專利名稱：以絲瓜絡(luò)為載體的固定化脂肪酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固定化脂肪酶及其制備方法，特別是一種以絲瓜絡(luò)為載體的固定 化脂肪酶及其制備。
技術(shù)背景酶一直都是以溶于水的游離狀態(tài)或完整的細(xì)胞兩種方式進(jìn)行催化反應(yīng)的，但游離 酶即使在酶反應(yīng)的最適合條件下進(jìn)行催化，也存在著容易失活，反應(yīng)后不能回收等缺 陷，有時不易與產(chǎn)物分離開，影響產(chǎn)品的純度與質(zhì)量。固定化酶與一般的水溶性酶制劑相比，不但仍具有酶的高度專一性，催化效率及 作用條件溫和等特點(diǎn)，而且比水溶性酶更穩(wěn)定，使用壽命更長， 一般可連續(xù)使用幾百 小時甚至幾個月。固定化酶是懸浮于反應(yīng)液中進(jìn)行作用，反應(yīng)后可用過濾或離心的方 法與反應(yīng)液分離，從而可反復(fù)使用多次。固定化酶還可裝成酶柱，反應(yīng)液流過酶柱后， 流液即為反應(yīng)物，這樣就可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模連續(xù)化生產(chǎn)，提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)在 工業(yè)生產(chǎn)中的大規(guī)模應(yīng)用。固定化酶在使用前可以充分洗滌，除去水溶性雜質(zhì)，因而 不會污染反應(yīng)液，產(chǎn)物的分離提純簡單，收率高，酶活損失少。因此，它在實(shí)際生產(chǎn) 中和理論研究中越來越受到關(guān)注。 固定化酶固定化過程中要遵循的幾大原則1. 必須注意維持酶的催化活性及專一性，保持酶原有的專一性，高效催化能力和在 常溫常壓下能起催化反應(yīng)的特點(diǎn)。2. 固定化應(yīng)該有利于生產(chǎn)自動化，連續(xù)化。為此，用于固定化的載體必須有一定的 機(jī)械強(qiáng)度，不能因機(jī)械攪拌而破壞或脫落。3. 固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻，盡可能不妨礙與底物的接近，因而不會引起酶的 失活，以提高產(chǎn)品的產(chǎn)量。4. 酶與載體盡可能地結(jié)合牢固。5. 載體不與反應(yīng)物、產(chǎn)物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。6. 易于產(chǎn)物分離。7. 固定化酶成本低。8. 采用化學(xué)試劑需安全，尤其是在固定化酶在食品與醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用中。固定化過程中， 一般根據(jù)載體的形式、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和酶偶聯(lián)量以及實(shí)效系數(shù)等來選擇合適的固定化載體。20070328 CN1935994A薛屏等用介孔分子篩為固定化載體， 以磷酸緩沖溶液為媒介，固定青霉素酰化酶，實(shí)現(xiàn)酶的固定化。蔡宏舉等用以甲基丙 烯酸縮水甘油酯(GMA)為單體，二乙烯基苯(DVB)為交聯(lián)劑，本體聚合制備多孔載體， 以磷酸緩沖溶液為媒介，固定假絲酵母脂肪酶，得到較高酶活力回收率。以上兩法由 于其載體存在制作工藝復(fù)雜，成本高，生物相容性不好等缺點(diǎn)，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。 胡文靜，譚天偉等以化學(xué)改性后的殼聚糖為載體，以磷酸緩沖溶液為媒介，固定假絲 酵母99一125脂肪酶，實(shí)現(xiàn)酶的固定化。雖然殼聚糖具有良好的生物相容性，但其存 在機(jī)械強(qiáng)度不夠，改性過程復(fù)雜等缺點(diǎn)，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。