專利名稱：一種缺失的霍亂弧菌封閉帶毒素的表達(dá)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種缺失的霍亂弧菌封閉帶毒素的表達(dá)方法和應(yīng)用，屬于生物工 程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著生物技術(shù)的日益發(fā)展，越來(lái)越多的具有生理活性的多肽或蛋白質(zhì)分子 被發(fā)現(xiàn)，多肽和蛋白類藥物在現(xiàn)代疾病預(yù)防和治療中作用日益突出。至今，美國(guó) 已經(jīng)開(kāi)發(fā)生物多肽藥物300多個(gè)。但是，由于多肽分子難以透過(guò)生物膜，加之體內(nèi) 外穩(wěn)定性差、體內(nèi)生物利用度低，一般只能注射給藥?？诜┬鸵妆换颊呓邮?， 是多肽藥物非注射劑型的主要發(fā)展方向。相對(duì)于注射給藥，口服是一種方便并且 病人依從性比較高的給藥方式,對(duì)于需要長(zhǎng)期給藥的病人尤其方便。蛋白多肽類 藥物目前已有個(gè)別品種實(shí)現(xiàn)了口服給藥,如口服干擾素、胸腺肽、腦蛋白水解物 等。但是，由于藥物本身的結(jié)構(gòu)以及人體的吸收問(wèn)題,蛋白多肽類藥物口服生物利 用度很低。通常情況下，蛋白多肽類藥物分子量大，難以通過(guò)消化系統(tǒng)的生物膜 屏障；胃酸、消化道酶等對(duì)蛋白多肽類藥物有破壞、降解或聚合作用，嚴(yán)重影響 其穩(wěn)定性。因此,提高口服生物利用度是蛋白多肽類藥物口服給藥的關(guān)鍵。近年 來(lái),蛋白多肽類藥物的口服給藥技術(shù)研究不斷取得新進(jìn)展，為進(jìn)一步發(fā)揮其功效 提供了新的技術(shù)支撐。
霍亂弧菌封閉帶毒素Zonula Occludens Toxin,簡(jiǎn)稱Z0T，是美國(guó)科學(xué)家 Fasano等1991年采用Ussing Chambers分析法測(cè)定CT陰性和CT陽(yáng)性霍亂弧菌培養(yǎng) 物上清液時(shí)發(fā)現(xiàn)的、由399個(gè)氨基酸組成的一種毒素。它通過(guò)影響細(xì)胞間緊密連 接(tight junction,或稱封閉帶)，增加小腸粘膜的通透性。Z0T能可逆地調(diào) 節(jié)緊密連接的結(jié)構(gòu)，因而它能影響生物大分子物質(zhì)的吸收。但是封閉帶毒素為大 分子，易形成包涵體，難以通過(guò)基因工程技術(shù)獲得可溶性蛋白，為研究其生物學(xué) 功能增加了難度。缺失的霍亂弧菌封閉帶毒素(deletion Zonula OccludensToxin，cZ0T)，是Marinarosaria等通過(guò)缺失ZOT基因不同區(qū)域，分析發(fā)現(xiàn)的封閉 帶毒素活性中心，是封閉帶毒素的265 399位氨基酸片斷，具有封閉帶毒素的完 整生物學(xué)功能，能夠改變上皮細(xì)胞的通透性，促進(jìn)蛋白、激素等大分子藥物由黏 膜吸收，增強(qiáng)可溶性蛋白的生物學(xué)活性，而且這一作用可逆、安全，不損傷組織， 從而可能成為一種新穎、安全的多肽口服佐劑。由于其獨(dú)特的生物學(xué)性質(zhì)，使用 cZOT有可能開(kāi)辟一種新穎的生物大分子藥物口服給藥新途徑，給制藥工業(yè)及疫苗 工業(yè)展示了光明的前景.
