專利名稱：小核糖核酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種小核糖核酸及其相關(guān)應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌是東南亞和南非的最常見腫瘤之一，其死亡率也非常高。人類疾病很多是由于一些基因表達(dá)紊亂或失控所引起的。小核糖核酸(小RNA， microRNA，miRNA)是一類長度約21-25nt的不編碼蛋白質(zhì)的單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，通過核酸序列互補性結(jié)合到特定的靶mRNA上來調(diào)節(jié)靶mRNA翻譯或降解耙mRNA,是一種起負(fù)調(diào)控作用的分子。目前研究顯示許多miRNA參與了生物體發(fā)育、分化、生長、免疫應(yīng)答等生理過程，且其表達(dá)及功能失調(diào)可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，白血病以及病毒感染等多種病理現(xiàn)象。
盡管目前有報道顯示miRNA可能在生物體發(fā)育、腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用。本領(lǐng)域仍然迫切需要了解在肝癌中的miRNAs表達(dá)譜，更需要了解與肝癌預(yù)后有關(guān)的miRNA表達(dá)譜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種小核糖核酸的用途。本發(fā)明的另一個目的是提供一種探針。
本發(fā)明的再一個目的是提供上述探針的用途，所述用途是制備輔助性檢測肝癌預(yù)后的試劑盒。
本發(fā)明的第四個目的是提供一種體外非診斷性檢測核酸樣品中小核糖核苷酸的方法。
本發(fā)明的第五個目的是提供一種輔助檢測肝癌預(yù)后的方法。本發(fā)明的第六個目的是提供一種篩選與肝癌預(yù)后的小核糖核苷酸表達(dá)譜相關(guān)的潛在物質(zhì)的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種小核糖核酸的用途，其中所述的小核糖核酸序列如SEQ IDNO: 1所示的寡核苷酸，所述的小核糖核酸可用于制備輔助檢測肝癌預(yù)后的試劑或試劑盒。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑是特異性地針對小核糖核酸的探針。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種試劑盒，所述的試劑盒含有特異性地針對序列如SEQ ID NO: 1所示的小核糖核酸的探針和說明書。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種探針的用途，所述探針用于制備輔助檢測肝癌預(yù)后的試劑盒；所述的探針特異性地針對序列如SEQ ID NO: 1所示的小核糖核酸。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種體外非診斷性檢測核酸樣品中小核糖核苷酸的方法，所述方法包括步驟
(i) 將核酸樣品與特異性地針對小核糖核酸的探針接觸，所述小核糖核酸的序列如SEQ ID NO: 1所示；
(ii) 根據(jù)樣品與小核糖核酸的探針的雜交情況，獲得所述小核糖核酸的表達(dá)譜。
在另一優(yōu)選例中，所述的探針位于芯片上。在另一優(yōu)選例中，所述的核酸樣品是抽提核酸。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種體外非診斷性輔助檢測肝癌預(yù)后的方法，
所述方法包括步驟
(i) 將待檢體系和含有特異性地針對小核糖核酸的探針接觸，所述小核糖核酸的序列如SEQ ID NO: 1所示；
(ii) 觀察待檢體系與所述探針的雜交情況，其中，如果所述待檢體系可與探針雜交，則表明該待檢體系存在肝癌預(yù)后佳的可能性；
所述待檢體系選自組織、細(xì)胞體系、或抽提的核酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種篩選候選物質(zhì)的方法，所述方法包括步驟(a)將待篩選物質(zhì)與實驗組的肝癌細(xì)胞培養(yǎng)物接觸，然后檢測所述肝癌細(xì)胞中小核糖核酸，其中所述的小核糖核酸的序列如SEQ ID NO: 1所示，從而獲得實驗組肝癌細(xì)胞中所述小核糖核苷酸的表達(dá)譜；
(b)將實驗組肝癌細(xì)胞中所述小核糖核苷酸的表達(dá)譜與空白對照組表達(dá)譜