楊本宏，蔡敬民等人研 究了以海藻酸鈉為載體,用包埋法制備固定化德氏根霉脂肪酶，固定化酶的活力回收 率約為34. 1 %。其方法活力回收率不高，且載體流動性不佳，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。文獻(xiàn)中報道的固定化載體較多，例如殼聚糖、纖維素等多糖類載體，大孔徑合成 樹脂、陶瓷等無機(jī)載體，聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等有機(jī)聚合物載體，海藻酸鈉等凝膠 材料載體。但是以上載體得到的固定化酶或者由于酶活性太低，或者由于成本太高， 限制了酶法在生產(chǎn)中的大規(guī)模應(yīng)用。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一在于針對目前固定化酶存在的不足，提供一種以絲瓜絡(luò)為載體 的固定化酶。本發(fā)明的目的之二在于提供該固定化酶的制備方法。 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種以絲瓜絡(luò)為載體的固定化脂肪酶，其特征在于該固定化脂肪酶中，所述的脂 肪酶與載體絲瓜絡(luò)的質(zhì)量比為1: 4 1: 8。上述的一種以絲瓜絡(luò)為載體的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于，該方法的 具體步驟為-a) 絲瓜絡(luò)的除油處理；b) 脂肪酶的精制；c) 脂肪酶的固定化將經(jīng)步驟a所得絲瓜絡(luò)與有機(jī)溶劑按l: 20 1: 25的質(zhì)量比混合均勻，在25士5。C搖床中恒溫1士0.5小時，然后加入步驟b所得脂肪酶粉末，混合均勻，所述的脂肪酶與載體絲瓜絡(luò)的質(zhì)量比為1: 4 1: 8;在搖床中固定16土2小時；取出固定化的載體，用有機(jī)溶劑清洗3次，室溫干燥，即得以絲瓜絡(luò)為載體的固定化脂肪酶；所用的有機(jī)溶劑有環(huán)己烷、正 庚烷或正己烷。上述的一種以絲瓜絡(luò)為載體的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于所述的絲瓜絡(luò)的除油處理方法為將干的絲瓜絡(luò)用0. 5mol/L-lmol/L的NaOH溶液在70-95。C的 情況下洗滌12h，以去除多余的油脂；然后將絲瓜絡(luò)用去離子水洗滌3次，然后把絲 瓜絡(luò)浸泡在去離子水中用超聲波洗滌3h，干燥后備用。上述的一種以絲瓜絡(luò)為載體的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于所述的脂肪 酶的精制方法為把粗的脂肪酶粉末溶于0. lmol/L ^=6 — 8的磷酸緩沖溶液中， 3000rpm/min離心15min后取上清液，然后把上清液冷凍干燥為粉末備用。絲瓜絡(luò)主要含木聚糖及纖維素，絲瓜絡(luò)與其他載體相比，具有如下優(yōu)勢1. 具有良好的生物相容性，表面含有豐富的羥基。2. 由于纖維的長徑比大，因而具有較大的表面積，利于催化反應(yīng)的進(jìn)行。3. 具有良好的機(jī)械強(qiáng)度與穩(wěn)定性。4. 與顆粒狀載體相比，更容易從反應(yīng)媒介中分離出來。5. 價格便宜，資源豐富，易于取得，更利于固定化酶的工業(yè)化。由于絲瓜絡(luò)具有上述的特點(diǎn)，本發(fā)明以絲瓜絡(luò)作為脂肪酶固定化的載體，所得到 的固定化脂肪酶活力回收率高、重復(fù)使用率高、并且固定化好的酶能夠多次使用而不 失活。而且本發(fā)明的工藝方法操作簡單，有望推動酶法生產(chǎn)生物柴油工業(yè)化的進(jìn)程。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一具體步驟如下1. 絲瓜絡(luò)的處理將干的絲瓜絡(luò)用0. 5mol/L的Na0H溶液在70-8(TC洗滌12h，去除 多余的油脂。然后將絲瓜絡(luò)用去離子水洗滌3次，再將絲瓜絡(luò)浸泡在去離子水中用超 聲波洗滌3h。常溫干燥后將絲瓜絡(luò)剪成lcmX 3cm大小備用。2. 