專利名稱：一種抑制小鼠B7-DC基因表達的shRNA真核表達載體的構建方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體說，是涉及一種抑制小鼠B7-DC基因表 達的shRNA真核表達載體的構建方法。
背景技術：
近年來大量的研究表明，T細胞的激活受正向和負向信號之間平衡的調(diào)節(jié)。 T細胞上的共刺激或共抑制受體或配體與抗原提呈細胞上相應的配體或受體相 互作用維持了這種平衡，并且最終決定T細胞的激活。B7-DC是共刺激分子B7 家族的一個成員，近來被鑒定是免疫抑制性受體程序性死亡蛋白1 (PD-1)的配 體。B7-DC主要表達于單核細胞上，并在樹突狀細胞上呈選擇性表達。外周單 核細胞經(jīng)GM-CSF和IL-4誘導，產(chǎn)生的樹突狀細胞可高表達B7-DC。樹突狀細 胞是目前功能最強的抗原提呈細胞，能夠起始和調(diào)節(jié)T細胞免疫。樹突狀細胞一旦激活后能夠表達大量的組織相容性復合體i類、n類分子，共刺激分子和粘附分子，這些分子為活化T細胞提供了第二信號。因此，人們?nèi)找骊P注用樹 突狀細胞作為疫苗來治療慢性病毒感染和腫瘤。目前B7-DC對T細胞在體內(nèi)的 調(diào)節(jié)作用還不是完全清楚，但大量的研究表明B7-DC對T細胞反應具有負向調(diào) 節(jié)作用。因此，抑制負向調(diào)節(jié)信號分子B7-DC可能會增強樹突狀細胞誘導的免 疫應答的作用。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA (double strandRNA, dsRNA)介導的細胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，導致耙基因的表達 沉默，產(chǎn)生相應的功能表型缺失。這一現(xiàn)象屬于轉錄后的基因沉默機制 (Posttranscriptional gene silencing, PTGS )。研究表明，RNA干擾包括起始階段 和效應階段。在起始階段，加入的小分子RNA被切割成21-23核苷酸長的小分 子千擾RNA片段(small interfering RNAs， siRNAs )。 一個稱為Dicer的酶，是 RNase III家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步 切割由外源導入或者由轉基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA,切割將 RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs ( siRNAs )，每個片段的3，端都有2個堿基突出。在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA 誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex, RISC )。激活RISC需要一個 ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同 源mRNA轉錄本上，并在距離siRNA3'端12個堿基的位置切割mRNA，使目 標mRNA不能翻譯，因而沉默。作為研究基因功能的新工具，RNAi在細胞中具有抑制或滅活特異的基因的 功能，可以產(chǎn)生類似基因"敲除"的效應，是功能基因組研究的有效工具，這 一技術比基因敲除技術具有明顯投入少、周期短、操作簡單等優(yōu)勢，它的應用 為基因功能的研究開辟了新的途徑。siRNA獲取常用5種方法(1)化學合成 siRNA法；(2 )體外轉錄siRNA法；(3 )長片段dsRNA經(jīng)RNase III類酶的降 解法；(4) siRNA表達載體或病毒載體在細胞內(nèi)的表達；(5)使用PCR法制備 的siRNA表達框在細胞中的表達法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種抑制小鼠B7-DC基因表達的shRNA 真核表達載體的構建方法，為研究B7-DC基因的功能、增強樹突狀細胞誘導的 免疫應答中的應用研究提供一個有效工具。