專利名稱：：黃瓜TTG1-like基因的蛋白編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是一種基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
蛋白編碼序列，特別是一種黃瓜TTGl-like基因的蛋白編碼序列。
背景技術(shù)：
：表皮毛(Trichomes)是許多陸地植物表面著生的附屬物，由表皮細(xì)胞發(fā)育而來的。它分為單細(xì)胞或多細(xì)胞，在表皮毛中有的有腺體，可以分泌一些脂類物質(zhì)或次生代謝物，有的無腺體。植物表皮毛的形態(tài)變異很大，有星型、羽狀、盾狀和頭狀等等，相同的植物上能產(chǎn)生不同類型的表皮毛。植物表皮毛具有一系列功能無腺體的表皮毛具有散熱、增加對(duì)冷害的忍受力、方便種子傳播、水分的吸收、保護(hù)紫外和一些食草昆蟲對(duì)植物組織損傷的作用；有腺體的表皮毛可通過分泌化學(xué)物質(zhì)來幫助植物抵抗食草昆蟲和病原菌，同時(shí)也具有吸引動(dòng)物或堆積鹽分的作用。一些無腺體的表皮毛，比如棉纖維是來自棉花種子表皮毛，對(duì)于紡織工業(yè)是十分重要的。黃瓜(CucumissativusL)是葫戶禾斗(Cucurbitaceae)黃瓜屬(Cucumis)一年蔓生的草本植物。黃瓜作為世界十大重要的蔬菜作物之一，黃瓜不僅作為重要的蔬菜作物歷來備受育種家的重視，而且因其花性型多樣，也是遺傳研究的一個(gè)模式植物。黃瓜植株莖、葉、巻須、花萼、子房表面均覆有短剛毛，果實(shí)均有刺，多數(shù)子房表面有瘤狀突起，瘤上有刺。黃瓜葉片上的剛毛和果實(shí)上的果刺均為多細(xì)胞無腺體的表皮毛。果實(shí)是黃瓜經(jīng)濟(jì)性狀最重要的部分，隨著人們生活水平的提高，品質(zhì)育種己提到重要位置。外觀光滑的黃瓜污染少，清洗方便，食用衛(wèi)生，受消費(fèi)者喜愛，是無公害蔬菜的理想品種。經(jīng)檢測(cè)表明無瘤少刺黃瓜果肉農(nóng)藥殘留量比有刺黃瓜低27%，果皮農(nóng)藥殘留量低18%。模式植物擬南芥的表皮毛為單細(xì)胞無腺體的表皮毛，由于其具有簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)和易觀察的優(yōu)點(diǎn)，目前，擬南芥表皮毛的形成已經(jīng)成為研究細(xì)胞形態(tài)建成的模式系統(tǒng)。在擬南芥中表皮細(xì)胞發(fā)育成表皮毛細(xì)胞的進(jìn)程涉及由三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子組成的復(fù)合物的正調(diào)控和一個(gè)抑制因子的負(fù)調(diào)控。其中兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的突變都會(huì)引起植株表皮毛的缺失，第一個(gè)是GLABRA1(GL1)，它是一個(gè)R2R3類型的MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子；第二個(gè)是TRANSPARENTTESTAGLABRA1(TTG1)，它編碼一個(gè)WD40r印eat的蛋白，同時(shí)還影響著其它幾個(gè)代謝途徑，包括花青素代謝途徑、種皮黏液的產(chǎn)生及根毛發(fā)育的途徑。植物璀璨花色的本質(zhì)是花瓣中含有特定色素?；ㄇ嗨厥且环N最重要的類黃酮花色素，是呈現(xiàn)紅、粉、紫、藍(lán)等顏色的主體色素?；ㄇ嗨卮x途徑主要包括6個(gè)結(jié)構(gòu)酶查耳酮合酶，査耳酮異構(gòu)酶，黃垸酮-3-羥化酶，二氫黃酮醇還原酶，花青素苷元合酶和尿苷二磷酸_葡萄糖-類黃酮-3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。而TTG1基因調(diào)控黃烷酮-3-羥化酶合成。這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子與GLABRA3(GL3)互作而形成復(fù)合物，GL3的突變表現(xiàn)為植株表皮毛的減少，它是一個(gè)BHLH家族的轉(zhuǎn)錄因子。近幾年，對(duì)棉花纖維形成的研究也證實(shí)了在棉花中存在著相同的分子機(jī)制。但是GL1基因在多細(xì)胞表皮毛的煙草中過量表達(dá)，卻并不影響其表皮毛的形成。此外，玉米的R-likeBHLH轉(zhuǎn)錄因子能在擬南芥葉和莖中產(chǎn)生額外的表皮毛，但是它也不能影響具有多細(xì)胞表皮毛的煙草、矮牽牛和番茄表皮毛的形成。這些證據(jù)表明擬南芥、棉花代表的單細(xì)胞表皮毛形成的分子機(jī)制和多細(xì)胞表皮毛形成的分子機(jī)制有相似和不同之處。因此，還需要在更多的其它植物種類上研究分析表皮毛形成的機(jī)制。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)檢索中發(fā)現(xiàn)雜志《PlantCell(植物細(xì)胞)》，在1999,11:1337-1349發(fā)表了文章"TheTRANSPARENTTESTAGLABRA1Locus,WhichRegulatesTrichomeDifferentiationandAnthocyaninBiosynthesisinArabidopsis,EncodesaWD40R印eatProtein(擬南芥TTGl位點(diǎn)編碼一個(gè)WD40重復(fù)蛋白，調(diào)控表皮毛分化和花青素合成)"該文獻(xiàn)雖然對(duì)TTG1基因在擬南芥中的重要作用做了說明，但是TTG1基因在黃瓜果刺這種多細(xì)胞表皮毛植物中是否存在，并且對(duì)黃瓜TTG1基因的研究從未見報(bào)道，由于TTGl基因不僅控制表皮毛的形成，而且還控制花青素合成，所以該基因可以利用基因工程技術(shù)對(duì)黃瓜果刺性狀進(jìn)行改良和對(duì)植物花色改良。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種黃瓜TTG卜like基因的蛋白編碼序列。本發(fā)明公開了與擬南芥TTGl基因78^同源的黃瓜TTGl-like基因的核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列，也公開了在利用基因工程技術(shù)對(duì)黃瓜品質(zhì)改良和花色改良中的應(yīng)用。利用同源克隆的方法，在黃瓜中克隆與擬南芥決定表皮毛起始的TTG1同源的基因，不僅將有利于理解植物表皮毛形態(tài)建成的分子機(jī)制，而且也將會(huì)有助于認(rèn)識(shí)黃瓜果刺這個(gè)重要品質(zhì)基因形成的分子機(jī)理，為黃瓜品質(zhì)育種提供理論依據(jù)，加快品種育種進(jìn)程。該基因同時(shí)調(diào)控花青素合成，也可以應(yīng)用于植物花色的改良。