及正常肝細(xì)胞中所述小核糖核苷酸的表達(dá)譜進行比較，所述空白對照組表達(dá)譜是來自不加入待篩選物質(zhì)的肝癌細(xì)胞培養(yǎng)物；
其中，如果實驗組表達(dá)譜與空白對照組表達(dá)譜的一致率<70%，說明該待篩選物質(zhì)是與肝癌預(yù)后的小核糖核苷酸表達(dá)譜相關(guān)的潛在物質(zhì)，可以作為進一步篩選的基礎(chǔ)；較佳地， 一致率<50%，更佳地， 一致率<20%。
據(jù)此，本發(fā)明提供了在肝癌中的miRNAs表達(dá)譜，進一步地，提供了與肝癌預(yù)后有關(guān)的miRNA表達(dá)譜。


圖1顯示了 Kalplan-Meier生存分析的結(jié)果；其中
A是肝癌組織中HsaiiR-125b的表達(dá)水平；
B是hsa-mir-125b的表達(dá)與肝硬化狀態(tài)對肝癌預(yù)后的影響情況。
具體實施例方式
發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，驚奇地發(fā)現(xiàn)了一種miRNA，該miRNA (如SEQ ID NO: l所示序列)的表達(dá)與肝癌患者的預(yù)后有關(guān)。
M濯A IDSEQUENCESEQ ID NO:
hsa-miR-125bUCCCUGAGACCCUAACUUGUGASEQ IDNO:l
基于本發(fā)明的上述新發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完成了一系列的發(fā)明，例如但不限于
1、 獲得一種能特異性地同SEQ ID NO: 1所示序列的miRNA結(jié)合的探針；
2、 制備一種用于輔助性檢測肝癌預(yù)后的試劑或試劑盒；
4、 檢測能同SEQ ID NO: 1所示序列的miRNA特異性結(jié)合的物質(zhì)的方法；
5、 用于初步評估相關(guān)人群的肝癌治療藥物、藥物療效、預(yù)后，以及選擇合適的治療方法；
6、 獲得一種基因芯片(微列陣芯片)，芯片上含有能特異性地同SEQ ID NO:1所示序列的miRNA結(jié)合的探針。
6本發(fā)明包括可用于檢測miRNA的表達(dá)水平，進而輔助性檢測肝癌預(yù)后的試劑盒，所述的試劑盒中可包括特異性地針對miRNA的探針。優(yōu)選的，所述探針攜帶可檢測信號。所述的探針可固定在微陣列(raicroarray)或基因芯片上。
本發(fā)明還涉及定量和定性檢測miRNA水平，從而判斷肝癌預(yù)后的試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的，例如包括(但不限于)實時熒光定量PCR，聚類分析，非參數(shù)Mann-Whitney檢驗，Spearman相關(guān)性分析等。
一種檢測待測組織或樣品中是否存在所述miRNA及其存在量的方法是利用實時熒光定量PCR進行檢測，它包括制備hsa-miR-125b的特異性探針(所述探針優(yōu)選攜帶可檢測信號)，制備hsa-miR-125b的特異性引物，進行PCR，然后通過檢測PCR結(jié)束后的可檢測信號的強弱來判斷所述miRNA的水平。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，基于TaqMan熒光技術(shù)，即以TaqMan熒光探針為基礎(chǔ)進行檢測。TaqMan熒光探針為一種寡核苷酸，其兩端分別標(biāo)記一個熒光發(fā)射基團(作為可檢測信號)和一個熒光淬滅基團。當(dāng)探針完整時，熒光發(fā)射基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5' -3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團和熒光淬滅基團分離，從而通過熒光檢測系統(tǒng)可接受到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，即熒光信號的累計與PCR產(chǎn)物形成的完全同步，從而實現(xiàn)定性和定量。
所述的小核糖核酸特異性的引物和/或探針也包含在本發(fā)明內(nèi)，用于檢測樣品中是否存在所述小核糖核酸及其存在量，從而用于輔助性判斷受試者肝癌的預(yù)后情況。所述的探針可固定在微陣列(microarray)或基因芯片上，用于分析組織或樣品中miRNA的差異表達(dá)分析和基因診斷。