但是，cZ0T有135個(gè)氨基酸，分子量大，目前技術(shù)條件下無(wú)法通過(guò)化學(xué)合成 的方法獲得；即使能夠化學(xué)合成，其合成成本高，純化困難。因此，需要一種高 效廉價(jià)的基因工程制備cZOT的方法。同時(shí)，由于該基因稀有密碼子含量較高(占 30%),而常規(guī)的大腸桿菌BL21(DE3)不提供稀有密碼子的翻譯，所以cZOT在 BL21(DE3)中表達(dá)含量較低。因此，我們利用Rosetta gami (DE3)對(duì)稀有密碼子 的偏愛(ài)性，選擇大腸桿菌Rosetta gami (DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以提高cZOT的表

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種cZOT的高效表達(dá)方法，以期利用該方法大規(guī)模低 成本地發(fā)酵生產(chǎn)cZOT。
本發(fā)明要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提出一種高效表達(dá)cZ0T的基因工程菌。該 基因工程菌是攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌Rosetta gami (DE3)，所述重組質(zhì)粒是 含cZ0T基因的質(zhì)粒pET-32a(+)。具體分以下幾個(gè)歩驟
1. 構(gòu)建含cZOT基因的大腸桿菌(￡coh')基因工程菌 將cZOT基因按照SD序列-純化標(biāo)簽His *Tag-硫氧還蛋白(Trx)-蛋白酶
(腸激酶EK)酶切位點(diǎn)-cZOT基因-終止密碼子(TAA)的堿基序列設(shè)計(jì)上游引物 和下游引物，PCR得到該片斷；用兩種限制性內(nèi)切酶Kpn I和EcoR I雙酶切該片 斷，得到cZ0T基因；用同樣兩種限制性內(nèi)切酶雙酶切質(zhì)粒pET-32a(+)，純化回 收大片段，連接上述兩種基因片段，得到重組質(zhì)粒pET-32a(+)-cZ0T;
2. 構(gòu)建高效表達(dá)cZ0T的基因工程菌
將重組質(zhì)粒pET-32a(+)-cZ0T轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta gami (DE3)感受態(tài) 細(xì)胞中，在含有氨芐青霉素(100ug/ml)、卡那霉素(15yg/ml)、四環(huán)素(12.5u g/ml)、氯霉素(34 u g/ml)中任意1-4種抗生素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16-20h， 挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，獲得高效表達(dá)cZOT的基因工程菌； 3.制備獲得TrxA-cZOT融合蛋白 將篩選出的高產(chǎn)菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600nm=0. 6 0. 8時(shí)，加入 終濃度為0. 6mM 1. OmM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 8小時(shí)，生產(chǎn)和積累可溶性表達(dá)的 TrxA-cZOT融合蛋白；離心收集菌體，用緩沖液重懸菌體，超聲破碎儀破菌后， 離心收集上清，進(jìn)行親和層析，收集TrxA-cZOT融合蛋白組分； 4.制備獲得cZOT
用腸激酶(EK)酶解TrxA-cZOT融合蛋白，23。C 25。C下裂解16 18h，冰 浴5min，終止反應(yīng)，再次進(jìn)行親和層析，收集穿透峰，冷凍干燥，得到cZOT。
本發(fā)明與已有技術(shù)相比較具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)(1)通過(guò)基因工程技術(shù)的方 法生產(chǎn)cZOT，提高了cZOT的表達(dá)量，降低了生產(chǎn)成本；(2)只要進(jìn)行一次親和 層析，便可從發(fā)酵液中得到較純的TrxA-cZOT融合蛋白，純化步驟簡(jiǎn)單；(3)只 要進(jìn)行一次酶解便能得到cZOT,得率高。


圖1是重組質(zhì)粒PET-32a(+)-cZOT的構(gòu)建示意圖。
圖2是cZOT的分離純化和酶切結(jié)果圖，其中1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量；2為 攜帶TrxA- cZOT的融合蛋白；3為TrxA-cZOT融合蛋白經(jīng)EK酶解；4為純 化后的cZOT。
圖3是cZOT促進(jìn)胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)降血糖實(shí)驗(yàn)。
圖4是cZ0T促進(jìn)胰島素(insulin)降血糖實(shí)驗(yàn)。
