專利名稱：：一種提高林可霉素產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)，涉及一種提高林可霉素產(chǎn)量的方法。技術(shù)背景林可霉素(Lincomycin，簡(jiǎn)稱LCM)又稱潔霉素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有很好的作用，它沒有交叉耐藥性而且本身的毒性較低，所以被廣泛應(yīng)用于由革蘭氏陽(yáng)性菌引起的疾病，同時(shí)，對(duì)革蘭氏陰性菌亦有一定的抑制作用。林可霉素及其下游半合成產(chǎn)品稱為林可酰胺類抗生素，林可酰胺類抗生素已成為臨床應(yīng)用上主要的抗生素之一。一般所說(shuō)的林可霉素是指其A組份，它是由古柯葉液堿PHA(反式-N-甲基-4-正丙基脯氨酸(PPL))和甲硫林可酰胺MTL(6-氨基-6,8-二脫氧-l-硫代-0-赤式-2-D-半乳糖吡喃糖苷)兩部分通過肽鍵連接而成的抗生素。如圖1所示，林可霉素A的生物合成途徑分為兩個(gè)分枝，兩個(gè)分枝分別生成丙基脯氨酸(PPL)和甲硫林可胺(MTL),其中，丙基脯氨酸的合成途徑如圖2所示。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中直接添加作為前體的丙基脯氨酸可以提高林可霉素A的產(chǎn)量而相應(yīng)減少林可霉素B的產(chǎn)量，但添加其它非前體氨基酸是否會(huì)提高林可霉素A的產(chǎn)量則尚未有相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本申請(qǐng)的發(fā)明人在研究提高林可霉素產(chǎn)量的過程中發(fā)現(xiàn)，向林可霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入脯氨酸和/或丙氨酸，均能提高林可霉素的產(chǎn)量。因此，本發(fā)明的目的在于，提供一種提高林可霉素產(chǎn)量的方法，該方法通過向林可霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入脯氨酸和/或丙氨酸來(lái)實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，脯氨酸和丙氨酸的最適添加量、最適添加時(shí)間分別為60-84h添加0.005-0.01%脯氨酸；0-12h添加0.005-0.01%丙氨酸。使用本發(fā)明提供的方法，通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加在林可霉素合成中不作為前體物質(zhì)的脯氨酸和/或丙氨酸，均可明顯提高林可霉素的產(chǎn)量。圖1是林可霉素A的生物合成途徑。圖2是丙基脯氨酸的生物合成途徑。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件或生產(chǎn)廠商推薦的條件進(jìn)行。在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的林肯鏈霉菌(5^;/ow;;c"http://"co/"e柳;y)已于2008年04月25日提交位于武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號(hào)為CCTCCM208064。除特別說(shuō)明外，以下實(shí)施例中所使用的％，％。均為重量比。在本發(fā)明的實(shí)施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為0.8%(NH4)2S04，0.8%NaN03，0.5%NaCl，0.02%K2HPO4，3%黃豆餅粉，0.2%玉米漿，0.8%CaCO3，5%葡萄糖，pH7.0。在本發(fā)明的實(shí)施例中，林可霉素的效價(jià)采用杯碟法進(jìn)行檢測(cè)，中國(guó)藥典2005版(二部)。實(shí)施例l、添加脯氨酸對(duì)林可霉素生物合成的影響1.1、脯氨酸的添加量對(duì)林可霉素生物合成的影響配制林可霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中分別加入重量比為0.001%、0.005%、0.01°/。、0.05%、0.1%、0.2%的脯氨酸，同時(shí)以不添加脯氨酸的培養(yǎng)基作為對(duì)照，接入林肯鏈霉菌(5^印tow少c^//"co/"em&)發(fā)酵培養(yǎng)168小時(shí)后，取樣測(cè)定林可霉素的效價(jià)，結(jié)果如表1所示。表l、脯氨酸的添加量對(duì)林可霉素生物合成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>由表1的結(jié)果可見，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加脯氨酸可明顯提高林可霉素的生物合成，優(yōu)選的添加量范圍為0.005-0.01%。1.2、脯氨酸的添加時(shí)間對(duì)林可霉素生物合成的影響配制林可霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入林肯鏈霉菌(&印tom;ws^co/"e^s)發(fā)酵培養(yǎng)，分別在0、12、36、60、84、108、132小時(shí)向培養(yǎng)基中添加重量比為0.005%的脯氨酸，同時(shí)以不加脯氨酸的培養(yǎng)基作為對(duì)照，發(fā)酵168小時(shí)后，取樣測(cè)定林可霉素的效價(jià)，結(jié)果如表2所示。表2、脯氨酸的添加時(shí)間對(duì)林可霉素生物合成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由表2的結(jié)果可見，在發(fā)酵60小時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加脯氨酸可明顯提高林可霉素的生物合成，優(yōu)選的添加時(shí)間為60-84小時(shí)。