐漸降低到56°C，剩下的5個(gè)循環(huán)中退火溫度保持55°C，最后72°C延伸10分鐘。(4)16SrDNAV3區(qū)PCR-DGGE16SrDNAV3區(qū)PCR產(chǎn)物用于16SrDNAV3區(qū)的PCR-DGGE指紋圖譜分析。本實(shí)驗(yàn)使用Bio-Rad公司DcodeDGGE系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules,Calif.)。實(shí)驗(yàn)采用8%聚丙烯酰胺凝膠，電泳緩沖液為lXTris-醋酸鹽-EDTA(TAE)(pH8.4)。電泳在200V電壓、60。C條件下運(yùn)行240分鐘，電泳結(jié)束后用SYBRgreenI熒光染料(Amresco，Solon,Ohio.)染色。DNA通過UVI凝膠呈相系統(tǒng)(UVItec,Cambridge,UK)進(jìn)行分析。對(duì)于16SrDNAV3區(qū)的PCR-DGGE分析，所用的變性梯度范圍為26.5%-52%(100%變性劑對(duì)應(yīng)7M尿素和40%去離子甲酰胺)。(5)變性梯度凝膠電泳的分析應(yīng)用QuantityOnev4.4軟件(BI0-RAD，Hercules,CA)對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理，在檢測(cè)DGGE條帶之前去除背景，讀取每條條帶的亮度和遷移位置，計(jì)算每個(gè)樣本中每條條帶亮度占該樣本所有條帶亮度的比例，每只動(dòng)物TGGE/DGGE指紋圖譜可轉(zhuǎn)換為一組多維向量，不同的遷移位置代表不同的維度，而每條條帶亮度占該樣本所有條帶亮度的比例作為每一維度的數(shù)值，得到一個(gè)條帶位置與相對(duì)亮度的二維矩陣。(6)多變量統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)錯(cuò)誤！未找到引用源。)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主成分分析為了分析在實(shí)驗(yàn)第9周，6只健康對(duì)照組與6只模型組大鼠腸道優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是否存在差異，主成分分析被用于16SrDNAV3區(qū)PCR-DGGE圖譜(圖1)分析。主成分分析得分圖提示，實(shí)驗(yàn)第9周，2組動(dòng)物腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有明顯差異(圖2)。錯(cuò)誤！未找到引用源。)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的偏最小二乘法分析6只健康對(duì)照組與6只模型組大鼠分為兩組，根據(jù)是否具有癌前病變分為兩組，其中健康對(duì)照組特征值用O表示，模型組大鼠特征值用l表示，構(gòu)成Y變量集合，與第9周實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的16SrDNAV3區(qū)PCR-DGGE指紋圖譜數(shù)據(jù)一起構(gòu)建偏最小二乘判別法模型，確定癌前病變動(dòng)物與健康動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)的差別。模型組大鼠與健康對(duì)照組大鼠在實(shí)驗(yàn)第9周，腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有明顯差異。錯(cuò)誤！未找到引用源。)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主成分載量分析、偏最小二乘判別載量分析對(duì)癌前病變動(dòng)物與健康動(dòng)物的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行主成分載量分析與偏最小二乘判別載量分析，載量大的條帶即代表了癌前病變動(dòng)物與健康動(dòng)物的差異微生物種群。主成分與偏最小二乘判別的載量分析均提示2條條帶(條帶v3-22與v3-28)的載量〉0.4，是區(qū)分模型組大鼠與健康對(duì)照組大鼠優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要條帶(圖3、圖4)。與健康組大鼠相比，這2條條帶的亮度在模型組大鼠中明顯增高(圖l)。(7)尋找與檢測(cè)藥物防癌有效性相關(guān)的重要指紋譜帶找到在健康動(dòng)物與具有癌前病變動(dòng)物之間有穩(wěn)定差異，并且在藥物防癌有效組動(dòng)物中向健康動(dòng)物水平恢復(fù)的條帶，即為藥物防癌有效性相關(guān)的重要指紋譜帶。比較黃連吳茱萸水提取物處理組與模型組大鼠、成藥金復(fù)康處理組與模型組大鼠中這2條條帶的亮度差異，發(fā)現(xiàn)在黃連吳茱萸水提取物處理組與成藥金復(fù)康處理組中，這2條條帶含量均明顯下降(圖5、圖6)，與模型組有明顯差異，而與健康組差異不大，提示這2條條帶是具有檢測(cè)藥物防癌效果潛能的重要DGGE條帶。