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的在本發(fā)明所分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有黃瓜TTGl-like基因的蛋白質(zhì)活性的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQIDNO.3中從核酸第160_1158位的核苷酸序列有70%的同源性；或者所述核苷酸序列能在45—55"C條件下與SEQIDNO.3中從核苷酸第160一1158位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明所分離出的黃瓜TTGl—like蛋白編碼序列多肽，它包括:具有SEQIDNO.4氨基酸序列的多肽、或者保守性變異多肽、或者活性片段，或者活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQIDN0.4序列的多肽。本發(fā)明還提供了一種真核植物表達(dá)載體，它包含上述的DNA分子。一種核酸分子，它包含所述地DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。本發(fā)明還提供了一種用上述DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞，在實(shí)例中該宿主細(xì)胞是擬南芥。在本發(fā)明中，"分離的"、"純化的"DNA是指，該DNA或片段己從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。在本發(fā)明中，術(shù)語"黃瓜TTGl-like基因蛋白編碼序列"指編碼具有活性多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.3中第160—1158位的核苷酸序列及其兼并序歹U。該兼并序列是指，位于SEQIDN0.3序列的編碼框第160—1158位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的兼并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的兼并性，所以與SEQIDNO.3中第160_1158位核苷酸序列同源性低至約70%的兼并序列也能編碼出SEQIDN0.3所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件(55—65。C)下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件(65'C以上)下與SEQIDNO.3中從核苷酸第160—1158位的核苷酸序列雜交地核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQIDNO.3中從核苷酸第160—1158位的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的黃瓜TTGl-like蛋白相同功能的蛋白的SEQIDN0.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)；若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1_10個(gè))核苷酸的缺失、插入或取代，以及在5'或3'添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中，術(shù)語"黃瓜TTG卜like蛋白或多肽"指具有黃瓜黃瓜TTGl-like蛋白活性的SEQIDN0.4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然黃瓜TTGl-like蛋白相關(guān)相同功能的、SEQIDN0.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)；若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入或取代，以及在N末端或C末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括黃瓜TTGl-like蛋白的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明的黃瓜TTGl-like多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然變異體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與黃瓜TTGl-like相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用黃瓜TTGl-like多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。在本發(fā)明中，"黃瓜TTG1-like保守性變異多肽"指與SEQIDNO.4的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近地氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>Asp(D)GluGluCys(C)SerSerGin(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro5AlaAlaHis(H)Asn;Gin;Lys;ArgArglie(I)L6UjVal;Met;Ala;PheLeuLeu(L)lie;Val;Met;Ala;PhelieLys(K)Arg;Gin;AsnArgMet(M)Phe;lieLeuPhe(F)Val;lie;Ala;TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(w)Tyr;PheTyrTyr(Y)TrpsPhe;Thr;SerPheVal(V)lie;Leu;Met;Phe;AlaLeu表278%identityin335aaoverlapQuery6SRSEFLATYESPHPLYAMAISSPHAHSLNFSSRIALGSFVEEYNNRVDIVSFDPDSISIK65SRSETY+SP+PLYAMASS+SRIA+GSF+E+YNNR+DI+SFDDS+++KSbjct10SRSETAVTYDSPYPLYAMAFSSLRSSS---GHRIAVGSFLEDYNNRIDILSFDSDSMTVK66Query66ANPSLSFEHPYPPTKLMFNPSPL-----SSLLASSGDSLRLWKLGD--SSIEPLSLLNNS118P+LSFEHPYPPTKLMF+PLLLASSGDLRLW+++S++EP+S+LNNSSbjct67PLPNLSFEHPYPPTKLMFSPPSLRRPSSGDLLASSGDFLRLWEINEDSSTVEPISVLNNS126Query119KTSEFCAPLTSF腳EVEPKRIGTSSIDTTCTIWDIEKSVVETQFI細(xì)KEVYDIAWGEA178KTSEFCAPLTSFDWN+VEPKR+GTSIDTTCTITOIEKSVVETQlAHDKEV+DIAWGEASbjct127KTSEFCAPLTSFDWNDVEPKRLGTCSIDTTCTIWDIEKSVVETQLIAHDKEVHDIAWGEA186Query179RVFASVSADGSVRIFDMRDKEHSTIIYESPQPDTPLLRLAWNKQDLRYMATILMDSNKIV238RVFASVSADGSVRIFD+RDKEHSTIIYESPQP野LLRLA麗QDLR碰TILMDSNK+VSbjct187RVFASVSADGSVRIFDLRDKEHSTIIYESPQPDTPLLRLA麗KQDLRYMATILMDSNKVV246Query239ILDIRSPSVPVAELE腿SSVNAIAWAPRSCRHICSAGDDKQALIWELPMVAGPNGIDPM298ILDIRSP++PVAELERH+SVNAIAWAP+SC+HICSGDDQALIWELPVAGPNGIDPMSbjct247ILDIRSPTMPVAELERHQASVNAIAWAPQSCKHICSGGDDTQALIWELPTVAGPNGIDPM306Query299SMYSAAFEINQLQWSAAQPDWIALAFSNKMQLLKV333S+YSAEINQLQWS++QPDWI+AF+NKMQLL+VSbjct307SVYSAGSEINQLQWSSSQPDWIGIAFANKMQLLRV341Query:黃瓜TTG1-1ike蛋白的氨基酸序列Sbjct:擬南芥TTG1的氨基酸序列(genebank序列號(hào)為NM—122360)表2為本發(fā)明的黃瓜TTG1-like蛋白與擬南芥TTG1蛋白的氨基酸序列的同源性比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出。表378%identityin334aaoverlapQuery7RSEFLATYESPHPLYAMAISS-PHAHSLNFSSRIALGSFVEEYNNRVDIVSFDPDSISIK65RS+TYESP+PLYAMA+SSPLN+RIALGSF+E+YNRVI+SFDP+S+++Sbjct11RSDNAVTYESPYPLYAMALSSTPAVTHLNYQ-RIALGSFIEDYTNRVHIISFDPESLTLI69Query66ANPSLSFEHPYPPTKLMFNP—-SPLSSLLASS---GDSLRLWKLGDSSIEPLSLLNNSK119+PSLSF+HPYPPTKLMFPSPSSGDLRLW++GSSIE+S+L+NSKSbjct70THPSLSFDHPYPPTKLMFQP服KSPFSSSSDLLASSGDYLRLWEVGHSSIELISVLDNSK129Query120TSEFCAPLTSFD麗EVEPKRIGTSSIDTTCTIWDIEKSVVETQFIAHDKEVYDIAWGEAR179TSEFAPLTSFD麗+VEPRIGTSSIDTTCTIWDIEKVVETQIAHDKEVYDIAWGERSbjct130TSEFSAPLTSFDWNDVEPNRIGTSSIDTTCTIWDIEKGVVETQLIAHDKEVYDIAWGEGR189Query180VFASVSADGSVRIFDMRDKEHSTIIYESPQPDTPLLRLAWNKQDLRYMATILMDSNKIVI239VFSVSADGSVRIFD+腿EHSTIIYESPQPDTPLLRLAWNKQDLR麗TLMDSNK+VISbjct190VFGSVSADGSVRIFDLRDKEHSTIIYESPQPDTPLLRLAWNKQDLRYMATTLMDSNKVVI249Query240LDIRSPSVPVAELERHHSSVNAIAWAPRSCRHICSAGDDKQALIWELPMVAGPNGIDPMS299LDIRSP+PVAEL+RH+SVNAIAWAP+SC+HICSAGDDALIWELPVAGPNGIDP+SSbjct250LDIRSPTTPVAELDRHGASVNAIAWAPQSCKHICSAGDDTHALIWELPTVAGPNGIDPLS309Query300MYSAAFEINQLQWSAAQPDWIALAFSNKMQLLKV333MYSA+EINQLQWSAAQPDWIA+AFSNKMQLLKVSbjct310MYSASSEINQLQWSMQPDWIAIAFSNKMQLLKV343Query:黃瓜TTGl-like蛋白的氨基酸序列Sbjct:棉花TTGl的氨基酸序列(genebank序列號(hào)為AAM95641)表3為本發(fā)明的黃瓜TTGl-like蛋白與棉花TTG1蛋白的氨基酸序列的同源性比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出。發(fā)明還包括黃瓜TTGl-like蛋白或多肽的類似物。這些類似物與黃瓜TTGl-like蛋白相關(guān)多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D—氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生物形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒、粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的黃瓜TTGl-like蛋白時(shí)，可以將黃瓜TTGl-like基因的編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成黃瓜TTGl-like基因的表達(dá)載體。如本發(fā)明所用，"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列地某些部分能夠影響同一線性DNA序列其它部分地活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽地分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動(dòng)子控制序列地轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中，術(shù)語"宿主細(xì)胞"為真核細(xì)胞。常用地真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、擬南芥、煙草細(xì)胞和其它植株細(xì)胞。可用半定量RT-PCR技術(shù)分析黃瓜TTGl-like基因產(chǎn)物地表達(dá)，即分析黃瓜TTGl-like基因的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。