圖5是cZOT促進(jìn)血小板生成素(TPO)生成血小板實(shí)驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖，通過(guò)實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。說(shuō)明書和實(shí)施例中凡未注 明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按常規(guī)條件進(jìn)行。
實(shí)施例1 構(gòu)建大腸桿菌(Eco7/)表達(dá)載體pET-32a(+)-Trx-cZOT
第一步，cZ0T DNA序列的擴(kuò)增上坊,弓l物 cgggtaccga cgacgacgac aaggagcctc agtc 下游引物 ggaattctca aaatatacta tttagtcctt ttttatc 通過(guò)熱變性法從霍亂弧菌口服疫苗中提取基因組DNA，以該基因組DNA為模
板，加入Pyrobest DNA聚合酶和上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物用DNA Gel
Extraction Kit回收，獲得cZOT DNA片段； 第二步，含有cZOT基因的工程菌構(gòu)建
用Kpn I和EcoR I雙酶切cZOT ，純化回收大片段；用同樣的兩種酶雙酶切
質(zhì)粒pET-32a(+)，純化回收大片段；連接上述回收的兩個(gè)片段，得到重組質(zhì)粒
pET-32a(+) - cZ0T，將重組質(zhì)粒pET-32a(+)-cZOT轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta gami
(DE3),制得含cZOT DNA序列的基因工程菌，測(cè)序證實(shí)該基因工程菌含完整的重
組cZOT DNA基因片段；
下面是重組質(zhì)粒pET-32a(+)-cZOT的測(cè)序結(jié)果 Query 67
Sbjct 76
Query 127
186
Sbjct 136
Query 187
246
Sbjct 196
Query 247Sbjct 256
Query 307
Sbjct 316
Query 367
Sbjct 376
315
366
375
426
435
Query 427 CGCCTTGCTCCCGACAGCATTCCCAACAGTAGCCTTTGACTGAGGCTC 474
mimmimmmiiiimimmiimmiiMii
Sbjct 436 CGCCTTGCTCCCGACAGCATTCCCAACAGTAGCCTTTGACTGAGGCTC 483
實(shí)施例2 cZ0T的基因工程制備方法，即用所述的基因工程菌生產(chǎn)cZOT。 下述的親和層析介質(zhì)為NTA-0樹脂，購(gòu)自Novagen公司，下述的腸激酶(EK)， 購(gòu)自上海新生源生物醫(yī)藥有限公司。
第一步液體培養(yǎng)
將實(shí)施例1中構(gòu)建好的基因工程菌接種于20ml含氨節(jié)青霉素(100u g/ml)、 卡那霉素(15yg/ml)、四環(huán)素(12. 5ng/ml)、氯霉素(34wg/ml)中任意l-4 種抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C ， 210rpm，培養(yǎng)至0D600nm=l. (Tl. 2。按照5% 體積將上述菌液接種于400ml LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600nm=0. 6 1. 0。加終濃 度為0. 6mM~l. 0 raM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h 8h。將搖瓶冰浴5min, 7000rpm， 4°C， 離心5min收集菌體。加20mlIDA-0 Buffer重懸菌體，同時(shí)加入終濃度為lmM的 PMSF。超聲波破碎菌體，離心收集上清，SDS-PAGE證實(shí)cZOT在大腸桿菌中為可 溶性表達(dá)。
第二步純化TrxA-cZOT
上清用親和層析柱SNBC 3S NTA Resin分離純化得融合蛋白TrxA-cZOT 。 用5倍NTA體積的IDA-0 Buffer平衡NTA Resin。將樣品加到NTA Resin中， 分別用2倍NTA體積的IDA-0， IDA-20， IDA-40， IDA-60, IDA-80， IDA-100，IDA-200， IDA-500，5倍NTA體積的IDA-1000 Buffer洗脫，分別收集穿透部 分和各洗脫部分的洗脫液，用SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)洗脫情況。經(jīng)SDS-PAGE分析 含有融合蛋白的TrxA-cZOT組分的洗脫液，用截流分子量為5KD的超濾管脫鹽濃 縮，得到的TrxA-cZOT融合蛋白具有較高的純度。 第三步制備cZOT