(8)與檢測(cè)藥物防癌效果相關(guān)的DGGE凝膠條帶序列分析對(duì)重要指紋譜帶所代表的微生物進(jìn)行分子鑒定，具體為將這些微生物的TGGE/DGGE條帶從TGGE/DGGE圖譜上回收出來，構(gòu)建含這些微生物片段的文庫，回對(duì)原TGGE/DGGE圖譜，將與原TGGE/DGGE圖譜i回收位置一致的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序分析，具體操作方法如下所述。用無菌手術(shù)刀片將前面分析獲得的DGGE膠上有作為檢測(cè)藥物防癌效果潛能的重要DGGE條帶割下，放置于1.5ml的Eppendorf管中。將膠條搗碎，加入100"1無菌雙蒸水，4°C放置16個(gè)小時(shí)。取適量(1-2ul)上清液作為模板用于PCR擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)體系和程序同上述的DGGE分析。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠純化、凝膠回收試劑盒純化后與載體(pGEM-Teasyvector)連接、轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5a中。驗(yàn)證轉(zhuǎn)入片段和測(cè)序轉(zhuǎn)入片段(上海英駿生物技術(shù)公司)，具體操作如下純化DNA:將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)產(chǎn)物片斷大小割取相應(yīng)位置的條帶，使用凝膠回收試劑盒(Axygen，USA)提取DNA，溶于100y1無菌雙蒸水，并測(cè)定樣品濃度。載體連接2X快速連接反應(yīng)緩沖液5ul,pGEM-TEasy克隆載體(Promega)(50ng/ul)1u1，PCR產(chǎn)物10-20ng，T4DNA連接酶(2Weiss單位/ul)1Ul，補(bǔ)足無菌雙蒸水至IOyl，混勻，4'C連接16h。轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞EscherichiacoliDH5a購自上海天根生化科技有限公司，經(jīng)試驗(yàn)其轉(zhuǎn)化效率為106。連接產(chǎn)物用熱休克法轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，菌體涂布在有X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-13-D-galactopyranoside，5-溴_4氯_3-B引哚-e-D-半乳糖苷)(80ug/ml)和IPTG(is叩ropy1-J3-D-thiogalactopyranoside，異丙基-P-D-硫代半乳糖苷)(1mM)，添加了氨節(jié)青霉素(100ug/ml)的LB(Luria-Bertani，LB)平板上,挑選白色菌落。驗(yàn)證以煮菌法快速提取DNA，具體為適量菌體加入30H1無菌雙蒸水，沸水浴10分鐘，冰上放置5分鐘，3000rpm離心10分鐘，1ul上清液作為模板用于PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件與反應(yīng)體系如前所訴，20ngPCR產(chǎn)物如前所訴行DGGE，將轉(zhuǎn)化子的PCR產(chǎn)物與原始割膠DGGE條帶位置進(jìn)行比對(duì)。測(cè)序分析位置正確的克隆，并用添加了終濃度為15%的甘油及氨芐青霉素(100ug/ml)的LB液體，一7(TC保存含測(cè)序分析片段的菌種。序列分析測(cè)序結(jié)果用BioEdit軟件去除載體序列，用RDP提供的軟件去除嵌合體序列，在GenBank(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)及RDP(http:〃rdp.cme.msu.edu)數(shù)據(jù)庫中比對(duì)分析，找到與其親緣關(guān)系最近的細(xì)菌。序列結(jié)果見表l。表1DGGE圖譜中可用于檢測(cè)化學(xué)防癌效果細(xì)菌的序列鑒定<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(9)DGGE圖譜中重要條帶的登錄號(hào)本實(shí)施例中所得的可用于檢測(cè)藥物防癌效果的細(xì)菌的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中的登錄號(hào)為EF062467-EF062468。(10)與檢測(cè)藥物防癌效果相關(guān)的細(xì)菌的定量檢測(cè)因?yàn)闂l帶V3-22與卵形瘤胃球菌(A/肌Vococc"so力e"ffl)有98%同源性，故用針對(duì)卵形瘤胃球菌的特異引物，對(duì)實(shí)驗(yàn)第9周的4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸道內(nèi)的卵形瘤胃球菌進(jìn)行定量PCR分析，引物序列為R0B3:5，-TGAGGAGACTGCCAGGGA-3，，R0B2:5'—CTCCTTCTTTGCAGTTAGGT-3，。