專利名稱：一種利用菊芋原料糖化和發(fā)酵同步進行生產(chǎn)乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的乙醇生產(chǎn)方法。
技術(shù)背景由于化石類資源有限且呈枯竭之勢，能源短缺已是當(dāng)今社會面臨的一個重大問題。發(fā) 展可再生的生物質(zhì)能源是解決日趨緊張的能源供應(yīng)的有效途徑。生物質(zhì)能源是利用能源植 物或農(nóng)林業(yè)有機廢棄物生產(chǎn)出來的一種清潔能源產(chǎn)品，其中燃料乙醇是發(fā)展生物質(zhì)能源的 首選產(chǎn)品。目前全球燃料乙醇年產(chǎn)規(guī)模近3000萬噸，而我國燃料乙醇生產(chǎn)能力僅150萬 噸左右，主要以玉米、小麥等糧食作物為原料。鑒于我國人多地少、糧食生產(chǎn)壓力大，以 玉米、小麥等糧食作物為原料的燃料乙醇發(fā)展空間受到極大限制，難以長久支撐我國燃料 乙醇產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展，因此必須走原料多元化道路。據(jù)統(tǒng)計原料成本占燃料乙醇生產(chǎn)成本的 70%_80%。因此，開發(fā)價廉、產(chǎn)量高、綜合利用價值高的能源作物勢在必行。菊芋等經(jīng)濟 作物成為可供選擇的原料。菊芋(Jerusalem artichoke)系多年生草本植物，地下塊莖型如生姜，俗稱"洋姜"。 菊芋的特點是適應(yīng)性和抗病能力極強，耐干旱、貧瘠和嚴(yán)寒，在不適宜糧食作物生長的廢 棄土地(如鹽堿、灘涂地)上也能良好生長，且種植簡便，管理粗放，產(chǎn)量高(地下塊莖 3-4噸/畝，地上莖桿產(chǎn)量也可達3噸/畝)。菊芋含糖量高，其塊莖糖含量達到鮮重的11-20 o%。菊芋中的糖70-90%以菊粉(inulin)形式存在，菊粉是一種多聚果糖，每個菊粉分 子含有30-35個果糖殘基，經(jīng)P-2， l糖苷鍵脫水聚合而成，成線型排列，果糖鏈末端為一 個葡萄糖分子。除菊芋外，菊苣(chicory)和大麗花(dahlia)中也富含菊粉糖。因此， 菊芋作為一種果糖含量豐富的非糧型能源作物是理想的乙醇生產(chǎn)原料。菊芋發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵是菊粉中的多聚果糖水解成單糖(主要為果糖)，然后被酵 母等微生物利用。水解菊粉成為單糖的酶為外切型菊粉酶(inulinase)，該酶能夠從菊粉 分子的末端逐一水解單糖殘基。能夠分泌菊粉酶的微生物主要為真菌，包括黑曲霉 "5pergi〃"s m>er)、脆壁克魯維酵母((A7〃yyeroffi7ces /ragi'h's )、馬科斯克魯 維酵母 (A7u，er。那ce5"鵬rxj'朋i/s) 等。日本 Kazuyoshi 0hta等 (Applied and Environmental Microbiology, 59(3) :729-733， 1993)將黑曲霉(Asper^z7J"s/7_z>er817) 與發(fā)酵性能優(yōu)良的釀酒酵母(&cc力aro/^ces cereWw'se 1200)混合培養(yǎng)，利用來源于 菊苣和大麗花的純菊粉發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，乙醇濃度達到了 20% (v/v)。 KatarzynaSzambelan等(Biotechnology Letters 26: 845 - 848, 2004)利用分泌菊粉酶的脆壁克魯維酵母混合，發(fā)酵菊芋粉生產(chǎn)乙醇，乙醇濃度分別達到9.9% (v/v)、 9.4%(v/v)。他們還試驗了 先用菊粉酶水角軍菊芋粉，然后禾ll用2y歷oi歷o"S51 ffl。Z^'7i51或5"acc力ara歷yce51 cereKisiae發(fā) 酵生產(chǎn)乙醇，乙醇濃度分別達到9.7% (v/v) 、 9. l%(v/v)。呂躍鋼等(食品與發(fā)酵工業(yè)， 29 (5) : 66-68， 2003)曾將釀酒酵母與菊粉酶共固定，利用補加了蔗糖的菊芋抽提液發(fā) 酵生產(chǎn)乙醇，當(dāng)初始糖濃度為20% (w/v)時，發(fā)酵醪液乙醇含量可達11.98%(v/v)。