本發(fā)明所提供的抑制小鼠B7-DC基因表達的shRNA真核表達載體的構建方法，包括以下步驟A) 根據(jù)Genebank提供的小鼠B7-DC的基因序列，從編碼區(qū)中選取第361 ~ 379位核苷酸序列GCTTCTTACATGAGGATAG為靶序列，設計并合成引物，引 物為siRNAl-Oligol: 5'-GATCCCGCTTCTTACATGAGGATAGTTCAAGAGACTATCCTC ATGTAAGAAGCTTTTTGGAAA-3' siRNAl-01igo2: 5'-AGCTTTTCCAAAAAGCTTCTTACATGAGGATAGTCTCTTGAACTATCCTC ATGTAAGAAGCGG陽3' s麵A2-01igo1: 5'-GATCCCCTTCAGCTGCATGTTCTGGTTCAAGAGACCAGAAC ATGCAGCTGAAGTTTTTGGAAA腸3' siRNA2-01igo2: 5'-AGCTTTTCCAAAAACTTCAGCTGCATGTTCTGGTCTCTTGAACCAGAACATGCAGCTGAAGGG-3';B) 將載體pAS經(jīng)Bg/U、州"dll雙酶切，用回收試劑盒回收；C) siRNA1-01igol與siRNAl-01igo2退火，即用三蒸水稀釋引物至IO pmolAil,取siRNAl-01igol與siRNAl-01igo2各lpl，加TE補至20pl， 95°C 5分鐘， 70°C IO分鐘，10°C 20分鐘；D) 取5 nl siRNAl-01igol與siRNAl-01igo2退火產(chǎn)物，加入lpl pAS經(jīng)5g/H 、 歷V7JIII雙酶切回收后的產(chǎn)物，lnlT4連接酶和2^ill0x連接緩沖液，加雙蒸水補 至20pl體系，置于4。C反應過夜；E) 將步驟D)所得的連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5a，即取連接產(chǎn)物2(^1， 加入200plDH5a感受態(tài)細胞，冰浴30分鐘，42°C 90秒，再冰洛2分鐘，加入800)id LB液體培養(yǎng)基，37°C、 225rpm振搖60分鐘，取200^1菌液均勾涂在含有氨節(jié)青霉 素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37"C培養(yǎng)過夜；F) 挑取單個克隆菌落，置于3ml含有氨節(jié)青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基上， 37"C培養(yǎng)過夜；G) 提取步驟F)獲得的菌液的質粒DNA;H) 所提質粒DNA經(jīng)五coiH和州"c/m酶切鑒定，選出正確質粒，命名為 shRNAl-B7-DC;I) 按照步驟A)至步驟H)的搡作構建質粒shRNA2-B7-DC。 所述LB液體培養(yǎng)基的配方優(yōu)選為10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化鈉，用雙蒸水溶解至1000ml。所述LB固體培養(yǎng)基的配方優(yōu)選為10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯 化鈉、15g瓊脂粉，用雙蒸水溶解至1000ml。所述氨節(jié)青霉素的濃度優(yōu)選為100pg/ml。本發(fā)明所構建的抑制小鼠B7-DC基因表達的shRNA真核表達載體，不僅能 特異性靶向并抑制小鼠骨髓來源的樹突狀細胞中B7-DC基因的表達，還可以大 量擴增，并可將其有效片段克隆至其它更好的載體上，具有操作簡單、應用方 便、毒副作用小、成本低等優(yōu)點。所述載體上還帶有與人H1啟動子共表達的綠 色熒光蛋白Rluc-GFP基因，可以通過綠色熒光來判斷轉染效率。本發(fā)明釆用的 是siRNA表達載體法，可以為研究B7-DC基因的功能、增強樹突狀細胞誘導的 免疫應答中的應用研究提供一個有效工具。


圖1為本發(fā)明的shRNA真核表達載體的構建流程圖；圖2為本發(fā)明的shRNA真核表達載體體外增強小鼠骨髓來源的樹突狀細胞 刺激T細胞增殖能力的示意圖，圖中菱形圖標代表正常的小鼠骨髓來源的樹 突狀細胞刺激T細胞增殖的能力；正方形圖標代表空載體pAS轉染細胞組刺激 T細胞增殖的能力；三角形圖標代表shRNAl-B7-DC轉染細胞組刺激T細胞增 殖的能力；圓形圖標代表shRNA2-B7-DC轉染細胞組刺激T細胞增殖的能力。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi) 容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣 落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例l抑制小鼠B7-DC基因表達的shRNA真核表達載體的構建流程如圖1所示， 具體操作如下A)按照siRNA靶序列的選取原則，根據(jù)Genebank提供的小鼠B7-DC的基因 序列(NM_021396),從編碼區(qū)中選取第361 379位核苷酸序列 GCTTCTTACATGAGGATAG為靶序列，設計并合成引物(由上海生工生物工程 技術服務有限公司合成)，引物為siRNAl-Oligol: 5'-GATCCCGCTTCTTACATGAGGATAGTTCAAGAGACTATCCTC ATGT AAGAAGCTTTTTGG AAA-3' siRNAl畫。