實(shí)施例2、添加丙氨酸對(duì)林可霉素生物合成的影響2.1、丙氨酸的添加量對(duì)林可霉素生物合成的影響配制林可霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中分別加入重量比為0.005%、0.01%、0.03%、0.05%、0.1%的丙氨酸，同時(shí)以不添加丙氨酸的培養(yǎng)基作為對(duì)照，接入林肯鏈霉菌(SfrepfomyceWinco/^MW's)發(fā)酵培養(yǎng)168小時(shí)后，取樣測(cè)定林可霉素的效價(jià)，結(jié)果如表3所示。表3、丙氨酸的添加量對(duì)林可霉素生物合成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由表3的結(jié)果可見，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加丙氨酸可明顯提高林可霉素的生物合成，優(yōu)選的添加量范圍為0.005-0.01%。2.2、丙氨酸的添加時(shí)間對(duì)林可霉素生物合成的影響配制林可霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入林肯鏈霉菌(5^7tom;;ceWz力co/"e^^)發(fā)酵培養(yǎng)，分別在0、12、36、60、84、108、132小時(shí)向培養(yǎng)基中添加重量比為0.01%的丙氨酸，同時(shí)以不加丙氨酸的培養(yǎng)基作為對(duì)照，發(fā)酵168小時(shí)后，取樣測(cè)定林可霉素的效價(jià)，結(jié)果如表4所示。表4、丙氨酸的添加時(shí)間對(duì)林可霉素生物合成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表4的結(jié)果可見，在發(fā)酵0小時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加丙氨酸可明顯提高林可霉素的生物合成，優(yōu)選的添加時(shí)間為0-12小時(shí)。綜上所述，在林肯鏈霉菌(S的/7tom少c^//"co/"e"^;0的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加脯氨酸和丙氨酸，均可明顯提高林可霉素的產(chǎn)量，產(chǎn)量最高提高了23%;其最適添加量、最適添加時(shí)間分別為60-84h添加0.005-0.01%脯氨酸；0-12添加0.005-0.01%丙氨酸。權(quán)利要求1.一種提高林可霉素產(chǎn)量的方法，其特征在于，該方法通過向林可霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入脯氨酸和/或丙氨酸來(lái)實(shí)現(xiàn)。2、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述林可霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為0.8%(NH4)2SO4，0.8%NaNO3，0.5°/。NaCl，0.02%K2HPO4，3%黃豆餅粉，0.2%玉米漿，0.8%CaCO3，5%葡萄糖，pH7.0。3、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述脯氨酸加入的量為培養(yǎng)基重量的0.001-0.2%。4、如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述脯氨酸加入的量為培養(yǎng)基重量的0.005-0.01%。5、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述脯氨酸加入的時(shí)間為在培養(yǎng)基中加入林肯鏈霉菌0-132小時(shí)。6、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述脯氨酸加入的時(shí)間為在培養(yǎng)基中加入林肯鏈霉菌60-84小時(shí)。7、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述丙氨酸加入的量為培養(yǎng)基重量的0.005-0.1%。8、如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述丙氨酸加入的量為培養(yǎng)基重量的0.005-0.01%。9、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述丙氨酸加入的時(shí)間為在培養(yǎng)基中加入林肯鏈霉菌0-132小時(shí)。10、如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述丙氨酸加入的時(shí)間為在培養(yǎng)基中加入林肯鏈霉菌0-12小時(shí)。全文摘要本發(fā)明提供了一種提高林可霉素產(chǎn)量的方法，通過向林可霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入脯氨酸和/或丙氨酸來(lái)實(shí)現(xiàn)。使用本發(fā)明提供的方法，通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加在林可霉素合成中不作為前體物質(zhì)的脯氨酸和/或丙氨酸，均可明顯提高林可霉素的產(chǎn)量。文檔編號(hào)C12P19/64GK101265492SQ200810037080公開日2008年9月17日申請(qǐng)日期2008年5月7日優(yōu)先權(quán)日2008年5月7日發(fā)明者葉蕊芳,張曉彥,倩王,黎鄭申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)