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，通過梯度稀釋，從1.23X103到1.23X1Q9拷貝制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，25ul的熒光定量PCR體系包括引物各12.5pmol，dNTP各200ymol/L，模板DNA各20ng，rTaqDNA聚合酶1.5U以及配套1X反應(yīng)緩沖液，1XSYBRGreenI熒光染料(Amresco，Solon,0H,USA)。其擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性3分鐘，然后94°C變性30秒，59°C退火30秒，72°C延伸30秒，82°C10秒讀板，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)末收集熒光信號(hào)，最后72°C延伸5分鐘；反應(yīng)在熒光定量PCR儀里進(jìn)行(MJResearch)，每個(gè)樣本重復(fù)3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算實(shí)驗(yàn)第9周的四組動(dòng)物的腸道內(nèi)卵形瘤胃球菌含量。采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，單因素方差分析對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P《0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。卵形瘤胃球菌DNA在實(shí)驗(yàn)第9周癌前病變大鼠中的數(shù)量顯著高于健康對(duì)照組大鼠(p〈0.05)，黃連吳茱萸水提取物處理組與中藥成藥金復(fù)康處理組大鼠中的卵形瘤胃球菌的量顯著低于癌前病變組(p〈0.05)，而與健康對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。針對(duì)16SrDNAV3區(qū)PCR-DGGE圖譜中有作為檢測(cè)藥物防癌效果潛能的條帶V3-28序列，用PrimerExpress2.0軟件設(shè)計(jì)特異引物與TaqMan探針，在GenBank(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)及RDP(http:〃rdp.cme.msu.edu)數(shù)據(jù)庫中比對(duì)分析，驗(yàn)證引物特異性。引物序列為v328-FP:5'-GGCGAGGTACCATCMAACG_3'，v328-RP:5'-TCGGGTCGTMAGCTCTGTTG-3';TaqMan探針序列為5'FAM-TCATTTCCTCTTCCGTTCCTTTTT-TAMRA3'，其中探針5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)F扁(6-Carboxy-fluorescein，6-羧基-熒光素)，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA(6-Carboxy-tetramethylrhodamine，6-羧基-四甲基羅丹明)。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，通過梯度稀釋，從LOOXIOU1.00Xl(f拷貝制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，25ul的熒光定量PCR體系包括引物及TaqMan探針各12.5pmol，dNTP各200umol/L，模板DNA各20ng,rTaqDNA聚合酶1.75U以及配套1X反應(yīng)緩沖液。其擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性3分鐘，然后94'C變性30秒，59°C退火30秒，72'C延伸30秒，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)末收集熒光信號(hào)，最后72°C延伸5分鐘；反應(yīng)在熒光定量PCR儀里進(jìn)行(MJResearch)，每個(gè)樣本重復(fù)3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算實(shí)驗(yàn)第9周的4組動(dòng)物的腸道內(nèi)該菌含量。