專利名稱：：通用方案和構(gòu)象敏感凝膠電泳篩查單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬臨床個體基因型的測定方法，特別是涉及一種通用方案和構(gòu)象敏感凝膠電泳篩查新單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)法。技術(shù)背景單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)作為第三代具有高度穩(wěn)定性的遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記，在基因定位、克隆、遺傳多態(tài)性方面具有廣泛應(yīng)用，特別是作為基因診斷標(biāo)記在預(yù)防醫(yī)學(xué)中具有十分重要的作用，可以作為進(jìn)行疾病診斷、預(yù)防和藥物篩選的基礎(chǔ)。目前篩選SNP和未知突變的主要方法有單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(single-strandconformationpolymorphismanalysis,SSCP)OritaM，IwahanaH，KanazawaH,HayashiK,SekiyaT..DetectionofpolymorphismsofhumanDNAbygelelectrophoresisassingle-strandconformationpolymorphisms.Prac.AW/.JcfldSd.C75^,1989,86(8):2766-2770，變性梯度凝膠電泳(denaturinggelgradientelectrophoresis,DGGE)Fischer,S.G"Lerman,L.S.DNAfragmentsdifferingbysinglebase-pairsubstitutionsareseparatedindenaturinggradientgels:correspondencewithmeltingtheory.iVoc.A^/.^ca^./7&i1983，80(6):1579-1583，變性高效液相色譜技術(shù)(DHPLC)UnderhillPA,JinL,LinAA,MehdiSQ,JenkinsT，VollrathD，DavisRW,Cavalli-SforzaIX,OefnerPJ..DetectionofnumerousYchromosomebiallelicpolymorphismsbydenaturinghigh-performanceliquidchromatography.ies，1997,7(10):996-1005，直接測序法等。這些方法在某種程度上均能完成對SNP的檢測，但應(yīng)用上也有些不足。SSCP影響因素很多，如電泳溫度、膠中甘油濃度及膠濃度等均可影響檢測的靈敏度，并且檢測單堿基替換的敏感性較弱。DHPLC對試劑和環(huán)境要求較高。DGGE技術(shù)檢測片段大于500bp，長度上優(yōu)于其它方法，幾乎可達(dá)100%的有效檢測率，無需放射標(biāo)記，但是當(dāng)SNP發(fā)生在高熔點(diǎn)區(qū)時則難以利用DGGE技術(shù)檢測。而對于一些比較小、外顯子相對較少的基因的SNP可直接測序，其檢測效率可以達(dá)到100%，但對于較大的外顯子相對較多的基因，直接測序的成本較高。最近發(fā)展的熒光-構(gòu)象敏感凝膠電泳法(fluorescence-basedconformationsensitivegelelectrophoresis,F-CSGE)步驟簡單快速，高通量、低成本、可利用現(xiàn)有試驗(yàn)條件，無需添加新設(shè)備，可檢測較長片段(250-500bp)LeungYF,TarnPO,TongWC,BaumL,ChoyKW，LamDS,PangCP.High-throughputconformation-sensitivegelelectrophoresisfordiscoveryofSNPs.5z'ofcc/w/《way,2001,30(2):334-335,338-340。由于該方法建立的基礎(chǔ)為單堿基錯配，所以在單堿基突變檢測中，與SSCP檢測堿基替換較弱的敏感性(僅單鏈構(gòu)象差異)相比，該方法具有更加明顯的高敏感性。這也是CSGE技術(shù)用于SNP篩查的優(yōu)勢。但是，因?yàn)镕-CSGE技術(shù)依賴熒光PCR過程，對每一對引物標(biāo)記熒光成本較高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用通用方案和構(gòu)象敏感凝膠電泳技術(shù)篩査SNP位點(diǎn)的方法。該法通量更高、檢測速度更快、成本更低地篩查人類或其他動物基因組中未知SNP的方法，可用于未知單堿基多態(tài)性、基因突變、單堿基插入或缺失等單堿基改變的篩查和確認(rèn)，作為基因診斷標(biāo)記應(yīng)用于疾病診斷、預(yù)防和藥物篩選。