專利名稱：內(nèi)切木聚糖酶的仿生親和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的規(guī)?；苽浞椒?，特別是一種內(nèi)切木聚 糖酶的仿生親和純化方法。
技術(shù)背景p-1， 4-內(nèi)切木聚糖酶(亦稱之為e-1， 4-木聚糖水解酶，EC 3.2.1.8)是一 種能夠降解生物質(zhì)原料中半纖維素組分生成聚合度大大降低的寡聚木糖，直至三 聚木糖、二聚木糖和單分子木糖，在造紙工業(yè)、動物飼料行業(yè)、面包制作、飲 料和釀酒工業(yè)、以及正在發(fā)展的生物質(zhì)綠色化工和生物質(zhì)能源行業(yè)都有重要用 途。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Damiano等人發(fā)表在《Appl Biochem Biotechnol》(《應(yīng)用生物化學(xué)和生物技術(shù)》，2006年129-132巻289-302頁) 上發(fā)表了題為"Purification and characterization of two xylanases from alkalophilic and thermophilic Bacillus licheniformis 77_2，， ("耐堿嗜 熱細(xì)菌中兩種木聚糖酶的純化和鑒定")的論文，提出如下內(nèi)切木聚糖酶制備的 技術(shù)方案細(xì)菌培養(yǎng)液首先過G-75凝膠過濾處理、再依次過CM-s印hadex和Q s印harose離子交換層析操作，最終獲得內(nèi)切-0-1， 4 -D-木聚糖酶。與文獻(xiàn)報 道的其它內(nèi)切木聚糖酶純化方法類似，該方法采用多種分離方法組合，操作步 驟多，生產(chǎn)過程長且復(fù)雜，消耗人力、試劑、能源大，設(shè)備利用率低；尤其是 使用凝膠過濾操作每個循環(huán)處理量少，效率低、難于規(guī)模化制備。因此需要發(fā)展 先進(jìn)高效純化生產(chǎn)方法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種內(nèi)切木聚糖酶的仿生親和 純化方法，能夠簡捷、批量純化制備內(nèi)切木聚糖酶。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明以內(nèi)切木聚糖酶專用親和分離材 料作為基礎(chǔ)，其步驟如下第一步，制備仿生親和分離材料仿生親和分離材料是通過三氮嗪結(jié)構(gòu)骨架作為間臂依次固定對氨基苯磺酸 和L-色氨酸兩個基團(tuán)，首先用三氯三氮嗪活化的基礎(chǔ)層析介質(zhì)(二氯三氮嗪-介 質(zhì))與對氨基苯磺酸反應(yīng)得到胺對苯磺酸一氯三氮嗪-介質(zhì)，再與L-色氨酸反應(yīng)， 得到胺對苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介質(zhì)，稱為仿生親和分離材料，這種仿生親和 分離材料的關(guān)鍵是對氨基苯磺酸和L-色氨酸兩個基團(tuán)通過三氮嗪結(jié)構(gòu)骨架組合 到基礎(chǔ)層析介質(zhì)上；所述反應(yīng)得到胺對苯磺酸一氯三氮嗪-介質(zhì)，其反應(yīng)溫度為5(TC。所述再與L-色氨酸反應(yīng)，其反應(yīng)溫度為95。C。所述基礎(chǔ)層析介質(zhì)是葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖一N， N'-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚分離材料、甲基丙烯酸聚合分離材料、瓊脂糖凝膠、 交聯(lián)瓊脂糖凝膠，瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺一瓊脂糖復(fù)合物珠、 纖維素珠或涂有化學(xué)活性基團(tuán)的硅膠中的一種。所述的仿生親和分離材料，其配體結(jié)構(gòu)含對胺基苯磺酸結(jié)構(gòu)和L-色氨酸結(jié)構(gòu)。