采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，單因素方差分析對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P《0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)第9周V3-28在癌前病變大鼠中的數(shù)量顯著高于健康對(duì)照組大鼠(p〈0.05)，黃連吳茱萸水提取物處理組與中藥成藥金復(fù)康處理組大鼠中的V3-28DNA的量顯著低于癌前病變組(p<0.05)，而與健康對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果提示，條帶V3-22與V3-28所代表的腸內(nèi)細(xì)菌在模型組中數(shù)量顯著增加，隨著藥物治療，結(jié)腸癌癌前病變數(shù)量的減少，這2條條帶的數(shù)量也隨著減低到健康組水平，對(duì)條帶V3-22與V3-28的監(jiān)控可以作為一種檢測(cè)藥物防癌效果的非損傷性分子方法。條帶V3-22對(duì)應(yīng)序列表中的序列1，V3-28對(duì)應(yīng)序列表中的序列2，根據(jù)V3-28設(shè)計(jì)的特異引物與探針分別對(duì)應(yīng)序列表中的序列3、4、5。本發(fā)明所涉及的基因序列表<110>上海交通大學(xué)〈120>檢測(cè)藥物防癌效果的非損傷性分子方法<160>5〈210>1〈211>170<212>腿〈213〉未知<220〉<221>,A〈222>(1)…(170)〈400>1cctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggggaaaccctgatgcagcgacgc60cgcgtgaaggaagaagtatctcggtatgtaaacttctatcagcagggaagatagtgacgg120tacctgactaagaagccccggctaactaaagtgccagcagccgcggtaat170〈210>2〈211〉194<212>DNA〈213>未知〈220〉<221>R腿<222〉(1)…(194)<400>1cctacgggaggcagcagtagggaattttcgtcaatgggcgcaagcctgaacgagcaatgc60cgcgtgagtgaggaaggccttcgggtcgta犯gctctgttgcgagggaaaaaggaacgga120agaggaaatgattccgttttgatggtacctcgccagaaagtcacggctaactacgtgcca180gcagccgcggtaat194〈210>3<211>20<212>DNA〈213〉未知〈220〉〈221>RRNA<222>(l)...(20)<400〉1ggcgaggtaccatcaaaacg20<210>4<211〉21<212>DNA<213>未知<220〉<221>RRNA<222>(l)...(21)<400>1tcgggtcgtaaagctctgttg21〈210〉5<211>24<212>DNA〈213〉未知〈220〉<221>RRNA〈222〉(1)…(24)〈400>1tcatttcctcttccgttccttttt2權(quán)利要求1、一種檢測(cè)結(jié)腸癌藥物防癌效果的非損傷性分子方法，其特征在于包括如下步驟(1)收集糞便樣本，并提取糞便微生物基因組總DNA收集健康動(dòng)物、具有癌前病變動(dòng)物以及藥物防癌劑干預(yù)動(dòng)物的糞便樣本并提取這些糞便樣本的微生物基因組總DNA；(2)使用指紋圖譜分析技術(shù)如16SrDNAV3區(qū)PCR-TGGE/DGGE對(duì)各組動(dòng)物腸道微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行平行比較擴(kuò)增糞便樣本微生物基因組總DNA的16SrDNAV3區(qū)，并通過TGGE/DGGE技術(shù)分析比較健康動(dòng)物、具有癌前病變動(dòng)物以及藥物防癌劑干預(yù)動(dòng)物的糞便樣本微生物群落結(jié)構(gòu)的差別。(3)對(duì)指紋圖譜進(jìn)行主成分分析，偏最小二乘判別分析，尋找與藥物防癌有效性相關(guān)的重要指紋譜帶；(4)對(duì)重要指紋譜帶所代表的微生物進(jìn)行鑒定，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)針對(duì)這些微生物的種特異性引物和探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，對(duì)健康動(dòng)物、具有癌前病變動(dòng)物以及藥物防癌劑干預(yù)動(dòng)物間的這些重要微生物數(shù)量上的差異進(jìn)行比較，在健康動(dòng)物與化學(xué)防癌有效組動(dòng)物中無區(qū)別，而均與癌前病變動(dòng)物具有差異的微生物為檢測(cè)藥物防癌效果的指示微生物。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)結(jié)腸癌藥物防癌效果的的非損傷性分子方法，其特征是，所述的16SrDNAV3區(qū)PCR-TGGE/DGGE指紋圖譜，用其比較健康動(dòng)物、具有癌前病變動(dòng)物以及藥物防癌劑干預(yù)動(dòng)物的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)差異，25的16SrDNAV3區(qū)PCR體系包括25Umol/L的引物P2和P3各0.5U1，其序列分別為5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'，5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3，，2.5ramol/L的dNTPs2ul，模板DNA20ng,rTaqDNA聚合酶0.625U以及配套IX反應(yīng)緩沖液。