ligo2: 5'-AGCTTTTCCAAAAAGCTTCTTACATGAGGATAGTCTCTTGAACTATCCTCATGTAAGAAGCGG-3' siRNA2-01igo1: 5'-GATCCCCTTCAGCTGCATGTTCTGGTTCAAGAGACCAGAACATGCAGCTGAAGTTTTTGGAAA-3' siRNA2-01igo2: 5 '畫AGCTTTTCCAAAAACTTCAGCTGCATGTTCTGGTCTCTTGAACC AGAAC ATGCAGCTGAAGGG-3'b)將載體pAs經(jīng)5g/n、預'"^in雙酶切，用回收試劑盒(北京鼎國生物技術有限責任公司)回收；C)siRNAl-01igol與siRNAl-01igo2退火，即用三蒸水稀釋引物至IO ^mol/nl，取siRNAl-01igol與siRNAl-01igo2各lpl，加TE補至20jxl， 95°C 5分鐘， 70。C10分鐘，10。C20分鐘，退火后產(chǎn)物兩端帶有Bg/II和州^III酶切位點；D) 取5 jil siRNAl-Oligol與siRNAl-01igo2退火產(chǎn)物，加入lpl pAS經(jīng)fig/H 、 Wwnil雙酶切回收后的產(chǎn)物，lplT4連接酶和2 ^ 10x連接緩沖液(TaKaRa公 司)，加雙蒸水補至2(^1體系，置于4'C反應過夜；E) 將步驟D)所得的連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5a,即取連接產(chǎn)物20jil， 加入200jilDH5a感受態(tài)細胞，冰洛30分鐘，42°C 90秒，再冰浴2分鐘，加入 80(^1LB液體培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基的配方為10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、 5g氯化鈉，用雙蒸水溶解至1000 ml), 37°C、 225 rpm振搖60分鐘，取200W 菌液均勻涂在含有氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上(LB固體培養(yǎng)基的配方 為10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化鈉、15g瓊脂粉，用雙蒸水溶解至 1000ml;所含氨芐青霉素的濃度為lOOjig/ml), 37。C培養(yǎng)過夜；F) 挑取單個克隆菌落，置于3ml含有氨節(jié)青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基上 (LB液體培養(yǎng)基的配方與上述相同，所含氨芐青霉素的濃度為100嗎/ml), 37°C培養(yǎng)過夜；G) 提取步驟F)獲得的菌液的質粒DNA;H) 所提質粒DNA經(jīng)五co/ I和歷>^/111酶切鑒定，選出正確質粒，命名為 shRNAl-B7-DC;I) 按照步驟A)至步驟H)的操作構建質粒shRNA2-B7-DC。 本實施例所構建的真核表達載體shRNA-B7-DC為閉合環(huán)狀質粒，大小約為6295bp。載體pAS帶有人H1啟動子，不僅可以在體內(nèi)由RNA聚合酶PolIII表 達插入的序列，形成shRNA;還有與人Hl啟動子共表達的綠色熒光蛋白 Rluc-GFP基因，可以通過綠色熒光來判斷轉染效率。 實施例2將實施例l所構建的真核表達載體shRNA-B7-DC應用于體外抑制小鼠骨髓 來源的樹突狀細胞中B7-DC基因的表達，具體步驟如下① 大量制備shRNA-B7-DC高純質粒；② 小鼠骨髓來源的樹突狀細胞的制備按Inaba等介紹的常規(guī)方法進行；③ 轉染當天接種5><105個生長狀態(tài)良好的小鼠骨髓來源的樹突狀細胞于六 孔板內(nèi)，待其豐度達到70~80°/。時，參照Lipofbcter脂質體轉染試劑(碧云天生 物技術研究所)說明書，將質粒shRNA-B7-DC轉染至樹突狀細胞，其中質粒 DNA (嗎)Lipofecter脂質體轉染試劑(pl)為1.5嗎4jil; 轉染48小時后，離心取細胞，每5~ 10xl()S細胞加入lml Trizol (美國Invitrogen公司)裂解細胞，獲得細胞總RNA; RNA逆轉錄PCR擴增(RT-PCR):以上述獲得的細胞總RNA為模板， 以oligodT(20)為引物進行反轉錄，反應條件為42°C 20分鐘，99°C 5分鐘；取 逆轉錄產(chǎn)物為模板直接進行常規(guī)PCR擴增；小鼠B7-DC基因上游引物序列為 5'-GGAATTCCCTAAAGAAGTGTACACCG-3'， 下游引物序列為 5'-CCGCTCGAGTTAGACTTTGGGTT-3'。