第二步，用仿生親和分離材料純化纖維素酶粗品將內(nèi)切木聚糖酶粗品直接上樣至用結(jié)合緩沖液預(yù)平衡的裝有仿生親和分離 材料的層析柱中，清洗去除未結(jié)合雜質(zhì)組分，再用洗脫緩沖液從柱中洗脫內(nèi)切木 聚糖酶，獲得內(nèi)切木聚糖酶純品。所述結(jié)合緩沖液pH5. 0-10. 0。所述洗脫緩沖液pH2. 0-10.0，含NaCl 0. 0 - 1.0M NaCl。所述的內(nèi)切木聚糖酶，其原料為天然微生物發(fā)酵，或通過基因工程技術(shù)改造 的微生物發(fā)酵液，或菌體破碎液，包括Hypocrea jecorina發(fā)酵液。本發(fā)明的仿生親和分離材料上的化學(xué)基團(tuán)能夠與內(nèi)切木聚糖酶分子發(fā)生高 度特異的非共價和可逆的識別和結(jié)合，內(nèi)切木聚糖酶與分離材料接觸時，能夠與 該化學(xué)基團(tuán)結(jié)合吸附在分離材料上，未結(jié)合的雜質(zhì)被平衡緩沖液清洗被除去。再 用不同緩沖液條件，如鹽種類、濃度、酸堿度將吸附在分離材料上的內(nèi)切木聚糖 酶特異解離洗脫，從而制備高純度的內(nèi)切木聚糖酶。本發(fā)明克服了現(xiàn)有內(nèi)切木聚糖酶純化技術(shù)中操作步驟多，生產(chǎn)過程長且復(fù)雜，消耗人力、試劑、能源大，設(shè)備利用率低的缺點，實現(xiàn)了步驟少、生產(chǎn)周期 短、效率高、成本低的優(yōu)勢，能夠快速、簡便、批量純化制備內(nèi)切木聚糖酶。
具體實施方式
以下對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明本實施例以本發(fā)明技術(shù)方案為前提進(jìn)行 實施，給出了詳細(xì)的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。實施例l取NH廠交聯(lián)瓊脂糖珠1000 ml ，依次用5倍介質(zhì)體積的lMNaCl， IO倍體積蒸 餾水充分洗滌后，抽去多余水分后轉(zhuǎn)移至5L玻璃燒瓶中，然后加入1000ml冰水， 在冰水浴中攪拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪300 g，其后用飽和NaHC03調(diào)節(jié) 和維持反應(yīng)系統(tǒng)的pH在6.0—7.0之間，反應(yīng)4小時后取出，依次用3X10倍介質(zhì)體 積的水/丙酮(體積比分別為0:1， 1:3， 1:1， 3:1， 1:0)洗滌，得到二氯三氮 嗪-介質(zhì)，共950ml。取對氨基苯磺酸80 g用1000ml飽和NaHC03溶解，加入二氯三氮嗪-介質(zhì)800 ml中混勻，置于溫度5(TC中攪拌反應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后，將介質(zhì)用10倍介質(zhì)體 積蒸餾水充分洗滌，得到胺對苯磺酸一氯三氮嗪-介質(zhì)700 ml，待用。取L-色氨酸90 g用800 ml飽和NaHC03溶解，加入胺對苯磺酸一氯三氮嗪-介質(zhì)600ml中混勻，置于溫度100'C中攪拌反應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后，將介質(zhì)依 次用10倍介質(zhì)體積乙醇，用10倍介質(zhì)體積蒸餾水充分洗滌，得到胺對苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介質(zhì)500 ml，用30%乙醇保存，待用。將Hypocrea jecorina發(fā)酵液上清液pH調(diào)至7. 0，取1. 5ml上樣至預(yù)先用 10倍體積磷酸鈉緩沖液(10 mM磷酸鈉，pH7.0)平衡的胺對苯磺酸-L-色氨酸 三氮嗪-介質(zhì)的層析柱(2ml)中，用5ml磷酸鈉緩沖液(10raM磷酸鈉，pH7. 0) 洗去未結(jié)合的物質(zhì)，再用2ml0. 1M醋酸(pH2.0)洗脫，收集得到內(nèi)切木聚糖酶。 