本發(fā)明的通用方案和構(gòu)象敏感凝膠電泳篩査單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)法，包括下列步驟(1)樣本預(yù)處理采用試劑盒抽提測試者全血或組織基因組DNA;(2)PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)1對通用熒光引物(universalprimer)，根據(jù)樣本靶序列設(shè)計(jì)N對(1~10)特異性附加通用熒光序列的非熒光引物(specificprimers),通用引物標(biāo)記HEX熒光，特異性引物無需添加熒光標(biāo)記，通用引物和特異性引物于同一PCR體系里進(jìn)行反應(yīng)；(3)構(gòu)建異源雙鏈在總體樣本中隨機(jī)選取樣本A作為對照樣本，其余樣本PCR產(chǎn)物分別與A樣本PCR產(chǎn)物混合后，利用6步梯度逐次降溫法于PCR擴(kuò)增儀構(gòu)建異源雙鏈:98°C5min;98°C—90°C5min;90°C—80°C5min;80°C—75。C10min;75°C—60°C10min;60°C—40°C20min;40°C—25°C20min，反應(yīng)完成后半小時內(nèi)電泳上樣；(4)配制構(gòu)象敏感凝膠電泳(CSGE)溫和變性膠并熒光-構(gòu)象敏感凝膠電泳法(F-CSGE)檢測SNPs;(5)根據(jù)電泳峰型圖分析判斷SNP狀態(tài)；(6)DNA測序在經(jīng)F-CSGE發(fā)現(xiàn)SNP信號后，用DNA直接測序確定具體的變異類型。所述通用熒光引物是上游引物5'-TCACTTGCTTCCGTTGAGG-3'，下游引物5，-GGTTTCGGATGTTACAGCGT-3，。所述步驟(2)中用HEX熒光染料標(biāo)記PCR通用引物5'端。所述步驟(2)中的PCR方法為通用引物PCR法。所述步驟(4)中的配制CSGE溫和變性膠步驟①配制50x聚丙烯酰胺母液(99:1)200810034460.0說明書第3/6頁49.5g丙烯酰胺(Acrylamide)，0.5g雙丙烯酰胺(Bis-Acrylamide,BAP)，加雙蒸水至100ml;②配制10%聚丙烯酰胺膠50ml50x聚丙烯酰胺膠母液，37.5ml甲酰胺(15%)，25ml10xTris-硼酸緩沖液(TBE),加137.5ml雙蒸水，總體系250ml;③膠體聚合25ml10%聚丙烯酰胺膠，250pL10%過硫酸銨，13.5pL四甲基乙二胺(TEMED)，2小時凝固；所述步驟(4)中的電泳法步驟①377測序儀電泳環(huán)境2kv，4hr，30°C，lxTBE;②混樣0.5nLPCR產(chǎn)物，0.5pLROX(熒光染料)，0.5pL葡聚糖藍(lán)(50mg/ml)，0.5^1新鮮的去離子甲酰胺；③上樣毛細(xì)管吸取1.2-1.5上樣。本發(fā)明的關(guān)鍵點(diǎn)(1)保證設(shè)計(jì)的通用引物的基因組特異性，通用引物序列Tm值最好處于50-6(TC之間，序列經(jīng)NCBI網(wǎng)站BLAST確證其特異性；(2)利用通用引物長度和特異性引物位置的巧妙設(shè)計(jì)有效地避免假陰性F-CSGE的敏感性與堿基錯配的不同堿基對、PCR產(chǎn)物中堿基錯配發(fā)生的位置以及PCR產(chǎn)物長度有關(guān)。F-CSGE檢湖ijPCR產(chǎn)物的長度的最適范圍為250500bp，一般認(rèn)為，PCR產(chǎn)物中位于兩端50bp內(nèi)的SNP不易檢出，設(shè)計(jì)引物時通過在相鄰兩對引物間采取重疊2040bp左右的策略解決這一困難，即相鄰的下一對引物的上游引物起始端設(shè)計(jì)在距上一PCR片段末端上游35bp左右，加上通用引物上下游各20bp，累計(jì)50bp左右，從而最大程度地避免了漏檢SNP的可能性。(3)為獲得最佳的電泳分離效果，優(yōu)化了溫和變性聚丙烯酰胺膠膠體的成分比，10%聚丙烯酰胺凝膠可達(dá)到最佳分離效果。本發(fā)明的有益效果(1)特異性高，對單堿基改變引起的錯配敏感性高；(2)高通量，通過PCR片段大小差異和多種熒光標(biāo)記可獲得非常高的通量，適合大規(guī)模SNPS篩查；(3)低成本，通用引物PCR方案可降低數(shù)倍引物熒光標(biāo)記所需的成本。圖1是通用方案PCR圖解；圖2是異源雙鏈形成過程原理圖；圖3是F-CSGE電泳圖譜截圖，(A)為2管同一樣本PCR產(chǎn)物混合后純合子電泳峰圖，顯示同源雙鏈為一單峰；(B，C)為檢測樣本和對照樣本PCR產(chǎn)物混合后雜合子電泳峰圖，顯示為雙峰，a、c峰為同源雙鏈峰，b、d峰為異源雙鏈峰，其中，B圖SNP:A>G;C圖SNP:C>T。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1本實(shí)例利用通用方案和構(gòu)象敏感凝膠電泳技術(shù)篩査新snp位點(diǎn)的方法檢測人lhe基因部分區(qū)段單核苷酸多態(tài)性。采集患者外周靜脈血5ml，利用動物基因組DNA小量快速抽取試劑盒抽提全基因組DNA。設(shè)計(jì)1對通用熒光引物(universalprimer):上游引物5，-TCACTTGCTTCCGTTGAGG-3'，下游引物5，-GGTTTCGGATGTTACAGCGT-3，。3對特異性附加通用熒光序列的非熒光引物(specificprimers)(見表l)，通用引物5，標(biāo)記HEX熒光。