16SrDNAV3區(qū)PCR產(chǎn)物用于16SrDNAV3區(qū)的PCR-DGGE指紋圖譜分析。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)結(jié)腸癌藥物防癌效果的的非損傷性分子方法，其特征是，所述的16Sr函A'V3區(qū)PCR，其擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性4分鐘，然后進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C變性1分鐘，退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，前20個(gè)循環(huán)內(nèi)，退火溫度每?jī)蓚€(gè)循環(huán)降低1°C，從65°C逐漸降低到56°C，剩下的5個(gè)循環(huán)中退火溫度保持55'C，最后72°C延伸10分鐘。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)結(jié)腸癌藥物防癌效果的非損傷性分子方法，其特征是，每只動(dòng)物TGGE/DGGE指紋圖譜可轉(zhuǎn)換為一組多維向量，不同的遷移位置代表不同的維度，而每條條帶亮度占該樣本所有條帶亮度的比例作為每一維度的數(shù)值。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)結(jié)腸癌藥物防癌效果的非損傷性分子方法，其特征是，所述的對(duì)指紋圖譜進(jìn)行主成分分析，偏最小二乘判別分析，具體為使用軟件MATLAB7.0版本對(duì)TGGE/DGGE數(shù)據(jù)做主成分分析，偏最小二乘判別分析，比較健康動(dòng)物、具有癌前病變動(dòng)物以及藥物防癌劑干預(yù)動(dòng)物的糞便樣本微生物群落結(jié)構(gòu)指紋圖譜的差別。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)結(jié)腸癌藥物防癌效果的非損傷性分子方法，其特征是，對(duì)指紋圖譜進(jìn)行主成分分析，偏最小二乘判別分析，具體為癌前病變動(dòng)物與健康動(dòng)物，根據(jù)是否具有癌前病變分為兩組，其中健康對(duì)照組，特征值用0表示，癌前病變組特征值用l表示，構(gòu)成Y變量集合，與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的TGGE/DGGE指紋圖譜數(shù)據(jù)一起構(gòu)建偏最小二乘判別模型，確定癌前病變動(dòng)物與健康動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)的差別。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)結(jié)腸癌藥物防癌效果的的非損傷性分子方法，其特征是，對(duì)癌前病變動(dòng)物與健康動(dòng)物的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行主成分載量分析，偏最小二乘判別載量分析，載量大的條帶即代表了癌前病變動(dòng)物與健康動(dòng)物的差異微生物種群。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)結(jié)腸癌藥物防癌效果的非損傷性分子方法，其特征是，所述的尋找與檢測(cè)藥物防癌有效性相關(guān)的重要指紋譜帶，具體為找到在健康動(dòng)物與具有癌前病變動(dòng)物之間有穩(wěn)定差異，并且在藥物防癌有效組動(dòng)物中向健康動(dòng)物水平恢復(fù)的條帶，即為藥物防癌有效性相關(guān)的重要指紋譜帶。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)結(jié)腸癌藥物防癌效果的非損傷性分子方法，其特征是，所述的對(duì)重要指紋譜帶所代表的微生物進(jìn)行鑒定，具體為將這些微生物的TGGE/DGGE條帶從TGGE/DGGE圖譜上回收出來，構(gòu)建含這些微生物片段的文庫，回對(duì)原TGGE/DGGE圖譜，將與原TGGE/DGGE圖譜上回收位置一致的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序分析。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)結(jié)腸癌藥物防癌效果的非損傷性分子方法，其特征是，所述的根據(jù)其序列設(shè)計(jì)針對(duì)這些微生物的種特異性引物和探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，對(duì)健康動(dòng)物、具有癌前病變動(dòng)物以及藥物防癌劑干預(yù)動(dòng)物間的這些重要微生物數(shù)量上的差異進(jìn)行比較，具體為PrimerExpress2.