取20u 1加至180 u 1含1%木聚糖的0. 1 M pH4. 6醋酸-醋酸鈉緩沖液中混勻， 55'C反應(yīng)30 min。再加200nl DNS顯色劑(稱取6. 5g 3， 5-二硝基水楊酸溶解 于少量熱dH20中，再加入26g NaOH、 45g甘油，用dH20定容至lOOOml，磁力攪 拌器上充分?jǐn)嚢杌靹?，棕色瓶避光保存?zhèn)溆?沸水中孵育5min顯色。測光吸收 A546nm，對照木糖標(biāo)準(zhǔn)濃度的光吸收&461 計算反應(yīng)體系每分鐘生成還原糖u mol量 (酶活力單位)，總酶活力單位0.53U。以聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS — PAGE)分析內(nèi)切木聚糖酶純度75. 8%。 實施例2將Hypocrea jecorina發(fā)酵液上清液調(diào)pH至8. 5,取150 ml上樣至預(yù)先用 磷酸鈉緩沖液(10 mM磷酸鈉，pH8.5)平衡的胺對苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介 質(zhì)的層析柱(50 ml)中，用100 ml磷酸鈉緩沖液(10幽磷酸鈉，pH8.5)洗 去未結(jié)合雜質(zhì)后，再用磷酸鈉緩沖液(10 raM磷酸鈉，pH8.5)含0. 6 M NaCl 洗脫，分步收集，按照實施例1中的方法測定內(nèi)切木聚糖酶活力，總活達(dá)到120U; SDS-PAGE分析蛋白組成內(nèi)切木聚糖酶純度達(dá)到95%。實施例3將Hypocrea jecorina發(fā)酵液上清液調(diào)pH至6. 0，取6 ml上樣至預(yù)先用磷 酸鈉緩沖液(10 mM磷酸鈉，p服.O)平衡的胺對苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介質(zhì). 的層析柱(2 ml)中，用10 ml磷酸鈉緩沖液(10 mM磷酸鈉，pH6. 0)洗去未 結(jié)合雜質(zhì)后，再用乙酸鈉緩沖液(0.10 M乙酸-乙酸鈉，pH3.0)洗脫，分步收 集，按照實施例1中的方法測定內(nèi)切木聚糖酶活力，總活達(dá)到1.18U; SDS-PAGE 分析蛋白組成內(nèi)切木聚糖酶純度達(dá)到86%。實施例4將Hypocrea jecorina發(fā)酵液上清液調(diào)pH至9. 5，取8 ml上樣至預(yù)先用50 mM Tris. HC1緩沖液pH9. 5平衡的胺對苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介質(zhì)的層析柱(2 ml)中，用10 ml 50mMTris.HCl緩沖液pH9. 5平衡洗去未結(jié)合雜質(zhì)后，用0.1 M氯化銨-氫氧化銨緩沖器溶液(pH 10)洗脫，分步收集，按照實施例1中的方 法測定內(nèi)切木聚糖酶活力，總活達(dá)到1.56U; SDS-PAGE分析蛋白組成內(nèi)切木聚糖 酶純度達(dá)到90%。實施例5將Hypocrea jecorina發(fā)酵粗品溶液調(diào)pH至8. 5，取150 ml上樣至預(yù)先用 磷酸鈉緩沖液(10 mM磷酸鈉，pH8.5)平衡的胺對苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介 質(zhì)的層析柱(50 ml)中，用100 ml磷酸鈉緩沖液(10 mM磷酸鈉，pH8.5)洗 去未結(jié)合雜質(zhì)后，再用磷酸鈉緩沖液(10 mM磷酸鈉，pH8.5)含1. 0 M NaCl 洗脫，分步收集，按照實施例1中的方法測定內(nèi)切木聚糖酶活力，總活達(dá)到150U; SDS-PAGE分析蛋白組成內(nèi)切木聚糖酶純度達(dá)到90%。實施例6將Hypocrea jecorina發(fā)酵液干燥粗品溶液上清液調(diào)pH至8. 5，取150 ml 上樣至預(yù)先用磷酸鈉緩沖液(lOmM磷酸鈉，pH8.5)平衡的胺對苯磺酸-L-色氨 酸三氮嗪-介質(zhì)的層析柱(50 ml)中，用100ml磷酸鈉緩沖液(10niM磷酸鈉， pH8.5)洗去未結(jié)合雜質(zhì)后，再用磷酸鈉緩沖液(10 mM磷酸鈉，pH8.5)含0. 