上述研究中所采用的發(fā)酵菌株為釀酒酵母或Zj朋o/z7朋as M^i乃's，自身均不能產(chǎn)生菊 粉酶，菊粉的水解依賴于添加外源菊粉酶或者利用能夠產(chǎn)生菊粉酶的黑曲霉、脆壁克魯維 酵母。二十世紀(jì)八十年代初，加拿大一家實驗室曾對能夠分泌菊粉酶的克魯維酵母(主要 為馬科斯克魯維酵母，A7"j^er，/ces歷arw'朋"s)直接利用菊芋原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇進行 了研究(Duvnjak Z. et al， Biotechnology Letters 3(10) :589-594， 1981; Argyrio Margaritis et al， Biotechnology Letters, 3(10) :595-599, 1981; Argyrio Margaritis et al， Applied and Environmental Microbiology, 45(2) :723-725， 1983)。所用的發(fā) 酵原料為高溫滅菌的菊芋汁，但直接采用菊芋原汁發(fā)酵時，由于初始糖濃度限制，發(fā)酵產(chǎn) 物乙醇濃度不超過7。/。(v/v)。當(dāng)原料菊芋汁經(jīng)蒸發(fā)濃縮糖濃度達到25% (w/v)，并添加O. 05% Tween 80, 0. 01%油酸(oleic acid) ， 0.01%玉米漿(corn steep liquor)時，乙醇濃度 可以達到12.9。/。(v/v)，雖然乙醇參數(shù)較好，但工藝并不適于工業(yè)化應(yīng)用。本發(fā)明中所采用的菌株為鷹嘴豆克魯維酵母Y179和以鷹嘴豆克魯維酵母Y179為宿主細胞所構(gòu)建的基因工程菌，這些菌株自身具有高分泌表達菊粉酶并直接利用菊芋原料發(fā)酵 生產(chǎn)乙醇的能力。本發(fā)明所采用的工藝路線與已報道的明顯不同在于(1)種子培養(yǎng)基為 菊芋汁或菊芋粉培養(yǎng)基，不添加任何輔助成分；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基為菊芋粉，或菊芋汁直接 添加菊芋粉，不添加任何輔助營養(yǎng)成分，總糖濃度大于20% (w/v)，而且無需高溫滅菌， 產(chǎn)物乙醇濃度高，達到12% (v/v)以上。具有工藝簡單方便，適于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的特 點。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種利用菊芋原料生產(chǎn)乙醇的簡便方法，實現(xiàn)糖化與發(fā)酵同步 進行。本發(fā)明提出的生產(chǎn)乙醇的方法具體步驟如下(1)原料準(zhǔn)備用新鮮菊芋榨取菊芋計，調(diào)整菊芋計的總糖濃度至4%-18% (W/V); 用新鮮菊芋粉碎制取全菊芋粉。具體操作如下新鮮菊芋清洗干凈、晾干， 一部分菊芋用榨汁機榨取菊芋汁，測定菊芋汁總糖濃度， 調(diào)整總糖濃度至4%-18% (w/v)。取一部分潔凈的鮮菊芋切成片狀，將菊芋片置于陽光下 曬干，或者將菊芋片放入4(TC-8(rC烘箱中烘干。將干燥后的菊芋片粉碎，20目-80目篩子 過篩，細粉保留，粗粉繼續(xù)粉碎過篩，合并細粉，得到全菊芋粉，密封干燥保存?zhèn)溆谩?2) 菌種活化取-80。C凍存的克魯維酵母菌株劃線接種于YEPD固體培養(yǎng)基上，在 25"C-37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時以上，YEPD固體培養(yǎng)基組成為酵母抽提物10 g/L，蛋 白胨20g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，經(jīng)高溫滅菌。取一環(huán)YEPD固體培養(yǎng)基上的菌 種接入YEPD液體培養(yǎng)基中25'C-37。C搖床活化培養(yǎng)12小時-20小時，YEPD液體培養(yǎng)基 組成為酵母抽提物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，經(jīng)高溫滅菌。