內(nèi)參GAPDH上游引物序列為 5'-ACGGCAAATTCAACGGCACAGTCA-3', 下 游 序 列 為 5'-CATTGGGGGTAGGAACACGGAAGG-3';將上游引物10pM、下游引物10 (iM、由北京天為時代科技有限公司提供的2xTaq Plus PCR MasterMix 12.5^1及 逆轉錄產(chǎn)物3^1，加ddH20補至25pl，將其放入PCR儀中，反應條件為95°C 2分 鐘，94。C30秒，55。C30秒，72°C 1分鐘，共30個循環(huán)，最后72。C延伸10分 鐘，得到小鼠B7-DC基因的PCR片段。釆用RT-PCR法從mRNA水平分析抑制效率，由Quantity One軟件分析得 知小鼠骨髓來源的樹突狀細胞中B7-DC基因的表達在轉染shRNAl-B7-DC、 shRNA2-B7-DC質粒后分別被抑制了 61.4%、 45.9%。實施例3將實施例l所構建的真核表達載體shRNA-B7-DC應用于體外增強小鼠骨髓 來源的樹突狀細胞刺激T細胞的增殖，具體步驟如下① 大量制備shRNA-B7-DC高純質粒；② 小鼠骨髓來源的樹突狀細胞的制備按Inaba等介紹的常規(guī)方法進行；③ 轉染當天接種5xl()S個生長狀態(tài)良好的小鼠骨髓來源的樹突狀細胞于六 孔板內(nèi)，待其豐度達到70~80%時，參照Lipofecter月旨質體轉染試劑(碧云天生 物技術研究所)說明書，將質粒shRNA-B7-DC及空載體pAS轉染至樹突狀細胞， 其中質粒DNA (昭)Lipofecter脂質體轉染試劑(fil)為1.5昭4pl;④ 轉染48小時，每孔加入絲裂霉素C (終濃度為30pg/ml)，在37。C繼續(xù) 孵育45分鐘后，離心收集細胞，用RPMI 1640培養(yǎng)基(HyClone公司)洗4次， RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細胞； 小鼠脾細胞的制備取C57BL/6小鼠脾臟銅網(wǎng)研磨，用5ml Tris-NH4Cl (3.735gNH4Cl、 1.3gTris，加雙蒸水至500ml，過濾除菌)緩沖液破壞紅細胞， 5min后加入PBS ( 10 x PBS: 16g NaCl、 0.4g KH2P04、 5.8g Na2HP04.12H20、 0.4g KC1,加雙蒸水定容至200ml,使用時十倍稀釋)洗滌細胞2次，以RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸，加入96孔板，每孔1><105個細胞； 在96孔板內(nèi)分別加入上述收集的轉染和未轉染的樹突狀細胞5xl03、 lx104、 2xl(^和l x 105個細胞/孔，每孔終體積200nl，各組設3個復孔，并設T細 胞對照組和空白對照組，37°C, 5。/。C02培養(yǎng)72h， MTT細胞增殖及細胞毒性檢測 試劑盒(碧云天生物技術研究所)檢測T細胞增殖狀況。檢測結果顯示shRNA-B7-DC轉染細胞組刺激指數(shù)值(SI)均比空載體pAS 轉染細胞組和正常細胞組高(見圖2所示)，說明shRNA-B7-DC轉染的樹突狀細 胞具有更強的刺激T細胞增殖的能力。核苷酸序列表<110>華東師范大學<120> —種抑制小鼠B7-DC基因表達的shRNA真核表達載體的構建方法 <160> 4<170> Patentln version 3.3<210> 1 <211> 63 <212> DNA <213>人工序列<220><223>根據(jù)Genebank提供的小鼠B7-DC的基因序列設計和人工合成而得，用作 引物。<400> 1gatcccgctt cttacatgag gatagttcaa gagactatcc tcatgUaga agctttttgg 60 aaa 63<210> 2 <211> 63 <212>腿 <213>人工序列<220><223>根據(jù)Genebank提供的小鼠B7-DC的基因序列設計和人工合成而得，用作 引物。<400> 2agcttttcca aaaagcttct tacatgagga tagtctcttg aactatcctc atgtaagaag 60 egg 63<210> 3 <211> 63 <212> DNA <213>人工序列<220><223>根據(jù)Genebank提供的小鼠B7-DC的基因序列設計和人工合成而得，用作 引物。<400> 3gatccccttc agctgcatgt tctggttcaa gagaccagaa catgcagctg aagtttttgg 60 aaa 63<210> 4 <211> 63 <212> DNA <213>人工序列<220><223〉根據(jù)Genebank提供的小鼠B7-DC的基因序列設計和人工合成而得，用作 引物。<400> 4agcttttcca aaaacttcag ctgcatgttc tggtctcttg aaccagaaca tgcagctgaa 60 ggg 6權利要求