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)重要微生物的特異引物與TaqMan探針，在GenBank及RDP數(shù)據(jù)庫中比對(duì)分析，驗(yàn)證引物特異性。針對(duì)卵形瘤胃球菌的特異引物序列為R0B3:5'-TGAGGAGACTGCCAGGGA-3'，R0B2:5，-CTCCTTCTTTGCAGTTAGGT-3'。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，通過10倍梯度稀釋，從1.23乂103到1.23X109拷貝制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，25ul的熒光定量PCR體系包括引物各12.5pmol，dNTP各200umol/L，模板麗A各20ng，rT叫DNA聚合酶1.5U以及配套1X反應(yīng)緩沖液，1XSYBRGreenI熒光染料；其擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性3分鐘，然后94°C變性30秒，59°C退火30秒，72°C延伸30秒，82°C10秒讀板，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)末收集熒光信號(hào)，最后72°C延伸5分鐘；反應(yīng)在熒光定量PCR儀里進(jìn)行，每個(gè)樣本重復(fù)3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算健康動(dòng)物、具有癌前病變動(dòng)物以及藥物防癌劑干預(yù)動(dòng)物的腸道內(nèi)卵形瘤胃球菌的含量，對(duì)三組動(dòng)物腸道內(nèi)卵形瘤胃球菌數(shù)量上的差異進(jìn)行比較；針對(duì)另一條重要條帶，條帶V3-28設(shè)計(jì)的引物序列為v328-FP:5'-GGCGAGGTACCATCAAAACG-3',v328-RP:5'-TCGGGTCGTAMGCTCTGTTG-3';TaqMan探針序列為5，F(xiàn)AM-TCATTTCCTCTTCCGTTCCTTTTT-TAMRA3，。25ul的熒光定量PCR體系包括引物及T叫Man探針各12.5pmol，dNTP各200umol/L,模板DNA各20ng，rT叫DNA聚合酶1.75U以及配套IX反應(yīng)緩沖液，其擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性3分鐘，然后94°C變性30秒，59t;退火30秒，72'C延伸30秒，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)末收集熒光信號(hào)，最后72°C延伸5分鐘；反應(yīng)在熒光定量PCR儀里進(jìn)行，每個(gè)樣本重復(fù)3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算健康動(dòng)物、具有癌前病變動(dòng)物以及藥物防癌劑干預(yù)動(dòng)物的腸道內(nèi)該菌含量，對(duì)三組動(dòng)物腸道內(nèi)該菌數(shù)量上的差異進(jìn)行比較。全文摘要本發(fā)明涉及一種藥物開發(fā)領(lǐng)域的檢測(cè)藥物防癌效果的非損傷性分子方法，步驟為(1)收集糞便樣本，并提取糞便微生物基因組總DNA；(2)使用指紋圖譜分析技術(shù)對(duì)各組動(dòng)物腸道微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行平行比較；(3)對(duì)指紋圖譜進(jìn)行主成分分析，偏最小二乘判別分析，尋找與藥物防癌有效性相關(guān)的重要指紋譜帶；(4)對(duì)重要指紋譜帶所代表的微生物進(jìn)行鑒定，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)針對(duì)這些微生物的種特異性引物和探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，對(duì)健康動(dòng)物、具有癌前病變動(dòng)物以及藥物防癌劑干預(yù)動(dòng)物間的這些重要微生物數(shù)量上的差異進(jìn)行比較。本發(fā)明能克服現(xiàn)有判斷藥物防癌劑方法的不足，為檢測(cè)對(duì)結(jié)腸癌的藥物防癌效果提供一種非損傷性的分子方法。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101240315SQ20081003374公開日2008年8月13日申請(qǐng)日期2008年2月21日優(yōu)先權(quán)日2008年2月21日發(fā)明者吳大正,龐小燕,偉賈,趙立平,華魏申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)