本發(fā)明提供的芯片含有特異性地針對miRNA的探針，所述miRNA如SEQ ID NO:1所示序列。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，提供一種篩選方法，所述的方法包括將候選物質(zhì)與如SEQ ID NO: 1所示序列的探針接觸；觀察候選物質(zhì)與所述探針的雜交情況，其中，若所述候選物質(zhì)可與探針雜交，則表明該候選物質(zhì)是與肝癌預(yù)后有關(guān)的潛在物質(zhì)。
更優(yōu)選的，可通過設(shè)置對照組來觀察候選物質(zhì)與所述探針的雜交情況；所述對照組是不添加所述候選物質(zhì)的體系。本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于-
1、 首次揭示和證明了一類小核糖核酸與肝癌預(yù)后密切相關(guān)，找到了可作為輔助性判斷肝癌預(yù)后的重要生物標(biāo)志物，為該疾病的防治提供了新的靶點；
2、 首次揭示如SEQ ID NO: 1所示序列的miRNA同肝癌預(yù)后的相關(guān)性，為
相關(guān)疾病的防治提供了有效途徑；
3、 本發(fā)明人分析了大量的肝癌患者中小核糖核酸的水平，并與正常人作了細(xì)致的比較，因此結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
下面將結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例1
肝癌預(yù)后驗證實施例材料與方法
病例組織
78對癌和癌旁組織來自于原發(fā)性肝癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本，這些標(biāo)本去自于浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科和啟動肝癌研究所。IO例正常肝來自意外死亡者。所取得所有組織標(biāo)本均通過上海市政府授權(quán)的世界衛(wèi)生組織合作組織倫理委員會的同意。手術(shù)切除標(biāo)本均經(jīng)過了病理學(xué)分析，病理分級依照Edmonson標(biāo)準(zhǔn)。臨床資料包括年齡、性別、腫瘤大小、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝硬化狀態(tài)、HBV和HCV感染情況，這些資料都來自于患者的病例記錄。所有患者術(shù)前都沒有接受化療，術(shù)后隨訪最長達(dá)68個月。MicroRNA芯片
探針設(shè)計針對成熟miRNAs序列，miRNAs序列從sanger數(shù)據(jù)庫下載(http://microrna-sanger.ac.uk; miRBase Release 7.0， accessed June,2005).靶序列包含人類miRNAs 435個，122個預(yù)測miRNAs序列和75個大鼠和小鼠的序列，總計芯片上包括了 509個靶向于成熟miRNAs探針。除此之外我們設(shè)計了 8個己知的RNA沒有互補結(jié)合的寡核苷酸序列作為陰性對照。其它的耙miRNAs探針釆用Ambion公司的mi腿Probe Construction Kit (Ambion,Austin, TX USA)合成。
RNA抽提和樣品準(zhǔn)備
富含miRNA的用Ambion公司的miRNAs抽提試劑盒抽提獲得，具體操作按照相應(yīng)說明書小RNA。樣品用T4 RNA連接酶標(biāo)記步驟依照Thomson'的方法(11)。簡而言之，4 小RNA和500 ng 5'-磷酸鹽-胞嘧啶-尿嘧啶-cy3-3， (Dharmacon， Chicago, USA)及2單位2 units T4 RNA ligase (NEB,Ipswich, USA),于4'C孵育2小時，對miRNA進行標(biāo)記。每份miRNA樣品均設(shè)等量的相應(yīng)陰性對照。標(biāo)記的RNA用0.3 M醋酸鈉和2. 5體積乙醇進行沉淀，再用15 W含3XSSC、 0.2% SDS和15%甲酰胺的雜交液重懸，所有的雜交重復(fù)兩次，雜交用LifterSlip (Erie, PA USA)以保證雜交液在芯片和蓋片之間均勻流動。將雜交室放在雜交儀BioMixer II上(CapitalBio Corp， Beijing,China)于42'C水浴雜交過夜，之后用洗液洗兩遍。
實時RT-PCR驗證芯片結(jié)果
