專利名稱：：一種等溫雙向生長的基因合成方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及基因工程的
技術領域：
，具體地說是一種等溫雙向生長的基因合成方法。技術背景-隨著生物技術及醫(yī)學的發(fā)展，設計或改造基因正得到越來越多的關注。傳統(tǒng)的基因擴增、克隆、重組和突變技術只能得到自然界已有或類似的DNA序列，要實現(xiàn)對基因的自由設計，必須對基因進行人工合成?；虻娜斯ず铣砂▋蓚€步驟一是用酶法將化學合成的寡核苷酸鏈進行人工拼接，得到較長的序列；二是以較長序列為基礎，進一步拼接得到更長的DNA序列，直至達到需要的長度。對于較短的DNA序列(〈lkb)來說，一般無需步驟二。在基因人工合成中，歩驟一是合成的關鍵步驟。目前主要有兩種方法可以實現(xiàn)步驟一，分別是連接酶法和PCR法。基因人工合成最初使用的是連接酶法(KhoranaHG.Science.V203,614-625.1979)。在連接酶法中，引物序列之間存在互補的部分，可以相互雜交形成存在缺刻(nick)的長序列，這些缺刻可以在連接酶(T4DNAligase，Taqligase等)的作用下被去除，從而得到連續(xù)的長DNA序列。由于所有的連接酶都需要5'磷酸化的末端和3'羥基進行連接，所以在反應之前,用于連接的中間引物需要進行5，磷酸化處理，這就使得基因合成的成本大大增加。同時，為了保證合成的效率，單次連接酶反應合成較長序列的長度受到限制，通常不宜超過500bp.基因人工合成的PCR法，又稱PCA(PolymeraseCyclingAssembly)法，1990年被Dillon等人首次用于合成一段303bp的HIV-2rev基因(Dillon,P.J.&Rosen,C.A.(1990)BioTechniques9,298-300.)，隨后逐漸被推廣應用。在引物設計方面，PCR法類似于連接酶法，引物之間需要一定程度的互補，互補4的兩條引物可以互為引物互為模板，經(jīng)聚合酶的延伸，得到稍長的雙鏈DNA,這些稍長的DNA之間也存在互補，從而可以繼續(xù)延伸，這種過程在不同水平重復多次之后，便可以得到完整的雙鏈。PCR法不需要對短序列進行任何修飾，因此合成成本較連接酶法大大降低。但由于是多種短序列間的并行反應，要合成的序列越長，則發(fā)生錯誤延伸的可能性就越大。一般來說，當序列大于500bp時，合成將變得難以進行。PCR法通常還被用于更長序列的合成，如Smith等人(Hamilton0.Smith,ClydeA.HutchisonIII，CynthiaPfannkochetal.PNAS.VIOO，15440-15445.2003)用Taqligase對引物進行連接之后，再對連接產(chǎn)物進行PCR法合成，得到了全長的5，386bp的①X174bacteriophage基因組。經(jīng)對現(xiàn)有技術文獻檢索發(fā)現(xiàn)，基因合成技術方面的專利大都涉及連接酶法的合成，例如USPatent6，110，668描述了一種依賴于模板的基因合成方法，在這個方法中，合成的寡核苷酸可以雜交到模板上，而又與模板之間存在一些不匹配位點，用連接酶將這些寡核苷酸連接后，就可以得到一條與模板相似而又引入目標突變的序列。這一方法不能用于合成任意的序列，而且首先需要得到相似的模板，因而應用上很受限制。USPatent6,521,427介紹了一種逐步連接的方法，在這個方法中，合成用的短寡核苷酸鏈逐個加入并雜交連接，或進行分組連接，組內(nèi)連接之后進行組間連接；USPatent6,670，127介紹了一種基于連接酶的類似方法。這些方法的優(yōu)點是可以降低引物之間的錯誤雜交，缺點是操作復雜，而且也不能省去序列5'磷酸化的必要修飾，成本昂貴。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種改進的等溫雙向生長的基因合成方法，它可克服現(xiàn)有技術中操作復雜、成本昂貴、合成周期較長的一些不足。