此外，本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有黃瓜TTGl-like核苷酸編碼序列的8-100個(gè)連續(xù)核苷酸，較佳地具有15_50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼黃瓜TTGl-like基因相關(guān)地核酸分子。本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中是否存在黃瓜TTG1-like基因相關(guān)核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于黃瓜TTGl-like基因相關(guān)核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為18-30個(gè)核苷酸。此外，根據(jù)本發(fā)明的黃瓜TTGl-like基因核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選黃瓜TTGl-like基因相關(guān)同源基因或同源蛋白。為了得到與黃瓜TTGl-like基因相關(guān)基因的黃瓜cDNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選黃瓜cDNA文庫(kù)，這些探針是在低嚴(yán)謹(jǐn)條件(45-55°C)下，用32P對(duì)黃瓜TTG1-like基因相關(guān)的全部或部分序列做放射性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫(kù)是來自黃瓜的文庫(kù)。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫(kù)的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫(kù)可以購(gòu)買到，例如可購(gòu)于Clontech，Stratagene,PaloAlto,Cal.公司。這種篩選方法可以識(shí)別與黃瓜TTGl-like基因相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。本發(fā)明的黃瓜TTGl-like基因相關(guān)核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法、人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA文庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的常規(guī)方法所制備的cDNA文庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后地宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(FosterCity，CA)來自動(dòng)合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。利用本發(fā)明的黃瓜TTGl-like基因的蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與黃瓜TTGl-like基因發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制或拮抗劑等。本發(fā)明在黃瓜品質(zhì)改良中具有重要作用，同時(shí)，由于該基因是花青素合成途徑的關(guān)鍵酶，對(duì)花色的改良也具有一定的應(yīng)用價(jià)值。圖1為用Bar基因?qū)D(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)。其中M為100bp的DNAmarker,1為陰性對(duì)照，2為擬南芥Ler野生型的DNA，3為擬南芥ttgl突變體的DNA，4和5為轉(zhuǎn)基因植株的DNA，6為陽(yáng)性對(duì)照。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1、黃瓜TTGl-like基因的克隆一、組織分離普通黃瓜品種申綠64(市售產(chǎn)品)，該品種屬于歐洲溫室類型的黃瓜，其表現(xiàn)為全雌、有果刺、無果瘤。將黃瓜種子播與溫室的穴盤中，待植株長(zhǎng)到兩葉一心時(shí)，準(zhǔn)備抽取DNA或RNA。二、RNA的分離取部分組織，用液氮研磨后裝入1.5ml離心管中，加入Trizol后，充分振蕩，用RNA提取試劑盒(上海生工UNIQ-10柱式總RNA抽取試劑盒，產(chǎn)品號(hào)Cat.No.SK1361)抽取總RNA，抽取步驟及試劑詳見試劑盒說明。用甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量。三、基因的全長(zhǎng)克隆根據(jù)擬南芥AtTTGl基因和棉花GhTTGl基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，分三步進(jìn)行1、RT-PCR以黃瓜總RNA為模板，采用SmartRacecDNA擴(kuò)增試劑盒(SMARTRACEcDNAAmplificationKit，購(gòu)于CLONTECH公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn)錄步驟參照該試劑盒的用戶手冊(cè)。在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，同時(shí)包含SMARTprimer和5'、3'-RACECDS的引物，反轉(zhuǎn)錄合成完整的cDNA第一鏈，即一個(gè)RT反應(yīng)可分別用于5，和3'-RACE。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物lOtx1加入40u1TE混勻，保存于-2(TC備用。用兼并引物CsWDl-F(SEQIDNO.1)和CsWDl-R(SEQIDNO.2)對(duì)黃瓜S06的cDNA進(jìn)行PCR得到606bp的序列，回收連接到pUCm-T載體(購(gòu)于上海申能博采公司)上，電擊轉(zhuǎn)化E.coliDH5a的感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)于大連寶生物工程有限公司)，具體方法如下吸取1mlSOB培養(yǎng)基置于滅菌的1.5ml的印pendorf管；取50W感受態(tài)細(xì)胞，放入滅菌的印pendorf管；取連接產(chǎn)物加入盛裝感受態(tài)細(xì)胞的印pendorf管，混勻；將加有連接產(chǎn)物的感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯(規(guī)格為2mm)，2500v電擊轉(zhuǎn)化；電擊后將菌液洗到lmlSOB培養(yǎng)基中，37°C，250r/min培養(yǎng)lh。將菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基的平板上，該培養(yǎng)基含氨芐100mg/ml，IPTG和x-gal。涂好的平板倒置于37。C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。用滅過菌的牙簽將平板上顯示為白色的菌落挑到2ml含氨芐(100mg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，250r/min培養(yǎng)2h后進(jìn)行菌液PCR，剩余菌液繼續(xù)在37°C，250rmp/min培養(yǎng)過夜。菌液PCR的反應(yīng)體系為M13引物0.Umol/L，dNTPs200umol/L，lXTaqBuffer,2.Ommol/LMgCl"0.5UTaqDNA聚合酶(上海Promega公司產(chǎn)品)，菌液1W，總反應(yīng)體系為10W。菌液PCR的反應(yīng)程序?yàn)?4°C2min;25cycles，94°C30s;50°C30s，72°C45s;72。C5min。反應(yīng)產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，將擴(kuò)增出預(yù)期大小片段的菌液送由上海生工進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BLAST程序在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行比對(duì)，得到其與擬南芥TTG1基因和棉花GhTTGl基因同源性分別為78%和79%，故初步認(rèn)為它是一個(gè)控制植物表皮毛起始的基因。2、3，-RACE根據(jù)已獲得的RT-PCR產(chǎn)物，設(shè)計(jì)并合成了兩個(gè)3'-RACE的基因特異引物，分別為CsWD2-F(5，-GTGTGGTGGAAACCCAGTTCATAGC-3')和nCsWD2-F(5，-TTGCTTCTGTTTCCGCTGATGGGTC-3，)，用于擴(kuò)增上一步得到片段的3'末端序列。利用為CsWD2-F為正向引物與SMART試劑盒提供的5'-&3，-RACE通用引物UPM(5，-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，)為反向引物相組合，以cDNA為模板進(jìn)行3'端擴(kuò)增，混勻后，3，-RACEPCR反應(yīng)條件如下94°C5min;94°C30s，65°C30s，72°C90s，30個(gè)循環(huán)，；72°C8min。反應(yīng)結(jié)束后，以此PCR反應(yīng)液為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，用nCsWD2-F做正向引物，SMART試劑盒提供的5，-&3，-RACE的NUP(5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3')作為反向引物。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C5min;94°C30s，65°C30s，72°C90s，35個(gè)循環(huán)；72°C8min。將所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收。最后得到一個(gè)751bp的片段，將片段連接到pUCm-T載體上，電擊轉(zhuǎn)化E.coliDH5a的感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)于大連寶生物工程有限公司)，經(jīng)PCR鑒定后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上用BLAST程序進(jìn)行比對(duì)，得到其與擬南芥TTG1基因和棉花GhTTGl基因同源性很高，因此，它是一個(gè)控制植物表皮毛起始的TTG1類似基因。3、5'-RACE根據(jù)己獲得的RT-PCR產(chǎn)物和3'-RACE產(chǎn)物，設(shè)計(jì)并合成了2個(gè)5，-RACE基因特異引物CsWD2-R(5'-ATGCCAGTCTGAGCAAAGGGGTATC-3')和nCsWD2-R(5，-CGAAAATCCTTACCGACCCATCAGC-3，)作為5，-RACE的反向引物。正向引物為試劑盒中提供的5'-&3'-RACE的UMP和NUP(引物序列見前面所述)。以cDNA為模板，反向特異引物CsWD2-R并和試劑盒提供的通用引物UPM配對(duì)，進(jìn)行目的基因的5，端擴(kuò)增。5，-RACEPCR反應(yīng)條件如下94°C5min;94°C30s，65°C30s，72°C90s，30個(gè)循環(huán)；72°C8min。反應(yīng)結(jié)束后，以此PCR反應(yīng)液為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，用nCsWD2-R做反向引物，NUP作為正向引物。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C5min;94°C30s，65°C30s，72°C90s，35個(gè)循環(huán)；72°C8min。將所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收，得到一個(gè)779bp的片段。將片段連接到pUCm-T載體上，電擊轉(zhuǎn)化E.coliDH5a的感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)于大連寶生物工程有限公司)，經(jīng)菌液PCR鑒定后測(cè)序。將3'和5'-RACE測(cè)序得到的序列，用VectorNTI8.0軟件進(jìn)行序列拼接獲得cDNA全長(zhǎng)序列，BLAST的結(jié)果證明這個(gè)從黃瓜中得到的新基因?yàn)橐粋€(gè)與擬南芥AtTTGl基因同源的基因。通過上述三個(gè)步驟，獲得了候選的黃瓜TTG1-like基因全長(zhǎng)cDNA序列(SEQIDNO.3)。實(shí)施例2、黃瓜TTGl-like基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明得到的黃瓜TTGl-like基因是一個(gè)新的基因，cDNA全長(zhǎng)為1414bp，序列見SEQIDNO.3，其中開放閱讀框位于160-1158位核苷酸共999個(gè)核苷酸。