3 M NaCl洗脫，分步收集，按照實施例1中的方法測定內(nèi)切木聚糖酶活力，總活 達(dá)到90U; SDS-PAGE分析蛋白組成內(nèi)切木聚糖酶純度達(dá)到98%。實施例7將Hypocrea jecorina發(fā)酵液上清液調(diào)pH至10. 5，取10 ml上樣至預(yù)先用 磷酸鈉緩沖液GO mM磷酸鈉，pH10.5)平衡的胺對苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介質(zhì)的層析柱(2 ml)中，用100 ral磷酸鈉緩沖液(10 mM磷酸鈉，pH10.5) 洗去未結(jié)合雜質(zhì)后，再用0.1 M乙酸-乙酸鈉(pH2.4)洗脫，分步收集，按照 實施例1中的方法測定內(nèi)切木聚糖酶活力，總活達(dá)到0.8U; SDS-PAGE分析蛋白 組成內(nèi)切木聚糖酶純度達(dá)到82%。實施例8內(nèi)切木聚糖酶粗品溶液調(diào)PH至10. 5，取10 ml上樣至預(yù)先用磷酸鈉緩沖液 (10 mM磷酸鈉，pH10. 5)平衡的胺對苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介質(zhì)的層析柱(2 ml)中，用lOOml磷酸鈉緩沖液(10 mM磷酸鈉，pH10.5)洗去未結(jié)合雜質(zhì)后， 再用0. 1 M乙酸-乙酸鈉(pH4.0)洗脫，分步收集，按照實施例1中的方法測 定內(nèi)切木聚糖酶活力，總活達(dá)到0.85U; SDS-PAGE分析蛋白組成內(nèi)切木聚糖酶純 度達(dá)到92%。實施例9內(nèi)切木聚糖酶粗品溶液調(diào)pH至5. 0，取8 ml上樣至預(yù)先用50 mM Tris. HC1 緩沖液PH5.0平衡的胺對苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介質(zhì)的層析柱(2 ml)中， 用10 ml 50 mM Tris.HCl緩沖液pH5. 0平衡洗去未結(jié)合雜質(zhì)后，用磷酸鈉緩沖 液(10 mM磷酸鈉，pH9. 5)含0. 6 M NaCl洗脫，分步收集，按照實施例1中的 方法測定內(nèi)切木聚糖酶活力，總活達(dá)到1.0U; SDS-PAGE分析蛋白組成內(nèi)切木聚 糖酶純度達(dá)到86%。實施例IO內(nèi)切木聚糖酶粗品溶液調(diào)pH至8. 0，取8 ml上樣至預(yù)先用50 mM Tris. HC1 緩沖液pH8.0平衡的胺對苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介質(zhì)的層析柱(2 ml)中， 用10 ml 50mMTris.HCl緩沖液pH8. 0平衡洗去未結(jié)合雜質(zhì)后，用50 mM Tris. HC1 緩沖液pH7. 0含0. 6 M NaCl洗脫，分步收集，按照實施例1中的方法測定內(nèi)切 木聚糖酶活力，總活達(dá)到1.3U; SDS-PAGE分析蛋白組成內(nèi)切木聚糖酶純度達(dá)到 76%。本發(fā)明的上述各個實施例從上樣至獲得高純內(nèi)切木聚糖酶操作簡單，只需要 一步層析操作，生產(chǎn)成本低。利用分離材料與內(nèi)切木聚糖酶之間的高度專一的相 互作用實現(xiàn)純化的目的，不受生產(chǎn)規(guī)模的影響，因此很容易放大進(jìn)行批量生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1、一種內(nèi)切木聚糖酶的仿生親和純化方法，其特征在于，包括下列步驟第一步，制備仿生親和分離材料首先用三氯三氮嗪活化的基礎(chǔ)層析介質(zhì)與對氨基苯磺酸反應(yīng)得到胺對苯磺酸一氯三氮嗪-介質(zhì)，再與L-色氨酸反應(yīng)，得到胺對苯磺酸-L色氨酸三氮嗪-介質(zhì)，即仿生親和分離材料；第二步，用仿生親和分離材料純化內(nèi)切木聚糖酶將內(nèi)切木聚糖酶粗品調(diào)節(jié)pH至上樣條件，上樣至用結(jié)合緩沖液預(yù)平衡的裝有仿生親和分離材料的層析柱中，清洗去除未結(jié)合雜質(zhì)組分，再用洗脫緩沖液從柱中洗脫內(nèi)切木聚糖酶，獲得內(nèi)切木聚糖酶純品。