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案是一種等溫雙向生長的基因合成方法，其特征在于所述的基因合成方法具體包括以下步驟(1)、根據(jù)目標DNA序列設計并合成用于延伸的寡核苷酸鏈，或者純化合成的寡核苷酸鏈；(2)、將步驟(l)中所得的寡核苷酸鏈混合在反應體系中，并加入具有聚合酶、連接酶和限制性內(nèi)切酶三種活性的混合酶，在多種酶的協(xié)同作用下進行等溫雙向生長并發(fā)生延伸反應，合成目標DNA長鏈^f吏用日寸本發(fā)明通過特殊的寡核苷酸序列設計方法，得到一系列用于延伸的包含發(fā)夾結構和酶切位點的寡核苷酸鏈，這些寡核苷酸鏈在多種酶的協(xié)同作用下進行等溫生長，合成目標DNA長鏈。本發(fā)明具有成功率高、設計簡單和操作簡單、自動化高等特點，因而具有潛在的低成本優(yōu)勢，對于基因合成的推廣，生物工程，生物醫(yī)學和生物信息學等領域的發(fā)展存在潛在的應用價值。-圖l.本發(fā)明的基因合成過程流程示意圖圖2.用于基因合成的寡核苷酸鏈構成示意圖圖3.等溫延伸反應示意圖具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的描述。本發(fā)明的一種等溫雙向生長的基因合成方法，其特征在于所述的基因合成方法具體包括以下步驟(1)、根據(jù)目標DNA序列設計并合成用于延伸的寡核苷酸鏈，或者純化合成的寡核苷酸鏈；(2)、將步驟(l)中所得的寡核苷酸鏈混合在反應體系中，并加入具有聚合酶、連接酶和限制性內(nèi)切酶三種活性的混合酶，在多種酶的協(xié)同作用下進行等溫雙向生長并發(fā)生延伸反應，合成目標DNA長鏈。所述的合成過程溫度在25匸至40°C之間，最佳的溫度為33。C。合成目標DNA長鏈，如果合成的產(chǎn)量不足，可以進行PCR的擴增，合成產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物可以用于再次拼接、克隆或其它用途。所述的反應體系是指可以有效發(fā)揮上述三種酶相應活性的體系，通過調(diào)節(jié)陽離子的濃度和種類，調(diào)節(jié)體系的pH值等得到。所述的聚合酶可以是DNA聚合酶，也可以是RNA聚合酶；可以是耐熱的，也可以是不耐熱的；優(yōu)選無3'—5，外切酶活性的聚合酶，如Klenowexo-,反轉錄酶等。所述的限制性內(nèi)切酶是指typeII型的，優(yōu)選切割后的序列是3'懸掛的限制性內(nèi)切酶，比如Btsl，Mval2691等。所述的連接酶是指能將兩段DNA連接成為一段DNA的酶，優(yōu)選T4DNA連接酶。所述的混合酶是指由KlenowexcT聚合酶、T4DNA連接酶和Btsl限制性內(nèi)切酶組成的混合物。在所述的三種酶的混合物中，Klenowexo—聚合酶的濃度在0.001單位/微升到0.05單位/微升之間，特別是指0.02單位/微升，Klenowexo—聚合酶的單位定義與NEB公司(美國)生產(chǎn)的Klenowexo—聚合酶一致；T4DNA連接酶的濃度在1單位/微升到30單位/微升之間，特別是指10單位/微升，T4DNA連接酶的單位定義與Takara公司(大連)生產(chǎn)的T4DNA連接酶一致；Btsl限制性內(nèi)切酶，其終的濃度在0.00001單位/微升到1單位/微升之間，特別是指0.5單位/微升。所述的純化是指中性聚丙烯酰胺凝膠電泳(中性PAGE)純化。所述的延伸反應，在3個步驟的循環(huán)間進行(1)聚合酶延伸使得發(fā)夾結構打開，限制性內(nèi)切酶位點成為雙鏈；(2)限制性內(nèi)切酶對已經(jīng)成為雙鏈的位點進行切割；(3)連接酶將切割產(chǎn)生的末端與體系中存在的某個發(fā)夾結構進行連接；這三個步驟都在同一個溫度下進行，溫浴時間越長，序列的平均長度越長，直到目標DNA序列產(chǎn)生。所述的PCR擴增，是指當目標DNA序列比較長時，延伸產(chǎn)生的目標DNA序列在產(chǎn)量上可能無法直接用于下游操作，如克隆，連接反應等，進行PCR擴增是需要的。