專利名稱：：提高偶聯(lián)酶促反應測定腺苷脫氨酶診斷試劑穩(wěn)定性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及提高偶聯(lián)酶促反應測定腺苷脫氨酶診斷試劑穩(wěn)定性的方法。
背景技術(shù)：
：腺苷脫氨酶(ADA)是一種核苷酸氨基水解酶，是嘌呤核苷代謝中的重要酶類，廣泛分布于人體各組織中，胸腺、脾和其他淋巴組織中含量較高，以紅細胞和D淋巴細胞內(nèi)含量最豐富。ADA增高是D淋巴細胞對某些特殊病變局部刺激產(chǎn)生的一種反應，其與D淋巴細胞增殖、分化和數(shù)量有密切關(guān)系。因此ADA的檢測在某些疾病的診斷、治療及發(fā)病機制的研究關(guān)注。肝膽疾病中肝肝硬化病人血清ADA活性升高的陽性率(7088.8%)及升高幅度最為顯著(為對照值的2~2.6倍)。原發(fā)性肝癌病人伴膽硬變者血清ADA升高的陽性率為60%~100%。而不伴肝硬變者的陽性率僅為16%?？梢姡珹DA活性升高是肝硬變所致。在各型急性肝炎病例中，甲型肝炎患者ADA和ALT均顯著升高，乙型肝炎患者的ALT升高遠大于ADA，非甲非乙型的肝炎病人則ADA升高幅度大于ALT。而且此型肝炎病人中的ADA極度升高者多易轉(zhuǎn)變?yōu)檫w延性肝炎。在慢性肝炎病中，乙型患者ADA高于非甲非乙型者，活動型又比非活動型高。測定ADA可反映非甲非乙型慢性肝炎的活動度，有助于療效的判斷。阻塞黃疸患者大多數(shù)血清ADA活性正常，而肝細胞性黃疸病人血清ADA活性大多數(shù)升高，因此測定血清ADA活性有助于兩類黃疸的鑒別診斷。其他疾病，結(jié)合型膽膜炎、傳染性單核細胞增多癥、栗粒性結(jié)核、風濕熱、溶血性貧血、白血病以及部分腫瘤病人均有部分病人的血清ADA呈不同程度的增高，慢性活動性結(jié)節(jié)病得發(fā)期病人血清ADA活性升高。目前，普通偶聯(lián)酶促反應測定腺苷脫氨酶的試劑基本上都是按照次黃苷偶聯(lián)PNP和XOD酶促反應以及Trider反應聯(lián)合使用來設(shè)計的，由于PNP和XOD酶的穩(wěn)定性比較差，導致即使將試劑保存在冷藏環(huán)境中，也不容易得到可靠的測定結(jié)果，并且容易造成試劑的浪費。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種提高偶聯(lián)酶促反應測定腺苷脫氨酶診斷試劑穩(wěn)定性的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。本發(fā)明的技術(shù)原理ADA催化腺苷脫氨生成次黃苷，次黃苷經(jīng)嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)作用，生成次黃嘌呤；后者在黃嘌呤氧化酶(XOD)的催化下，生成尿酸和過氧化氫(H202);在過氧化物酶的存在下與EHSPT、4AAP反應，生成有色醌，醌的含量與ADA活性成正比，動態(tài)檢測有色醌的生成速率，可求得ADA活性。(一)原理反應式如下腺苷+水腺苷脫氨酶次黃苷+NH3腺苷+單價磷酸鹽核苷磷酸酶(PNP)次黃嘌呤+l-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶(XOD)尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+還原性色原性體組合過氧化物酶有色醌+水。