根據(jù)全長(zhǎng)的cDNA序列推導(dǎo)出黃瓜TTGl-like基因的氨基酸編碼序列，共333個(gè)氨基酸，分子量為37192.27道爾頓，等電點(diǎn)為4.95。詳細(xì)序列見SEQIDNO.4。將黃瓜TTGl-like基因編碼的蛋白質(zhì)序列用BLAST程序在NCBI進(jìn)行蛋白質(zhì)同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它與擬南芥基因AtTTGl基因在蛋白質(zhì)水平上具有78%的同源性(附表2)，和棉花GhTTGl基因也為78%的同源性(附表3)，這兩個(gè)基因都己被證明具有控制表皮毛起始的功能，證明黃瓜TTGl-like基因在表皮毛形成方面也具有相似的功能。實(shí)施例3、黃瓜TTG1-like基因的蛋白在擬南芥ttgl突變體中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株功能驗(yàn)證一、含黃瓜TTG1-like基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)黃瓜TTGl-like基因的全長(zhǎng)序列(SEQIDNO.3)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整的編碼框引物，并結(jié)合表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，在上游和下游引物上分別加入HindIII和BamHI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(上游引物eCsTTGl-F序列為5'-CTTCAAGCTTGGMTC岡GAACACGCAGC-3';下游引物eCsTTGl-R序列為5'-CTCGGATCCCAAACTT[f^AAAGCTGCATT-3')，以方便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA回收試劑盒(上海生工UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒，產(chǎn)品號(hào)Cat.No.SKI132)回收，在37'C用HindlII和BamHI酶切過夜。同時(shí)將植物表達(dá)載體pEZT-NL質(zhì)粒進(jìn)行相同的酶切反應(yīng)，按照載體和目的片段3:1(摩爾濃度比)的比例用T4連接酶16'C進(jìn)行連接過夜。二、構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥ttgl突變體在保證閱讀框正確的前提下鑒定好的表達(dá)載體，將其電擊轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌(Agrobacterium)GV3101的感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)于大連寶生物工程有限公司)中，利用花浸潤(rùn)方法轉(zhuǎn)化擬南芥ttgl突變體，轉(zhuǎn)化方法及農(nóng)桿菌的使用參照文獻(xiàn)《植物雜志》1998年發(fā)表的文章"花浸潤(rùn)一種簡(jiǎn)單的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化擬南芥的方法"(StevenJ".CloughandAndrewF.BentFloraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium—mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.ThePlantJournal,1998,16:735-743)該突變體由美國(guó)擬南芥研究中心(ABRC)提供，編號(hào)為CS89。1、植物生長(zhǎng)擬南芥植株生長(zhǎng)在培養(yǎng)室中，保持恒溫在23°C，光周期為白天18h，黑暗6h。在直徑7厘米的培養(yǎng)杯里種5處，每處種3棵，先將培養(yǎng)杯放入4'C冰箱中春化48h，然后置于培養(yǎng)室中。種子出苗一周后，每處只留下一棵最好的苗。將植物培養(yǎng)至莖高約3厘米時(shí)，去除其頂生花序。注意要避免傷及葉生花序。去除頂生花序?qū)⒋碳と~生花序的生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)化必須在去除頂生花序4天后進(jìn)行。轉(zhuǎn)化前，將己授粉花以及果莢去除掉，并使土壤吸足水。2、轉(zhuǎn)化操作將鑒定好的連接黃瓜TTGl-like基因的植物表達(dá)載體，電擊轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌，并制備相應(yīng)菌液10ml，在轉(zhuǎn)化前一天，將菌液轉(zhuǎn)入含有200mlLB液體培養(yǎng)基(配方100ml:蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，Nacllg)的三角瓶中，置于28。C培養(yǎng)過夜，第二天使用時(shí)，農(nóng)桿菌液0D6。。=1.21.6。室溫5000rpm離心15分鐘，棄上清。將農(nóng)桿菌沉淀懸浮于相應(yīng)體積的滲透培養(yǎng)基里，使0D,二0.8左右。滲透培養(yǎng)基(1L)配方為1/2倍的MS培養(yǎng)基；5%蔗糖；0.5克MES;用KOH調(diào)至pH5.7，再加入10微升的6-BA溶液(lmg/ml)，200微升SilwetL-77。將植株倒置，讓花序浸入滲透培養(yǎng)基中5s后取出，用草紙吸干多余的液體，暗培養(yǎng)一天。培養(yǎng)3到4周后，收種子并放在干燥環(huán)境存放2周。3、轉(zhuǎn)化植株篩選將轉(zhuǎn)化后的種子春化48h后，均勻撒播在培養(yǎng)盒中，等到出苗后一周，用小噴壺噴灑除草劑Basta(1:1000稀釋)，讓每個(gè)植株都能沾上除草劑。兩天后再噴灑一次，共三次。因?yàn)閜EZT-NL質(zhì)粒帶有Bar基因，所以轉(zhuǎn)化成功的植株就帶有除草劑的抗性，而未轉(zhuǎn)化成功的植株就被除草劑殺死。最后獲得轉(zhuǎn)基因植株，因?yàn)閠tgl突變體沒有表皮毛，所以轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)表皮毛表型的恢復(fù)。4、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定擬南芥的TTG1基因已被證明影響植株表皮毛的起始，還影響著其它幾個(gè)代謝途徑，包括花青素代謝途徑、種皮黏液的產(chǎn)生及根毛發(fā)育的途徑。