所述的設計并合成用于延伸的寡核苷酸鏈構成方法如下(1)將目標DNA雙鏈的其中一條連續(xù)單鏈記為正鏈，另一條連續(xù)單鏈記為負鏈，方向皆為5'—3';(2)將目標DNA雙鏈分段成多個首尾相接的短序列，這些短序列由正鏈部分和負鏈部分組成；(3)在這些短序列中選取一段作為延伸核心。(4)將位于延伸核心與正鏈5'端之間的短序列記為左向延伸序列，將位于延伸核心與正鏈3'端之間的短序列記為右向延伸序列；(5)在左向延伸序列正鏈部分和右向延伸序列負鏈部分的5，端首先加上一個限制性內(nèi)切酶識別位點，然后再加入一段序列，這段序列與相應延伸序列的一部分互補，使得整段序列能形成一個發(fā)夾結構，發(fā)夾的開環(huán)部分為平末端；(6)在延伸核心的正鏈部分、延伸核心的負鏈部分和所有發(fā)夾的3'端添加一段序列，這段序列由分段方式和限制性內(nèi)切酶的切割方式所決定，這樣在每個發(fā)夾的丌環(huán)部分構建得到一個3'突出的互不相同的連接末端；由延伸核心構建得到的序列記為核心引物，由延伸序列構建得到的序列記為延伸引物；(7)核心引物可由兩段部分匹配的單鏈互為模版延伸后經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割得到；所述的分段所得的短序列其長度在5個堿基以上。所述的發(fā)夾結構是指在一條DNA線性單鏈中存在自身相互匹配，而在局部形成雙鏈的一種結構，這種結構的雙鏈部分稱為發(fā)夾莖部，雙鏈的兩側部分稱為環(huán)部，閉合的環(huán)部稱為閉環(huán)部分，開放的環(huán)部稱為開環(huán)部分。所述的引物是指寡核苷酸鏈。如上所述的寡核苷酸鏈設計好后，可利用普通的寡核苷酸鏈自動合成儀合成。如圖l、2、3所示，本發(fā)明根據(jù)圖l.基因合成過程流程、用于基因合成的寡核苷酸鏈構成、等溫延伸反應進行具體實施-實施例1Lambda外切酶基因中一段412堿基序列的合成目標合成產(chǎn)物為一段來自lambda外切酶編碼基因的長為412堿基的DNA序列，如下AC-3,所用的聚合酶是Klencwexo-，連接酶是T4DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶是Btsl。基因合成過程如下-(1)、根據(jù)目標DNA序列設計并合成用于延伸的寡核苷酸鏈，或者純化合成的寡核苷酸鏈。寡核苷酸鏈設計的順序是:1.將412bp的DNA序列分段成首尾相連的10段短序列。如下:名稱序列(5'-3')TCACAACGTGATAGCAAAACCCCGCTCCGGAAAGAAGTGGCCTGACATGAAAATGTCCTACTTCCACACCCTGCTTGCTGAGGTTTGCACCGGTGTGGCTCCGGAAGTTAACGCTAAAGCACTGGCCTGGGGMAACAGTACGAGAACGACGCCAGAACCCTGTTTGAATTCACTTCCGGCGTGAATGTTACTGAATCCCCGATCATCRlTATCGCGACGAAAGTATGCGTACCGCCTGCTR2CTCCCGATGGTTTATGCAGCGACGGCAACGGCCTTGAAR3ATGCCCGTTTACCTCCCGGGATTTCATGAAGTTCCGGCTCGGTR4GGTTTCGAGGCCATAAAGTCAGCTTACATGGCCCAGGTGCAGTAR5CAGCATGTGGGTGACGCGMAMATGCCTGGTACTTTGCCAAC2.在短序列或其互補序列的5'端添加BtsI識別序列，Btsl的識別序列和酶切方式為[GCAGTG(2/0)]，因而在每段序列的5'端添加6個堿基"GCAGTG",在識別位點的5'端再添加一段7~15個堿基的序列，使之與相應短序列的3'端互補。3.在短序列的3'端再添加2個堿基。最后設計好的序列通過Mfoldwebserver(http://www,bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/)軟件檢驗，所有的寡核苷酸鏈都達到預期的二級結構。這些序列如下名稱序列(5'-3')GATTCAGTGCAGTG579<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>寡核苷酸鏈由Invitrogen(上海)公司合成，PAGE純化。