本發(fā)明的方法，其特征在于，包括在酶促偶聯(lián)方法檢測腺苷脫氨酶濃度的試劑(以下簡稱基本試劑)中加入穩(wěn)定劑的步驟；所說的穩(wěn)定劑包括乙二胺四乙酸鈣(以下簡稱EDTA—Ca)、乙二胺四乙酸鐵(以下簡稱EDTA—Fe)、鉬酸鈉、鉬酸銨、谷氨酸鈉、牛血清白蛋白或超氧化物歧化酶中的一種；所說的穩(wěn)定劑的種類和在基本試劑中的濃度范圍如下EDTA-Ca1010Ommol/LEDTA-Fe101OOmmol/L510Ommol/L51OOmmol/L谷氨酸鈉51OOmmol/L牛血清白蛋白810g/L超氧化物歧化酶(SOD)0.510.0KU/L所說的基本試劑的組成和其組分的濃度如下鉬酸鈉試劑1(Rl)PH7.0Tris-Hcl50mmol/l4AAP2mmol/lPNPO.lu/mlXOD0.2u/ml過氧化物酶0.6u/ml試齊!J2(R2)PH4.0Tris-Hcl50mmol/l腺苷lOmmol/1EHPST2mmo1/1由于PNP和XOD都存在于Rl試劑中，所以所說的穩(wěn)定劑都添加在Rl中；其中鉬酸鈉、鉬酸銨、谷氨酸鈉由國藥化學試劑有限公司生產(chǎn)，牛血清白蛋白購于北京拜爾迪生物公司、超氧化物歧化酶(SOD)購于日本東洋紡株式會社。本發(fā)明的用于測定腺苷脫氨酶的偶聯(lián)酶促反應試劑的使用方法，與普通的偶聯(lián)酶促反應測定腺苷脫氨酶的試劑相同，可在半自動紫外可見分光光度計和全自動生化分析儀中使用。本發(fā)明的提高測定腺苷脫氨酶的偶聯(lián)酶促反應試劑穩(wěn)定性的方法，可以廣泛應用在臨床體外診斷試劑上，降低試劑的浪費。具體實施例方式實施例1按照如下的配比，配制基本試劑，并分為8份試劑l(Rl)PH7.0Tris-Hcl50mmo1/14AAP2mmo1/1PNP0.1u/mlXOD0.2u/ml過氧化物酶0.6u/ml試齊U2(R2)PH4.0Tris-Hcl50mmo1/1腺苷10mmo1/1EHPST2mmo1/1然后在其中的7份的基本試劑的試劑1(Rl)中，分別加入如下的穩(wěn)定劑，并使達到如下的含量EDTA國CaEDTA-Fe鉬酸鈉鉬酸銨谷氨酸鈉畫麵ol/L100mmol/L腦mmol/L100mmol/L100mmol/L牛血清白蛋白10g/L超氧化物歧化酶(SOD)10.0KU/L將試劑密封放入4"C儲存，在放入前和放入1個月后、3個月后測試腺苷脫氨酶質(zhì)控品。把放入前質(zhì)控品的測定值設(shè)定為1(100%)，觀察放入后的質(zhì)控檢測值變化率，用百分比表示，然后按照如下的方法進行試驗，結(jié)果見表l。測試機型測試溫度比色杯光徑反應時間波長測試方法曰立7170全自動生化分析儀37度lcm10min546腦速率法反應方向上升反應吸樣量與試劑比例5/180/90孵育時間5分鐘測試時間、在第8-10分鐘開始監(jiān)測吸光度變化值樣本要求不溶血的血清。計算ADA(U/L)=AA/minxF(理論F二1708)F=(VTxlOOO)/(sxVsxd)VT:反應總體積(ml)Vs:樣本體積(ml)s:毫摩爾消光系數(shù)d:比色杯光徑(cm)注有色醌在556nm時的^32.2。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表1結(jié)果可見，按照上述的比例加入穩(wěn)定劑后，能夠顯著提高試劑的穩(wěn)定性。實施例2試驗方法和基本試劑與實施例1相同，穩(wěn)定劑的加入量如下EDTA-Ca1Ommol/LEDTA-Fe1Ommol/L鉬酸鈉5mmo1/L鉬酸銨5mmol/L谷氨酸鈉5mmol/L牛血清白蛋白8g/L超氧化物歧化酶(SOD)0.5KU/L穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表2:表2穩(wěn)定劑放入前測定(％)放入4度1月(％)放入4度3月(％)未添加物質(zhì)1005033EDTA-Ca(II)1009795EDTA-Fe(III)1009897鉬酸鈉1009897鉬酸銨1009898谷氨酸鈉1009897牛血清白蛋白訓9998超氧化物歧化酶1009695由表2結(jié)果可見，按照上述的比例加入穩(wěn)定劑后，能夠顯著提高試劑的穩(wěn)定性。