(3) 種子液準(zhǔn)備用全菊芋粉或者菊芋汁配制種子培養(yǎng)液，不添加任何輔助營養(yǎng)成分， 糖濃度為4%-18% (w/v)，經(jīng)高溫滅菌。將活化的克魯維酵母按0.5%-5% (v/v)量接入種 子培養(yǎng)液中，25'C-37'C搖床培養(yǎng)12小時-60小時，作為后續(xù)發(fā)酵的種子液。(4) 發(fā)酵采用三種發(fā)酵方式。第一、二種為一次投料方式，第三種為補料方式。 第一種，在糖濃度為4%-18% (w/v)菊芋汁中添加全菊芋粉配制發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)總糖濃 度達到20%-30% (w/v)，按照5%-20% (v/v)量接入種子液，在28'C-42。C厭氧條件下攪 拌培養(yǎng)24小時-144小時，結(jié)束發(fā)酵，醪液送去蒸餾。第二種，直接用水溶解全菊芋粉， 攪拌均勻，調(diào)節(jié)總糖濃度達到20%-30% (w/v)，按照5%-20% (v/v)量接入種子液，在 28。C-42。C厭氧條件下攪拌培養(yǎng)24小時-144小時，結(jié)束發(fā)酵，醪液送去蒸餾。第三種，用 水溶解全菊芋粉，攪拌均勻，調(diào)節(jié)總糖濃度達到5%-20% (w/v)，按照5%-20% (v/v)量 接入種子液，在28'C-42'C厭氧條件下攪拌培養(yǎng)12小時以上，補加全菊芋粉，攪拌均勻， 所添加的全菊芋粉與初始使用的全菊芋粉總糖濃度之和達到20%-30% (w/v)，繼續(xù)在28 。C-42。C厭氧條件下攪拌培養(yǎng)，發(fā)酵總時間24小時-144小時，發(fā)酵結(jié)束后醪液送去蒸餾。步驟2菌種活化中的克魯維酵母菌株可以為鷹嘴豆克魯維酵母Y179或以鷹嘴豆克魯 維酵母Y179為宿主細胞所構(gòu)建的工程菌。步驟4發(fā)酵中無論菊芋汁混合全菊芋粉配制的發(fā)酵培養(yǎng)基，還是單獨由全菊芋粉配制 的發(fā)酵培養(yǎng)基，均不用添加任何輔助營養(yǎng)物質(zhì)。本發(fā)明具有如下特點① 種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基成分均由菊芋汁、全菊芋粉配制而成，不需添加任何輔 助營養(yǎng)物質(zhì)；② 發(fā)酵培養(yǎng)基不必預(yù)先糖化處理，實現(xiàn)糖化與發(fā)酵同步進行，從而降低了發(fā)酵成本。③ 發(fā)酵可以在28-42'C區(qū)間進行。④間歇式發(fā)酵方式，發(fā)酵原料菊芋汁、全菊芋粉入罐后不必高溫滅菌，可直接接入種 子液進入發(fā)酵周期。


圖1:鷹嘴豆克魯維酵母Y179在250 ml三角瓶中以菊芋汁和全菊芋粉混合物為原料 分別于3(TC、 37"C發(fā)酵生產(chǎn)乙醇時醪液中乙醇濃度變化曲線圖。圖2:鷹嘴豆克魯維酵母Y179在250 ml三角瓶中以菊芋汁和全菊芋粉混合物為原料 分別于3(TC、 37。C發(fā)酵生產(chǎn)乙醇時醪液上清中總糖變化曲線圖。圖3:鷹嘴豆克魯維酵母Y179在5 L發(fā)酵罐中以全菊芋粉為原料3(TC發(fā)酵生產(chǎn)乙醇 時醪液中乙醇濃度變化曲線圖。圖4:鷹嘴豆克魯維酵母Y179在5 L發(fā)酵罐中以全菊芋粉為原料30。C發(fā)酵生產(chǎn)乙醇時 醪液上清中總糖變化曲線圖。
具體實施方式
實施例1① 原料處理新鮮菊芋5千克用水清洗干凈，取2500克鮮菊芋用榨汁機榨取菊芋汁 液，采用酸解法測定總糖，調(diào)整總糖濃度至10% (w/v)，經(jīng)115'C滅菌20分鐘后，備用。 取2500克鮮菊芋切片，菊芋片放入70'C烘箱中烘干，干菊芋片經(jīng)粉碎機粉碎后，40目篩 子過篩，收集細粉，粗粉繼續(xù)粉碎、過篩，采用酸解法測定40目全菊芋粉總糖含量，所 有40目全菊芋粉裝瓶密封保存?zhèn)溆谩＂?菌種活化取-8(TC凍存的鷹嘴豆克魯維酵母Y179菌株在YEPD固體培養(yǎng)基上劃 線，于30。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時，YEPD固體培養(yǎng)基組成為酵母抽提物10g/L，蛋白 胨20g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，經(jīng)高溫滅菌。