PCR反應(yīng)采用10pLPCR體系10xBuffer1(含Mg2+15mmol/L);Q-Mg2+0.6[iL(25mmol/L);dNTP1pL(2mmol/L);HotStarTaqEnzyme0.1pL(5unit/^L);特異性引物0.4pL(1pmol/^L);通用引物0.2nL(10pmo闊;DNA模版:0.5(50-100ng/pL);ddH20補(bǔ)足10|aL。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(25mmol/L);dNTP0.5pL(2mmol/L);HotStarTaqEnzyme0.05pL(5unit/^L);特異性引物0.2nL(1pmol/^L);通用引物0.1|iL(10pmol/|_iL);DNA模版0.5(50-100ng/^L);ddH20補(bǔ)足5pL。表2引物序列引物編號引物序列5'-3'PCR產(chǎn)物長度(bp)L16234-UTCACTTGCTTCCGTTGAGGTCATGTTCCGTGAACCAAAA408H311-LGGTTTCGGATGTTACAGCGTTGGCACGAAATTTACCAACCL227-UTCACTTGCTTCCGTTGAGGCACGGGACTCAGCAGTGATA332H518-LGGTTTCGGATGTTACAGCGTTGGCTAAGCATAGTGGGGTAL470-UTCACTTGCTTCCGTTGAGGCGACAGCTAAGACCCAAACTG278H707-LGGTTTCGGATGTTACAGCGTTTTAGGGTTTGCTGAAGATGGL644-UTCACTTGCTTCCGTTGAGGCCGCTCTACCTCACCATCTC515H1119-LGGTTTCGGATGTTACAGCGTGTGTAGGGCTAGGGCTAGGA于9600PCR擴(kuò)增儀(ABI)反應(yīng)，程序95°C15min，94。C30s變性，50-60°C90s退火，72。C90s延伸，30個循環(huán)。以其中一樣本作為對照樣本，其余樣本PCR產(chǎn)物分別與對照樣本PCR產(chǎn)物混合后，利用6步梯度逐次降溫法于9600(ABI)PCR擴(kuò)增儀構(gòu)建異源雙鏈98°C5min;98°C—90°C5min;90°C—80°C5min;80°C—75°C10min;75°C—60°C10min;60。C—40°C20min;40°C—25°C20min。反應(yīng)完成后半小時內(nèi)電泳上樣。取0.5pLPCR產(chǎn)物、0.5hLROX、0.5pL葡聚糖藍(lán)(50mg/ml)、0.5nL新鮮的去離子甲酰胺混樣，毛細(xì)管吸取1.2-1.5nL上樣于ABI377自動測序儀。377自動測序儀電泳環(huán)境設(shè)置2kv，30°C，電泳4小時后停止。利用Genemapper軟件進(jìn)行電泳結(jié)果分析。F-CSGE檢測為陽性的樣本重新單重PCR(不加通用熒光引物)，PCR產(chǎn)物利用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后測序。權(quán)利要求1.一種通用方案和構(gòu)象敏感凝膠電泳篩查單核苷酸多態(tài)性SNP位點(diǎn)法，包括下列步驟(1)樣本預(yù)處理采用試劑盒抽提測試者全血或組織基因組DNA；(2)PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)一對通用熒光引物，根據(jù)樣本靶序列設(shè)計(jì)N對特異性附加通用熒光序列的非熒光引物，通用引物標(biāo)記HEX熒光，特異性引物無需添加熒光標(biāo)記，通用引物和特異性引物于同一PCR體系里進(jìn)行反應(yīng)；(3)構(gòu)建異源雙鏈選取樣本A作為對照樣本，其余樣本PCR產(chǎn)物分別與A樣本PCR產(chǎn)物混合后，利用6步梯度逐次降溫法于PCR擴(kuò)增儀構(gòu)建異源雙鏈；(4)配制構(gòu)象敏感凝膠電泳CSGE溫和變性膠與熒光-構(gòu)象敏感凝膠電泳法F-CSGE檢測SNPs；(5)根據(jù)電泳峰型圖分析判斷SNP狀態(tài)；(6)DNA測序在經(jīng)F-CSGE發(fā)現(xiàn)SNP信號后，用DNA直接測序確定具體的變異類型。全文摘要本發(fā)明涉及通用方案和構(gòu)象敏感凝膠電泳篩查單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)法，該方法首先利用通用引物方案對目的核酸序列區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再應(yīng)用F-CSGE技術(shù)進(jìn)行高通量快速檢測，最后通過DNA測序技術(shù)對篩查出的位點(diǎn)進(jìn)行最終確證。與其他檢測方法比較，本發(fā)明方法通量更高，檢測速度更快，成本更低，可用于檢測未知SNP和致病基因的單堿基突變，用于未知單堿基多態(tài)性、基因突變、單堿基插入或缺失等單堿基改變的篩查和確認(rèn)。文檔編號C12Q1/68GK101245388SQ200810034460公開日2008年8月20日申請日期2008年3月11日優(yōu)先權(quán)日2008年3月11日發(fā)明者于明輝,周宇荀,朱旺升,凱李,肖君華,范忠鵬申請人:東華大學(xué)