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的內(nèi)切木聚糖酶的仿生親和純化方法，其特征是， 所述反應(yīng)得到胺對苯磺酸一氯三氮嗪-介質(zhì)，其反應(yīng)溫度為5(TC。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的內(nèi)切木聚糖酶的仿生親和純化方法，其特征是， 所述再與L-色氨酸反應(yīng)，其反應(yīng)溫度為95。C。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的內(nèi)切木聚糖酶的仿生親和純化方法，其特征是，所 述基礎(chǔ)層析介質(zhì)是葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖一N， N'-亞甲 基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚分離材料、甲基丙烯酸聚合分離材料、瓊脂糖凝膠、交 聯(lián)瓊脂糖凝膠，瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺一瓊脂糖復(fù)合物珠、 纖維素珠或涂有化學(xué)活性基團(tuán)的硅膠中的一種。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的內(nèi)切木聚糖酶的仿生親和純化方法，其特征是， 所述的仿生親和分離材料，其配體結(jié)構(gòu)含對胺基苯磺酸結(jié)構(gòu)和L-色氨酸結(jié)構(gòu)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的內(nèi)切木聚糖酶的仿生親和純化方法，其特征是，第 所述的結(jié)合緩沖液pH為5. 0 - 10. 0。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的內(nèi)切木聚糖酶的仿生親和純化方法，其特征是，所 述的洗脫緩沖液pH為2. 0 - 10. 0。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的內(nèi)切木聚糖酶的仿生親和純化方法，其特征是， 所述的洗脫緩沖液含NaCl濃度為O. 0-1. 0M。
9、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的內(nèi)切木聚糖酶的仿生親和純化方法，其特征是，所述的內(nèi)切木聚糖酶粗品，為天然微生物發(fā)酵，或通過基因工程技術(shù)改造的微生物 發(fā)酵液，或菌體破碎液，包括Hypocrea jecorina發(fā)酵液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種內(nèi)切木聚糖酶的仿生親和純化方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括如下步驟(1)對氨基苯磺酸和L-色氨酸通過三氯三氮嗪活化連接到基礎(chǔ)層析介質(zhì)上制備親和分離材料；(2)將纖維素酶粗品與所述親和分離材料接觸，內(nèi)切木聚糖酶結(jié)合到親和分離材料上，未結(jié)合物質(zhì)被洗出后，內(nèi)切木聚糖酶再用洗脫緩沖液從柱中專一洗脫下來，得到純內(nèi)切木聚糖酶。本發(fā)明能夠高效率、低成本的大規(guī)模生產(chǎn)高純度的內(nèi)切木聚糖酶。
文檔編號C12N9/42GK101250512SQ200810036158
公開日2008年8月27日 申請日期2008年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月17日
發(fā)明者張小勇, 李榮秀, 董德賢, 陳德兆 申請人:上海交通大學(xué)