黃瓜的TTGl-like基因在蛋白質(zhì)水平與擬南芥的TTG1基因具有較高的同源性，可進(jìn)一步從表型對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定。轉(zhuǎn)基因植株后代表現(xiàn)為具有表皮毛，并且種皮顏色恢復(fù)為褐色(突變體為黃色)。利用載體上Bar基因的序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株，將轉(zhuǎn)基因植株和ler野生型、ttgl突變體用CTAB法提取基因組DNA，用Bar基因引物擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物為161bp。用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果為轉(zhuǎn)基因植株有預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，而對(duì)照ler野生型和ttgl突變體都沒有擴(kuò)增條帶(如圖1所示)。證明轉(zhuǎn)基因植株表型的恢復(fù)是黃瓜TTGl-like基因表達(dá)引起的。證明黃瓜TTGl-like基因具有與擬南芥TTGl基因相同的功能。實(shí)施例4、黃瓜TTGl-like基因在黃瓜中的拷貝數(shù)分析采用CTAB方法(ClarkMS.PlantmolecularBiology-ALaboratoryManual.Heidelberg:Springer-VerlagBerlin,1997.46)從黃瓜葉片中提取基因組DNA，用HindIII37。C酶切10ug基因組DNA過夜，向植物DNA酶解液中加入51溴酚藍(lán)混勻，取標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA樣品2y1，上樣，用1%的瓊脂糖凝膠分離，25V電泳16小時(shí)(1V/cm)。電泳后的凝膠在轉(zhuǎn)膜印跡前進(jìn)行以下幾個(gè)步驟脫嘌呤，將凝膠放入250mMHCl，室溫?cái)噭?dòng)10min;變性，將凝膠放入變性溶液(1.5MNaCl，0.5MNa0H)中，室溫?cái)噭?dòng)25min;中和，將凝膠放入中和溶液U.5MNaCl，0.5MTris-Cl，pH=7.5)中，室溫?cái)噭?dòng)30min。在每一處理中間均要用蒸餾水進(jìn)行漂洗。隨后的轉(zhuǎn)膜印跡的方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第二版》(J.薩姆布魯克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第二版.北京科學(xué)出版社，1999，474-490)。將DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上后，使用安法瑪西亞(AmershamPharmacia)公司的GeneImagesContentsCDP_Starlabellingmodule試劑盒(產(chǎn)品號(hào)為PRN3540)，將黃瓜TTGl-like基因編碼區(qū)標(biāo)記為探針，然后進(jìn)行雜交(6(TC雜交16h)，取出膜，置于洗膜液I(IXSSC，1%SDS)中，6(TC漂洗3次，每次15min。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1XSSC，1%SDS)中，60。C漂洗3次，每次15min。用X光片壓片90min，然后顯影、定影(方法參照RocheDIGlabeled試劑盒說明書)。Southernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)在雜交膜上出現(xiàn)兩條帶，說明該基因在黃瓜中拷貝數(shù)為2實(shí)施例5、黃瓜TTGl-like基因在黃瓜中的組織表達(dá)1、RNA的提取將生長(zhǎng)了35片葉的黃瓜幼苗的花芽、頂芽、根、莖、葉取下，按照上面提到的方法提取RNA，并用RNase-freeDNase酶進(jìn)行處理，除去RNA中的基因組DNA，然后進(jìn)行定量。2、反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈以黃瓜各組織的RNA為模板，(T)25(A/C/G)(A/C/G/T)為引物進(jìn)行，其余過程同上，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10u1加入40y1TE混勻，保存與-20'C備用o3、半定量RT-PCR分析在黃瓜TTGl-like基因的編碼區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，采用2XHotstartTaqPCRMasterMix(購(gòu)于TIANGEN公司)進(jìn)行RT-PCR分析。PCR體系lul反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，0.25uml/L正反向引物，1XHotstartTaqPCRMasterMix,總體系為20ixl。PCR反應(yīng)程序:94°C5min;94°C30s，65°C30s，72°Clmin，30個(gè)循環(huán)；72°C5min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以Actin為內(nèi)參，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察條帶的亮度。4、半定量RT-PCR結(jié)果顯示，黃瓜TTGl-like基因在黃瓜的各個(gè)組織中均有表達(dá)，且差異不明顯。本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分別如下(1)SEQIDNO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQIDNO.1A(C/T)M(C/T)AG(C/T)AA(A/G)AC(G/C/T)AGCGA(2)SEQIDNO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQIDNO.2CA(G/C)G(C/T)TG(C/T/A)G(A/C)AG(A/C)AGACC(3)SEQIDNO.3的信息<110>上海交通大學(xué)<120>黃瓜TTGl—like基因的蛋白編碼序列<160>2<210〉1<211〉1414<212>DNA<213>黃瓜(Cuc咖issativusL.)