1. 一種抑制小鼠B7-DC基因表達的shRNA真核表達載體的構建方法，其特征在于，其包括以下步驟A)根據(jù)Genebank提供的小鼠B7-DC的基因序列，從編碼區(qū)中選取第361～379位核苷酸序列GCTTCTTACATGAGGATAG為靶序列，設計并合成引物，引物為siRNA1-Oligo15′-GATCCCGCTTCTTACATGAGGATAGTTCAAGAGACTATC CTCATGTAAGAAGCTTTTTGGAAA-3′siRNA1-Oligo25′-AGCTTTTCCAAAAAGCTTCTTACATGAGGATAGTCTCTT GAACTATCCTCATGTAAGAAGCGG-3′siRNA2-Oligo15′-GATCCCCTTCAGCTGCATGTTCTGGTTCAAGAGACCAGA ACATGCAGCTGAAGTTTTTGGAAA-3′siRNA2-Oligo25′-AGCTTTTCCAAAAACTTCAGCTGCATGTTCTGGTCTCTT GAACCAGAACATGCAGCTGAAGGG-3′；B)將載體pAS經(jīng)BgIII、HindIII雙酶切，用回收試劑盒回收；C)siRNA1-Oligo1與siRNA1-Oligo2退火，即用三蒸水稀釋引物至10μmol/μl，取siRNA1-Oligo1與siRNA1-Oligo2各1μl，加TE補至20μl，95℃5分鐘，70℃10分鐘，10℃20分鐘；D)取5μl siRNA1-Oligo1與siRNA1-Oligo2退火產(chǎn)物，加入1μl pAS經(jīng)BgIII、Hind III雙酶切回收后的產(chǎn)物，1μl T4連接酶和2μl 10×連接緩沖液，加雙蒸水補至20μl體系，置于4℃反應過夜；E)將步驟D)所得的連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5α，即取連接產(chǎn)物20μl，加入200μl DH5α感受態(tài)細胞，冰浴30分鐘，42℃90秒，再冰浴2分鐘，加入800μlLB液體培養(yǎng)基，37℃、225rpm振搖60分鐘，取200μl菌液均勻涂在含有氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜；F)挑取單個克隆菌落，置于3ml含有氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜；G)提取步驟F)獲得的菌液的質粒DNA；H)所提質粒DNA經(jīng)EcoR I和Hind III酶切鑒定，選出正確質粒，命名為shRNA1-B7-DC；I)按照步驟A)至步驟H)的操作構建質粒shRNA2-B7-DC。
2. 根據(jù)權利要求l所述的抑制小鼠B7-DC基因表達的shRNA真核表達載體的 構建方法，其特征在于，所述LB液體培養(yǎng)基的配方為10gM蛋白胨、5g酵母提 取物、5g氯化鈉，用雙蒸水溶解至1000ml。
3. 根據(jù)權利要求l所述的抑制小鼠B7-DC基因表達的shRNA真核表達載體的 構建方法，其特征在于，所述LB固體培養(yǎng)基的配方為10g胰蛋白胨、5g酵母提 取物、5g氯化鈉、15g瓊脂粉，用雙蒸水溶解至1000ml。
4. 根據(jù)權利要求l所述的抑制小鼠B7-DC基因表達的shRNA真核表達載體的 構建方法，其特征在于，所述氨節(jié)青霉素的濃度為100^ig/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制小鼠B7-DC基因表達的shRNA真核表達載體的構建方法，其構建流程是根據(jù)Genebank提供的小鼠B7-DC的基因序列，選取編碼區(qū)第361～379位核苷酸序列為靶序列設計并合成引物，通過引物退火，連接至干擾載體pAS，即得本發(fā)明構建的真核表達載體shRNA-B7-DC。本發(fā)明所構建的真核表達載體，不僅能特異性靶向并抑制小鼠骨髓來源的樹突狀細胞中B7-DC基因的表達，還可以大量擴增，并可將其有效片段克隆至其它更好的載體上，具有操作簡單、應用方便、毒副作用小、成本低等優(yōu)點，可以為研究B7-DC基因的功能、增強樹突狀細胞誘導的免疫應答中的應用研究提供一個有效工具。
文檔編號C12N15/79GK101265478SQ20081003667
公開日2008年9月17日 申請日期2008年4月25日 優(yōu)先權日2008年4月25日
發(fā)明者燕 樊, 江文正, 郝文麗, 聞潔君 申請人:華東師范大學