(2)、在多種酶的協(xié)同作用下進行等溫生長，合成目標DNA長鏈基因合成的反應體系是lOmMTris-HCl，pH9.0,50mMKCl，0.1%TritonXlOO,lOOuMeachdNTPMix,lmMATP，10nMRl和Ll，引物L2、L3、L4、L5、R2、R3、R4、R5的濃度皆為lOOnM,0.OlU/ulKlenowexo-，lOU/ulT4DNA連接酶(Takara，大連)，0.5U/ulBtsl。33°C溫育2h。(3)、以步驟(2)中所得的產(chǎn)物為模板進行PCR擴增，獲取目標序列長度的PCR產(chǎn)物。取0.lul歩驟(2)中的溫育結果，加入到10ulPCR體系中，以L5和R5為引物對延伸產(chǎn)物進行PCR擴增。PCR體系的組成是10mMTris-HC1,pH9.0，50mMKCl，0.1%TritonXlOO,200uMeachdNTPMix,兩條引物各luM及0.05U/ulTaq聚合酶(Sangon),PCR程序為為94。C,10s,然后是30循環(huán)的94°C,20s，72。C,30s.最后在72°C延伸5min，得到一段412bp的序列。經(jīng)測序驗證為目標序列。實施例2M13噬菌體基因組中一段合成一段來自M13噬菌體的長為227堿基的DNA序列，序列如下5，-GGCATTACGTATTTTACCCGTTTAATGGAAACTTCCTCATGAAAAAGTCTTTAGTCCTCAATTGTCGGCGCAACTATCGGTATCAAG-3'所用的聚合酶是Klenowexo-，連接酶是T4DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶是Btsl?；蚝铣蛇^程如下(1)、根據(jù)目標DNA序列設計并合成用于延伸的寡核苷酸鏈，或者純化合成的寡核苷酸鏈。寡核苷酸鏈設計。寡核苷酸鏈的設計與實施例1相同，所有寡核苷酸鏈如下分段后的短序列<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>合成的寡核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>引物由Invitrogen公司(上海)合成，PAGE純化。(2)、在多種酶的協(xié)同作用下進行等溫生長，合成目標DNA長鏈基因合成的反應體系是lOmMTris-HCl，pH9.0,50mMKCl，0.1%TritonXlOO,lOOuMeachdNTPMix,lmMATP，10nMM7和M8，引物M5、M6、M9和MIO的濃度皆為lOOnM，0.OlU/ulKlenowexo-，10U/ulT4DNA連接酶(Takara，大連)，0.5U/ulBtsl。33。C溫育2.5h。(3)、以步驟(2)中所得的產(chǎn)物為模板進行PCR擴增，獲取目標序列長度的PCR產(chǎn)物。取0.lul步驟(2)中的溫育結果，加入到10ulPCR體系中，以M5和MIO為引物對延伸產(chǎn)物進行PCR擴增。PCR體系的組成是10mMTris-HCl，pH9.0，50mMKCl，0.1%TritonXlOO,200uMeachdNTPMix,兩條引物各luM及0.05U/ulTaq聚合酶(Sangon)，PCR程序為為94。C，10s,然后是30循環(huán)的M°C，20s，72°C，30s.最后在72。C延伸5min，得到一段259bp的序列。經(jīng)測序驗證為目標序列。權利要求1、一種等溫雙向生長的基因合成方法，其特征在于所述的基因合成方法具體包括以下步驟(1)、根據(jù)目標DNA序列設計并合成用于延伸的寡核苷酸鏈，或者純化合成的寡核苷酸鏈；(2)、將步驟(1)中所得的寡核苷酸鏈混合在反應體系中，并加入具有聚合酶、連接酶和限制性內(nèi)切酶三種活性的混合酶，在多種酶的協(xié)同作用下進行等溫雙向生長并發(fā)生延伸反應，合成目標DNA長鏈。