RNA樣品用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA (AppliedBiosystems， Foster, USA)。我們用ABI公司合成的miRNA和U43 MGB探針檢測PCR產(chǎn)物，以U43作為內(nèi)參進行相對定量分析。每個逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用1-10 ngmiRNA，耙基因和U43在同一反應(yīng)體系中進行逆轉(zhuǎn)錄。相對定量real-time PCR反應(yīng)用ABI 7300系統(tǒng)進行反應(yīng)(Applied Biosystems, Foster, USA)。本研究運用looped-primer進行特異的逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)確保檢測的目的基因僅為成熟miRNAs。生存分析
我們進一步用單變量cox風(fēng)險回歸模型分析了癌與癌旁有差異的microRNAs與預(yù)后的關(guān)系。以microRNAs在75例具有完整隨訪資料的病例中表達(dá)值的中位數(shù)為界分為microRNAs表達(dá)高與低兩組，之后用Kaplan-Meier生存分析法分析這兩組患者的的生存情況與該microRNA表達(dá)有無關(guān)系。
結(jié)果
MicroRNA表達(dá)譜與肝癌病人術(shù)后生存期的相關(guān)性
在芯片檢測的78例肝癌患者中，其中75例有完整的隨訪資料。發(fā)明人用單變量COX風(fēng)險回歸模型分析69個在癌和癌旁差異的miRNAs在75例肝癌組織中表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)hsa-mir-125b表達(dá)較高的肝癌患者術(shù)后生存時間相對較長，風(fēng)險比為1.787， 95%可信區(qū)間為1.020-3.133, p=0. 043。并且hsa-mir-125b的表達(dá)與肝硬化狀態(tài)對肝癌預(yù)后的影響有一定的協(xié)同作用，即hsa-mir-125b高表達(dá)，且無肝硬化的肝癌患者預(yù)后最好，而hsa-mir-125b低表達(dá)，且有肝硬化的肝癌患者預(yù)后最差，hsa-mir-125b高表達(dá)但有肝硬化，與hsa-mir-125b低表達(dá)但無肝硬化的肝癌患者的預(yù)后無明顯差異，處于最好和最差之間，詳見圖1。
實施例2
肝癌預(yù)后檢測試劑盒
如實施例1所述，如序列SEQ ID NO: 1所示的小核糖核酸與肝癌預(yù)后密切相關(guān)。因此，可基于這個抽提病人的miRNA進行檢測。
隨機挑選30個人構(gòu)成的測試組，其中包括未知肝癌預(yù)后情況的對象和己知肝癌預(yù)后情況的病人。
獲得測試組中待檢測對象的肝組織切片，使用如實施例1的方法抽提RNA和制備檢測樣品。
RNA樣品用Applied Biosystems公司的TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用特異的，帶有頸環(huán)的引物進行逆轉(zhuǎn)錄，以保證實時PCR時僅檢測到成熟miRNAs。每個逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用1-10 ng RNA，耙基因和U43在同一反應(yīng)體系中進行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系如下:
IOX逆轉(zhuǎn)錄緩沖液(reverse buffer)核糖核酸酶抑制劑(Rnase inhibitor)
0. 2ii 1
1. 5u 1
逆轉(zhuǎn)錄酶(Transcribe reverse transcriptase)
lOOmM dNTP混合物(dNTP mix)逆轉(zhuǎn)錄引物混合物(RT primer mix)
0. 15u 1
各lii 1
RNA樣品加水至15 p 1
發(fā)明人用ABI公司合成的MGB探針檢測PCR產(chǎn)物(MGB探針序列為hsa-miR-125b UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA),以U43作為內(nèi)參進行相對定量分析。相對定量實時PCR反應(yīng)用ABI 7300系統(tǒng)進行反應(yīng)。每個樣品重復(fù)三個孔。如下反應(yīng)體系在95'C預(yù)變性5min，之后9 5'C變性30s, 60。C lmin，40個循環(huán)。
反應(yīng)體系如下
2X實時PCR混合物(real time PCR mix) 10u 1
檢測結(jié)果
對于SEQ ID NO: 1和表達(dá)較高的的對象，進一步隨訪了解其術(shù)后生存情況。