融合蛋白TrxA-cZOT用EK蛋白酶酶切。按照每微升EK可以切開(kāi)150 u g融 合蛋白的劑量，23TT25。C酶切16 h 18 h，，得到了 TrxA和cZOT兩條條帶。 酶切產(chǎn)物用親和層析柱SNBC 3S NTA Resin分離。收集穿透峰和IDA-0的洗 脫峰。經(jīng)SDS- PAGE分析含有cZOT的洗脫液，用5KD的超濾管脫鹽濃縮，，得到 的cZOT具有較高的純度。
實(shí)施例3 cZOT在胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1) 口服給藥中的應(yīng)用
實(shí)驗(yàn)材料與方法
雌性健康昆明小鼠(清潔級(jí)，上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供)；
50%葡萄糖溶液，0. 9。/。NaCl溶液，GLP-1， TrxA-cZOT， cZOT; 血糖測(cè)試儀(上海新立醫(yī)療器械有限公司)；
雌性健康昆明小鼠禁食過(guò)夜，分為4組(n=8)。 1，生理鹽水對(duì)照組；2， GLP-l 口服對(duì)照組；3， TrxA-cZOT十GLP-1給藥組；4， cZOT+ GLP-1給藥組。
TrxA-cZOT+ GLP-1給藥組灌胃給予200 w 1 50%葡萄糖溶液、800nmol/kg TrxA-cZOT和500咖ol/kgGLP-l，記此時(shí)為零時(shí)刻。分別于30、 60、 90、 120分 鐘進(jìn)行小鼠尾靜脈取血lOul,用血糖測(cè)試儀測(cè)定血糖濃度。cZOT+ GLP-l給藥 組灌胃給予相同劑量的葡萄糖、cZOT和GLP-1;生理鹽水對(duì)照組只灌胃葡萄糖和 生理鹽水；GLP-1對(duì)照組只灌胃葡萄糖和GLP-1，按照相同時(shí)間間隔測(cè)定血糖。
與對(duì)照組相比，在給藥后30 120分鐘，給藥組都能夠降低小鼠血糖，說(shuō)明 按本發(fā)明方法制備出的TrxA-cZOT、cZOT具有促進(jìn)GLP-1 口服吸收的生物學(xué)活性。
實(shí)施例4 cZOT在胰島素(Insulin)降血糖實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用
采用雌性健康昆明鼠，注射200mg/kg四氧嘧啶建立糖尿病模型，7天后禁 食12h，血糖Ml. lmmol/1者，確認(rèn)為成模鼠。按照實(shí)施例3將模型鼠分為4組 1,生理鹽水對(duì)照組；2，胰島素口服對(duì)照組；3， TrxA-cZOT+胰島素(Ins)給藥 組；4， cZOT+胰島素(Ins)給藥組。TrxA-cZ0T+Ins給藥組灌胃給予600nmol/kg TrxA-cZ0T和600nmol/kg Ins， 分別于30、 60、 90、 120分鐘進(jìn)行小鼠尾靜脈取血10iU，用血糖測(cè)試儀測(cè)定血 糖濃度。cZOT+Ins給藥組灌胃給予相同劑量的cZOT和Ins;生理鹽水對(duì)照組只 灌胃生理鹽水；Ins對(duì)照組只灌胃Ins，按照相同時(shí)間間隔測(cè)定血糖。
與對(duì)照組相比，在給藥后90分鐘內(nèi)，給藥組都能夠降低小鼠血糖，說(shuō)明按 本發(fā)明方法制備出的TrxA-cZOT、 cZOT具有促進(jìn)Ins 口服吸收的生物學(xué)活性。
實(shí)施例5 cZOT在血小板生成素(TPO)促進(jìn)血小板生成實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用
采用雄性健康昆明鼠，尾靜脈取血5y 1，置于195 ix 1血小板計(jì)數(shù)液中稀釋， 37。C孵育30min，相差顯微鏡下計(jì)數(shù)血小板個(gè)數(shù)，以此為基礎(chǔ)值分為2組1， TPO 口服對(duì)照組；2， cZOT+TPO給藥組。給藥組第1 5天每天灌胃700nmol/kg cZOT 和5mg/kgTP0—次；TPO對(duì)照組灌胃5呢/kg TPO，其他同給藥組。分別于第3、 4、 5、 7、 9天進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。
連續(xù)給藥3天起，與對(duì)照組相比，給藥組能夠促進(jìn)小鼠血小板的生成，說(shuō)明 按本發(fā)明方法制備出的cZOT具有促進(jìn)TPO 口服吸收的生物學(xué)活性。序列表副本
SEQUENCE LISTING
<110>華東師范大學(xué)
<120> —種缺失的霍亂弧菌封閉帶毒素的表達(dá)方式及應(yīng)用
<130> Zonula occludens toxin structure-function analysis.
Identification of the fragment biologically active on tight junctions and of the zonulin receptor binding domain.