2、根據(jù)權利要求l所述的等溫雙向生長的基因合成方法，其特征在于所述的設計并合成用于延伸的寡核苷酸鏈構成方法如下(1)將目標DNA雙鏈的其中一條連續(xù)單鏈記為正鏈，另一條連續(xù)單鏈記為負鏈，方向皆為5'—3';(2)將目標DNA雙鏈分段成多個首尾相接的短序列，這些短序列由正鏈部分和負鏈部分組成；(3)在這些短序列中選取一段作為延伸核心；(4)將位于延伸核心與正鏈5'端之間的短序列記為左向延伸序列，將位于延伸核心與正鏈3'端之間的短序列記為右向延伸序列；(5)在左向延伸序列正鏈部分和右向延伸序列負鏈部分的5，端首先加上一個限制性內(nèi)切酶識別位點，然后再加入一段序列，這段序列與相應延伸序列的一部分互補，使得整段序列能形成一個發(fā)夾結構，發(fā)夾的開環(huán)部分為平末端；(6)在延伸核心的正鏈部分、延伸核心的負鏈部分和所有發(fā)夾的3'端添加一段序列，這段序列由分段方式和限制性內(nèi)切酶的切割方式所決定，這樣在每個發(fā)夾的開環(huán)部分構建得到一個3，突出的互不相同的連接末端；由延伸核心構建得到的序列記為核心引物，由延伸序列構建得到的序列記為延伸引物；(7)核心引物可由兩段部分匹配的單鏈互為模版延伸后經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割得到；3、根據(jù)權利要求2所述的等溫雙向生長的基因合成方法，其特征在于所述的分段所得的短序列其長度為至少5個堿基。4、根據(jù)權利要求2所述的等溫雙向生長的基因合成方法，其特征在于所述的引物是指寡核苷酸鏈。5、根據(jù)權利要求l所述的等溫雙向生長的基因合成方法，其特征在于所述的純化是指中性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。6、根據(jù)權利要求1所述的等溫雙向生長的基因合成方法，其特征在于所述的聚合酶為DNA聚合酶、RNA聚合酶，或者無3'—5'外切酶活性的聚合酶；所述的連接酶是指能夠將兩條DNA或RNA進行連接的酶；所述的限制性內(nèi)切酶是指type1I型的，切割后的序列是3，懸掛的限制性內(nèi)切酶。7、根據(jù)權利要求1所述的等溫雙向生長的基因合成方法，其特征在于所述的混合酶是指由Klenowexo—聚合酶、T4DNA連接酶和Btsl限制性內(nèi)切酶組成的混合物。8、根據(jù)權利要求7所述的等溫雙向生長的基因合成方法，其特征在于在所述的三種酶的混合物中，Klenowexo—聚合酶的濃度在0.001單位/微升到0.05單位/微升之間；T4DNA連接酶的濃度在l單位/微升到30單位/微升之間；Btsl限制性內(nèi)切酶，其終的濃度在0.00001單位/微升到1單位/微升之間。9、根據(jù)權利要求l所述的等溫雙向生長的基因合成方法，其特征在于所述的延伸反應，在3個步驟的循環(huán)間進行.'(1)聚合酶延伸使得發(fā)夾結構打開，限制性內(nèi)切酶位點成為雙鏈；(2)限制性內(nèi)切酶對己經(jīng)成為雙鏈的位點進行切割；(3)連接酶將切割產(chǎn)生的末端與體系中存在的某個發(fā)夾結構進行連接；10、根據(jù)權利要求l所述的等溫雙向生長的基因合成方法，其特征在于所述的合成過程溫度在25'C至4(TC之間。全文摘要本發(fā)明涉及一種等溫雙向生長的基因合成方法，其特征為所述的基因合成方法具體包括以下步驟(1)根據(jù)目標DNA序列設計并合成用于延伸的寡核苷酸鏈，或者純化合成的寡核苷酸鏈；(2)將步驟(1)中所得的寡核苷酸鏈混合在反應體系中，并加入具有聚合酶、連接酶和限制性內(nèi)切酶三種活性的混合酶，在多種酶的協(xié)同作用下進行等溫雙向生長并發(fā)生延伸反應，合成目標DNA長鏈。本發(fā)明具有成功率高、設計簡單和操作簡單、自動化高等特點，因而具有潛在的低成本優(yōu)勢，對于基因合成的推廣，生物工程，生物醫(yī)學和生物信息學等領域的發(fā)展存在潛在的應用價值。文檔編號C12P19/00GK101560538SQ200810036199公開日2009年10月21日申請日期2008年4月17日優(yōu)先權日2008年4月17日發(fā)明者林繼偉申請人:上海青蘭生物科技有限公司