酶的精制把粗的圓柱型假絲酵母粉末溶于O. lmol/L PH=8的磷酸緩沖溶液中， 3000rpm/min離心15min后取上清液，然后把上清液冷凍干燥為粉末備用。3. 酶的固定化4。/。(wt)絲瓜絡(luò)載體與95.5%(機(jī))環(huán)己垸混合均勻，在25。C搖床中恒 溫lh,然后加入0.5y。(wt)脂肪酶粉末，混合均勻，25'C下固定16h。取固定化的載體， 用環(huán)己烷清洗3次，室溫干燥5h。4.固定化酶活力的測定取超純橄欖油30ml與絲瓜絡(luò)為載體的固定化酶混合均勻。4CTC下在搖床中反應(yīng)12h,加入15ml無水乙醇終止反應(yīng)，以酚酞為指示劑，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液滴定水解生成的脂肪酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定化酶的活力回收率達(dá)到70°/。。實(shí)施例二本實(shí)施例與實(shí)施例一基本相同，所不同的是所采用的有機(jī)溶劑為正己 垸，采用的脂肪酶為黑曲酶。所得結(jié)果發(fā)現(xiàn)所得固定化酶的的活力回收率達(dá)到76%。實(shí)施例三本實(shí)施例與實(shí)施例一基本相同，所不同的是所采用的有機(jī)溶劑為正庚 烷。采用的脂肪酶為熒光假單細(xì)胞菌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定化酶的活力回收率達(dá)到81%。實(shí)施例四本實(shí)施例與實(shí)施例一基本相同，所不同的是，所采用的脂肪酶為解脂生酶，在酶的精制中，把粗的脂肪酶粉末溶于O. lmol/L 1^=7的磷酸緩沖溶液中， 3000rpm/min離心15min后取上清液，然后把上清液冷凍干燥為粉末備用。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 酶活力回收率達(dá)到71%。實(shí)施例五本實(shí)施例與實(shí)施例一基本相同，所不同的是所采用的脂肪酶為阿化假囊酵母，在酶的精制中，把粗的脂肪酶粉末溶于O. lmol/Lra:6的磷酸緩沖溶液中， 3000rpm/min離心15min后取上清液，然后把上清液冷凍干燥為粉末備用。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 酶活力回收率達(dá)到70%。實(shí)施例六具體步驟為1. 絲瓜絡(luò)的處理將干的絲瓜絡(luò)用1 mol/L的NaOH溶液在90-95"C洗滌12h,去除多 余的油脂。然后將絲瓜絡(luò)用去離子水洗滌3次，再將絲瓜絡(luò)浸泡在去離子水中用超聲 波洗滌6h。常溫干燥后將絲瓜絡(luò)剪成lcmX3cm大小備用。2. 酶的精制把粗的脂肪酶粉末溶于O. lmol/LPH^8的磷酸緩沖溶液中，3000rpm/min 離心15min后取上清液，然后把上清液冷凍干燥為粉末備用。3. 酶的固定化4。/。(wt)絲瓜絡(luò)載體與95.5%(機(jī))正庚垸混合均勻，在25"C搖床中恒 溫lh,然后加入O. 5n/。(wt)脂肪酶粉末，混合均勻，25'C下固定24h。取固定化的載體， 用正庚烷清洗3次，室溫干燥5h。4.固定化酶活力的測定取超純橄欖油30ml與絲瓜絡(luò)為載體的固定化酶混合均勻。 40'C下在搖床中反應(yīng)12h，加入15ml無水乙醇終止反應(yīng)，以酚酞為指示劑，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液滴定水解生成的脂肪酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶活力回收率達(dá)到74%。實(shí)施例七本實(shí)施例與實(shí)施例六基本相同，所不同的是在酶固定化過程中，將4./。(wt)絲瓜絡(luò)載體與95.4。/。(wt)正庚烷混合均勻，在25'C搖床中恒溫lh,然后加入 0.60/。(wt)脂肪酶粉末，混合均勻，25'C下固定16h。