實施例3試驗方法和基本試劑與實施例1相同，穩(wěn)定劑的加入量如下EDTA-Ca50mmol/LEDTA-Fe60mmo1/L鉬酸鈉55mmo1/L鉬酸銨45mmo1/L谷氨酸鈉45mmo1/L牛血清白蛋白9g/L超氧化物歧化酶(SOD)6KU/L穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表3:表3<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表3結(jié)果可見，按照上述的比例加入穩(wěn)定劑后，能夠顯著提高試劑的穩(wěn)定性。實施結(jié)果由上述的穩(wěn)定性實驗數(shù)據(jù)(表l一表3)表明，ADA基本配方內(nèi)加入乙二胺四乙酸釣10100mmol/L、乙二胺四乙酸鐵10100mmo1/L、鉬酸鈉5100mmol/L、鉬酸銨5100mmo1/L、谷氨酸鈉5100mmo1/L、牛血清白蛋白810g/L或超氧化物歧化酶0.510.0KU/L中的一種，可以使得測定腺苷脫氨酶的偶聯(lián)酶促反應試劑具有較高的穩(wěn)定性，4度可以穩(wěn)定三個月?？朔艘酝佘彰摪泵?ADA)診斷試劑不穩(wěn)定的缺陷。權(quán)利要求1.一種提高偶聯(lián)酶促反應測定腺苷脫氨酶診斷試劑穩(wěn)定性的方法，其特征在于，包括在基本試劑中加入穩(wěn)定劑的步驟；所說的穩(wěn)定劑包括乙二胺四乙酸鈣(以下簡稱EDTA-Ca)、乙二胺四乙酸鐵(以下簡稱EDTA-Fe)、鉬酸鈉、鉬酸銨、谷氨酸鈉、牛血清白蛋白或超氧化物歧化酶中的一種。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所說的穩(wěn)定劑的種類和在基本試劑中的濃度范圍如下10100mmol/L10腦mmol/L510Ommol/L5100腿ol/L510Ommo1/L810g/L超氧化物歧化酶(SOD)0.510.0KU/L。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所說的基本試劑的組成和其組分的濃度如下試劑1(Rl)PH7.0三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸(以下簡稱Tris-HCL)5Ommo1/14氨基安替比林(以下簡稱4AAP)2mmo1/1嘌呤核苷磷酸化酶(以下簡稱PNP)0.1u/ml黃嘌呤氧化酶(以下簡稱XOD)0.2u/ml谷氨酸鈉牛血清白蛋白過氧化物酶0.6u/ml試劑2(R2)PH4.0三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸(以下簡稱Tris-HCL)50mmol/l腺苷10mmol/lN-乙基-N-O羥基-3-磺丙基)-3-甲基(以下簡稱EHPST)2mmo1/1。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所說的穩(wěn)定劑添加在Rl中。全文摘要本發(fā)明提供了一種提高偶聯(lián)酶促反應測定腺苷脫氨酶的診斷試劑穩(wěn)定性的方法，包括在腺苷脫氨酶的診斷試劑中添加不同的穩(wěn)定劑所述穩(wěn)定劑包括乙二胺四乙酸鈣10～100mmol/L，乙二胺四乙酸鐵10～100mmol/L，鉬酸鈉5～100mmol/L，鉬酸銨5～100mmol/L，谷氨酸鈉5～100mmol/L，牛血清白蛋白8～10g/L，超氧化物歧化酶0.5～10.0KU/L。在試劑中添加以上穩(wěn)定劑的任何一種且保持在上述的濃度范圍內(nèi)，都可以使得測定腺苷脫氨酶的偶聯(lián)酶促反應試劑具有較高的穩(wěn)定性，可以廣泛應用在臨床體外診斷上，并降低試劑的浪費。文檔編號C12Q1/527GK101514358SQ200810033820公開日2009年8月26日申請日期2008年2月22日優(yōu)先權(quán)日2008年2月22日發(fā)明者崔鵬飛,敏金申請人:上海藍怡科技有限公司