<221〉CDS<222>(160)…(1158)<400>1ATCCTCMCGCGTTCCACAATTTTTCCATTTCGTTTTTATTTTTCTGAGCAAAGCCATCG60TTCGACAGTCGCCATCTCGTCGGCGTTCCGTGTACCGATCATCAGTTCGTCCTTCATTGT120CTCTCTCAGTCTATTCCATCGTTCTTCGCTTTTGGMTCATGGMCACGCAGCCTCCAGA180TCCGAATTCTTGGCGACCTACGMTCTCCGCATCCTCTCTACGCCATGGCCATTTCTTCC240CCTCACGCACACTCTCTTMTTTCTCCAGTCGCATAGCGCTTGGCAGCTTCGTCGAAGAG300TACMCAACCGCGTCGACATTGTGTCTTTTGATCCAGATTCTATCTCCATTAMGCCAAT360CCTTCCCTCTCCTTTGAGCACCCCTACCCACCCACCAAGCTCATGTTCMTCCCAGTCCC420CTCTCCTCTCTCTTGGCCTCCTCCGGCGACTCTCTCCGCCTCTGGAAACTCGGAGATTCT480TCCATCGMCCCCTCTCCCTCCTCMCMCAGCAAAACCAGTGMTTCTGTGCCCCGTTA540ACTTCCTTCGACTGGMTGAAGTTGAGCCCAAGAGAATTGGMCCTCCAGTATTGACACC600ACTTGTACTATTTGGGACATTGAGMGAGTGTGGTGG嵐CCCAGTTCATAGCTCACGAC660AAAGAGGTTTATGACATTGCTTGGGGGGMGCCCGGGTTTTTGCTTCTGTTTCCGCTGAT720GGGTCGGTAAGGATTTTCGACATGAGAGATAAGGAGCACTCTACCATTATATACGAAAGC780CCCCMCCTGATACCCCTTTGCTCAGACTGGCATGGMCAAACAGGACCTGCGGTATATG840GCCACMTTCTGATGGACAGCMCMMTTGTTATTTTGGACATTCGCTCACCMGTGTG900CCGGTTGCTGMTTGGAGAGGCATCATTCCAGTGTCMTGCTATAGCCTGGGCGCCTCGG960AGCTGCAGGCATATTTGTTCCGCAGGGGATGACMGCAGGCCCTCATCTGGGAGCTGCCT1020ATGGTTGCAGGCCCCMTGGCATTGATCCAATGTCCATGTATTCTGCTGCATTTGAAATT1080AACCAGTTGCAGTGGTCTGCCGCCCMCCTGATTGGATTGCTTTAGCATTTTCCMCAM.1140ATGCAGCTTTTGAMGTTTGAGGACTGAGAACATTTTCCACTGTGCCTCTACCTACTGTG1200CATCTACTGTCATATCCTTACCTTTTGTTTTTCMTCACGTTATATAAGCCTGATGTCTT1260CCTATMGTTTAGTTTTACGTTAGTGCTAAGTTGTTACTAGGCTMTATAMTGTTGGTG1320CTTCTTCTGGCTMCAGACAACACATTCTATGTTAACTCGCTTGAATTCTTGAMTTCM1380TCAAAACTTAAGTAGGCCACTTTCTTGTTTMGC1414(4)SEQIDN0.4的信息<210>2〈211>333<212〉PRT<213>黃瓜(Cuc咖issativusL)〈400〉2MEHMSRSEFLATYESPHPLYAMAISSPHAHSLNFSSRIALGSFVEEYNNRVDIVSFDPD60SISIKANPSLSFEHPYPPTKLMFNPSPLSSLLASSGDSLRLWKLGDSSIEPLSLLNNSKT120SEFCAPLTSFDWNEVEPKRIGTSSIDTTCTITOIEKSVVETQFIAHDKEVYDIAWGEARV180FASVSADGSVRIFDMRDKEHSTIIYESPQPDTPLLRLATOKQDLRYMATILMDSNKIVIL240DIRSPSVPVAELERHHSSVNAIAWAPRSCRHICSAGDDKQALIWELPMVAGPNGIDPMSM300YSMFEINQLQWSMQPDWIALAFSNKMQLLKV33權(quán)利要求1、一種黃瓜TTG1-like基因的蛋白編碼序列，其特征在于，包括編碼具有黃瓜TTG1-like蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且該核苷酸序列具有SEQIDNO.3中從核苷酸第160-1158位的核苷酸序列有70％的同源性；或者所述核苷酸序列能在45-55℃條件下與SEQIDNO.3中從核苷酸第160-1158位的核苷酸序列雜交。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃瓜TTGl-like基因的蛋白編碼序列，其特征是，所述編碼序列具有SEQIDNO.4所示的氨基酸序列的多肽、或者保守性變異多肽、或者活性片段，或者活性衍生物。3、根據(jù)權(quán)利要求l或2所述的黃瓜TTGl-like基因的蛋白編碼序列，其特征是，該序列具有SEQIDN0.3中從核苷酸第160—1158位的核苷酸序列。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃瓜TTGl-like基因的蛋白編碼序列，其特征是，包含DNA分子中8—100個(gè)連續(xù)核苷酸。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的黃瓜TTGl-like基因的蛋白編碼序列，其特征是，DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明涉及的是一種基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
的黃瓜TTG1-like基因的蛋白編碼序列。包括編碼具有黃瓜TTG1-like蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且該核苷酸序列具有SEQIDNO.3中從核苷酸第160-1158位的核苷酸序列有70％的同源性；或者所述核苷酸序列能在45-55℃條件下與SEQIDNO.3中從核苷酸第160-1158位的核苷酸序列雜交。在黃瓜中克隆與擬南芥決定表皮毛起始的TTG1同源的基因，不僅將有利于理解植物表皮毛形態(tài)建成的分子機(jī)制，而且也將會(huì)有助于認(rèn)識(shí)黃瓜果刺這個(gè)重要品質(zhì)基因形成的分子機(jī)理，為黃瓜品質(zhì)育種提供理論依據(jù)，加快品種育種進(jìn)程。本發(fā)明也對(duì)植物花色的改良有重要作用，本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)C12N15/82GK101250534SQ20081003485公開日2008年8月27日申請(qǐng)日期2008年3月20日優(yōu)先權(quán)日2008年3月20日發(fā)明者何歡樂,媛關(guān),潤(rùn)蔡,趙俊龍,陶倩怡申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)