檢測結(jié)果表明，SEQ ID NO: 1表達(dá)越高的檢測對象其肝癌術(shù)后存活期明顯長于表達(dá)低的人群。
因此，這表明通過本發(fā)明提供的芯片和試劑盒，可進行肝癌預(yù)后的輔助性
引物逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加水至20 u 1
1. 3u 1判斷。實施例3
肝癌預(yù)后輔助性檢測
重復(fù)實施例2的檢測，不同點在于隨機選取了 IO個人(檢測前不知道肝癌預(yù)后情況)進行檢測。
結(jié)果同樣證實了， SEQ ID NO: 1和表達(dá)越高的檢測對象其肝癌術(shù)后存活期明顯長于表達(dá)低的人群。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表
<110> h海市腫瘤研究所<120〉小核糖核酸及其應(yīng)用<130> 081099<160> 1
<170〉 Patentln version 3. 3
<210> 1<211> 22<212〉 腿
<213> 智人(Homo Sapiens)<400> 1
ucccugagac ccuaacuugu ga 22
1權(quán)利要求
1.一種小核糖核酸的用途，其中所述的小核糖核酸序列如SEQ ID NO1所示的寡核苷酸，其特征在于，用于制備輔助檢測肝癌預(yù)后的試劑或試劑盒。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的試劑是特異性地針對小核 糖核酸的探針。
3. —種試劑盒，其特征在于，它含有特異性地針對序列如SEQ ID N0: 1所示 的小核糖核酸的探針和說明書。
4. 一種探針的用途，其特征在于，所述探針用于制備輔助檢測肝癌預(yù)后的試 劑盒；所述的探針特異性地針對序列如SEQ ID NO: 1所示的小核糖核酸。
5. —種體外非診斷性檢測核酸樣品中小核糖核苷酸的方法，其特征在于，所 述方法包括步驟(i) 將核酸樣品與特異性地針對小核糖核酸的探針接觸，所述小核糖核酸 的序列如SEQ ID NO: 1所示；(ii) 根據(jù)樣品與小核糖核酸的探針的雜交情況，獲得所述小核糖核酸的 表達(dá)譜。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的探針位于芯片上。
7. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的核酸樣品是抽提核酸。
8.一種體外非診斷性輔助檢測肝癌預(yù)后的方法，其特征在于，所述方法包括步驟(i) 將待檢體系和含有特異性地針對小核糖核酸的探針接觸，所述小核糖 核酸的序列如SEQ ID NO: 1所示；(ii) 觀察待檢體系與所述探針的雜交情況，其中，如果所述待檢體系可 與探針雜交，則表明該待檢體系存在肝癌預(yù)后佳的可能性；所述待檢體系選自組織、細(xì)胞體系、或抽提的核酸。
9.一種篩選候選物質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法包括步驟(a) 將待篩選物質(zhì)與實驗組的肝癌細(xì)胞培養(yǎng)物接觸，然后檢測所述肝癌細(xì)胞中小核糖核酸，其中所述的小核糖核酸的序列如SEQ ID NO: 1所示，從而 獲得實驗組肝癌細(xì)胞中所述小核糖核苷酸的表達(dá)譜；(b) 將實驗組肝癌細(xì)胞中所述小核糖核苷酸的表達(dá)譜與空白對照組表達(dá)譜 及正常肝細(xì)胞中所述小核糖核苷酸的表達(dá)譜進行比較，所述空白對照組表達(dá)譜是來自不加入待篩選物質(zhì)的肝癌細(xì)胞培養(yǎng)物；其中，如果實驗組表達(dá)譜與空白對照組表達(dá)譜的一致率<70%，說明該待篩選物質(zhì)是與肝癌預(yù)后的小核糖核苷酸表達(dá)譜相關(guān)的潛在物質(zhì)，可以作為進一 步篩選的基礎(chǔ)；較佳地， 一致率<50%，更佳地， 一致率<20%。
全文摘要
本發(fā)明公開了與肝癌預(yù)后有關(guān)的特異性表達(dá)的小核糖核酸，本發(fā)明還公開了有關(guān)該小核糖核酸的用途，例如含有特異性地針對所述小核糖核酸的探針，用于預(yù)測肝癌預(yù)后的輔助性檢測試劑或試劑盒等。
文檔編號C12Q1/68GK101555518SQ200810035839
公開日2009年10月14日 申請日期2008年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月10日
發(fā)明者萬大方, 何祥火, 李文晰, 楊勝利, 顧健人 申請人:上海市腫瘤研究所