<140> 2008100351981 <141> 2008-03-26
<腸 1
<170> Patentln version 3.2
〈210〉 1
<211> 408
〈212> DNA
<213> Vibrio cholerae
<400> 1
atgcctcagtcaaaggctactgctgggaatgctgtcgggagcaaggcggttgctcctgcg60
tcttttggtttttgtattggtcggctttgtgtccaagatggttttgtcactgttggtgat120
gagcgttatcgcctcgtagacaatttggacattccttatcgtggtctatgggcgacaggt180
catcacatttgcttacggtgttttttgaaaccg,gtggcagcgtccca240
ttgcatcgagctaccgctacaaggtgctaccgttgccggatttcaatcac300
tttgtggtgttcgatacctttgcagcgcaagcgctgtgggt卿agtgagacggggtUa360
ccg由aaaacagaa肪tg3taaaa幼ggactaaatagtatattttga408
權(quán)利要求
1. 一種缺失的霍亂弧菌封閉帶毒素的表達(dá)方法，其特征在于包括以下幾個(gè)步驟第一步構(gòu)建含cZOT基因的大腸桿菌(E.coli)基因工程菌采用下列上游引物和下游引物克隆cZOT基因上游引物 cgggtaccga cgacgacgac aaggagcctc agtc下游引物 ggaattctca aaatatacta tttagtcctt ttttatcPCR得到該片斷；用限制性內(nèi)切酶Kpn I和EcoR I雙酶切該片斷，得到cZOT基因；用同樣兩種限制性內(nèi)切酶雙酶切質(zhì)粒pET-32a(+)，純化回收大片段，連接上述兩種基因片段，得到重組質(zhì)粒pET-32a(+)-cZOT；第二步構(gòu)建高效表達(dá)cZOT的基因工程菌將重組質(zhì)粒pET-32a(+)-cZOT轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta gami(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，在含有抗生素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16-20h，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，獲得高效表達(dá)cZOT的基因工程菌；第三步制備獲得TrxA-cZOT融合蛋白將篩選出的高產(chǎn)菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600nm＝0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.6mM～1.0mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4～8小時(shí)，生產(chǎn)和積累可溶性表達(dá)的TrxA-cZOT融合蛋白；離心收集菌體，用緩沖液重懸菌體，超聲破碎儀破菌后，離心收集上清，進(jìn)行親和層析，收集TrxA-cZOT融合蛋白組分；第四步制備獲得cZOT用腸激酶(EK)酶解TrxA-cZOT融合蛋白，23℃～25℃下裂解16～18h，冰浴5min，終止反應(yīng)，再次進(jìn)行親和層析，收集穿透峰，冷凍干燥，得到cZOT。
2. 如權(quán)利要求1所述的缺失的霍亂弧菌封閉帶毒素的表達(dá)方法，其特征在 于抗生素的LB固體培養(yǎng)基為氨芐青霉素(100ug/ml)、卡那霉素(15iig/ml)、四環(huán)素(12.5ug/ml)、氯霉素(34yg/ml)中任意1種或者一種以上。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1制備的cZOT蛋白在制備胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)口服 給藥中的應(yīng)用。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1制備的cZOT蛋白在制備cZOT蛋白在胰島素(insulin,Ins) 口服給藥中的應(yīng)用。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l制備的cZOT蛋白在制備cZOT蛋白在血小板生成素(TPO) 口服給藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種缺失的霍亂弧菌封閉帶毒素的表達(dá)方法和應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。首先，構(gòu)建含cZOT基因的大腸桿菌(E.coli)基因工程菌，接著構(gòu)建高效表達(dá)cZOT的基因工程菌，制備獲得TrxA-cZOT融合蛋白，純化得cZOT。本發(fā)明與已有技術(shù)相比較提高了cZOT的表達(dá)量，降低了生產(chǎn)成本；只要進(jìn)行一次親和層析，便可從發(fā)酵液中得到較純的TrxA-cZOT融合蛋白，純化步驟簡(jiǎn)單，得率高。
文檔編號(hào)C12N15/31GK101440369SQ200810035198
公開(kāi)日2009年5月27日 申請(qǐng)日期2008年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月26日
發(fā)明者吳葉林, 吳自榮, 張緒英, 靜 李, 娟 顧, 馬驍駿, 靜 黃 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)