取固定化的載體，用正庚垸清洗 3次，室溫干燥5h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶活力回收率達(dá)到72%。實(shí)施例八本實(shí)施例與實(shí)施例六基本相同，所不同的是在酶固定化過程中，將4%(Wt) 絲瓜絡(luò)載體與95. 3%(wt)正庚垸混合均勻，在25'C搖床中恒溫lh，然后加入0. 7%(wt) 脂肪酶粉末，混合均勻，25'C下固定16h。取固定化的載體，用正庚垸清洗3次，室 溫干燥5h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶活力回收率達(dá)到70%。實(shí)施例九本實(shí)施例與實(shí)施例六基本相同，所不同的是在絲瓜絡(luò)的處理過程中， 將干的絲瓜絡(luò)用1 mol/L的NaOH溶液在90-95'C洗滌12h,去除多余的油脂。然后將 絲瓜絡(luò)用去離子水洗滌3次，再將絲瓜絡(luò)浸泡在去離子水中用超聲波洗滌6h。然后 直接用10cm長的絲瓜絡(luò)固定化脂肪酶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶活力回收率達(dá)到61%。
權(quán)利要求
1. 一種以絲瓜絡(luò)為載體的固定化脂肪酶，其特征在于該固定化脂肪酶中，所述的脂肪酶與載體絲瓜絡(luò)的質(zhì)量比為1∶4～1∶8。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種以絲瓜絡(luò)為載體的固定化脂肪酶的制備方法，其特征 在于，該方法的具體步驟為a. 絲瓜絡(luò)的除油處理；b. 脂肪酶的精制；c. 脂肪酶的固定化將經(jīng)步驟a所得絲瓜絡(luò)與有機(jī)溶劑按l: 20 1: 25的質(zhì)量比混合均勻，在25士5'C搖床中恒溫1土0.5小時，然后加入步驟b所得脂肪酶粉末，混合均勻，所述的脂肪酶與載體絲瓜絡(luò)的質(zhì)量比為1: 4 1: 8;在搖床中固定16士2小時；取出固定化的載體，用有機(jī)溶劑清洗3次，室溫干燥，即得以絲瓜絡(luò)為載體的固定化脂肪酶；所用的有機(jī)溶劑有環(huán)己烷、正 庚烷或正己垸。
3. 據(jù)權(quán)利要求2所述的一種以絲瓜絡(luò)為載體的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于所述的絲瓜絡(luò)的除油處理方法為將干的絲瓜絡(luò)用0. 5mol/L-lmol/L的NaOH 溶液在70-95"C的情況下洗滌12h，以去除多余的油脂；然后將絲瓜絡(luò)用去離子水 洗滌3次，然后把絲瓜絡(luò)浸泡在去離子水中用超聲波洗滌3h，干燥后備用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種以絲瓜絡(luò)為載體的固定化脂肪酶的制備方法，其特征 在于所述的脂肪酶的精制方法為把粗的脂肪酶粉末溶于0. lmol/LR^6—8的磷 酸緩沖溶液中，3000rpm/min離心15min后取上清液，然后把上清液冷凍干燥為 粉末備用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以絲瓜絡(luò)為載體的固定化脂肪酶及其制備。該固定化脂肪酶中，所述的載體脂肪酶與絲瓜絡(luò)的質(zhì)量比為1∶4～1∶8。具體制備方法包括絲瓜絡(luò)的除油處理、脂肪酶的精制及脂肪酶的固定化。本發(fā)明以絲瓜絡(luò)作為脂肪酶固定化的載體，所得到的固定化脂肪酶活力回收率高、重復(fù)使用率高、并且固定化好的酶能夠多次使用而不失活。而且本發(fā)明的工藝方法操作簡單，有望推動酶法生產(chǎn)生物柴油工業(yè)化的進(jìn)程。
文檔編號C12N11/00GK101260396SQ20081003640
公開日2008年9月10日 申請日期2008年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月21日
發(fā)明者葉俊丹, 葉正堯, 張寶華, 青 楊, 飛 潛 申請人:上海大學(xué);上海綠銘環(huán)?？萍脊煞萦邢薰?br>