取一環(huán)YEPD固體培養(yǎng)基上的菌種 接入裝有3 ml YEPD液體培養(yǎng)基的10 ml試管中，于30°C 250 rpm的搖床中活化培養(yǎng)18 小時，YEPD液體培養(yǎng)基組成為酵母抽提物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，經(jīng) 高溫滅菌。③ 種子液準(zhǔn)備取0.1ml經(jīng)上述活化的鷹嘴豆克魯維酵母Y179細胞培養(yǎng)液接入裝有 10ml菊芋汁培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，培養(yǎng)基總糖濃度為10。％ (w/v)，于30°C 250 rpm的 搖床中培養(yǎng)36小時，作為發(fā)酵的種子液。④ 發(fā)酵準(zhǔn)備兩只250ml三角瓶，在每只三角瓶中裝入50ml總糖濃度為10% (w/v) 菊芋汁和8克全菊芋粉，攪拌均勻，然后各接入步驟③中準(zhǔn)備的5ml種子液， 一只三角瓶 置于30°C搖床中，另一只三角瓶置于37°C搖床中，兩只三角瓶經(jīng)250 rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)8 小時后停止搖動，繼續(xù)靜置發(fā)酵48小時，3(TC搖床中發(fā)酵醪液乙醇濃度達到12% (v/v)、清液殘?zhí)菨舛刃∮?.5% (w/v)， 37。C搖床中發(fā)酵醪液乙醇濃度達到10% (v/v)、清液殘?zhí)?濃度小于1% (w/v)。 實施例2① 原料處理新鮮菊芋10千克用水清洗干凈，切片，菊芋片置7(TC烘箱中烘干，干 菊芋片經(jīng)粉碎機粉碎后，40目篩子過篩，收集細粉，粗粉繼續(xù)粉碎、過篩，合并所有40 目全菊芋粉，采用酸解法測定全菊芋粉總糖含量后，全菊芋粉裝瓶密封保存?zhèn)溆?。稱取約 16克全菊芋粉倒入1000 ml三角瓶中，加入250 ml水，攪拌均勻，總糖含量約5% (w/v)， 高溫滅菌，作為種子培養(yǎng)基備用。② 菌種活化取-80。C凍存的鷹嘴豆克魯維酵母Y179菌株在YEPD固體培養(yǎng)基上劃 線，于30'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時，YEPD固體培養(yǎng)基組成為酵母抽提物10g/L，蛋白 胨20g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，高溫滅菌。取一環(huán)YEPD固體培養(yǎng)基上的菌種接 入裝有3 ml YEPD液體培養(yǎng)基的10 ml試管中，于30°C 250 rpm的搖床中活化培養(yǎng)18小 時，YEPD液體培養(yǎng)基組成為酵母抽提物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，經(jīng)高 溫滅菌。③ 種子液準(zhǔn)備取2.5 ml經(jīng)上述活化的鷹嘴豆克魯維酵母Y179接種于步驟1中準(zhǔn)備 的250 ml種子培養(yǎng)基中，于3(TC 250 rpm轉(zhuǎn)速的搖床中培養(yǎng)24小時，作為發(fā)酵的種子液。 發(fā)酵在5 L發(fā)酵罐中加入800克全菊芋粉和2500 ml水，150rpm轉(zhuǎn)速攪拌均勻 后，85'C蒸煮20分鐘(同時150rpm攪拌)，待罐體冷卻后，加入250ml種子液，300 rpm 轉(zhuǎn)速攪拌，在不通氣的條件下，3(TC發(fā)酵培養(yǎng)144小時，每隔12小時取樣分析醪液中乙 醇和殘?zhí)菨舛?。發(fā)酵醪液乙醇濃度達到12% (v/v)，清液殘?zhí)菨舛葹?.35% (w/v)，糖醇 轉(zhuǎn)化效率達到86%。
權(quán)利要求
1. 一種利用菊芋原料糖化與發(fā)酵同步進行生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于具體步驟如下(1)原料準(zhǔn)備用新鮮菊芋榨取菊芋計，調(diào)整菊芋計的總糖濃度至4％-18％(W/V)；用新鮮菊芋粉碎抽取金菊芋粉；(2)菌種活化取-80℃凍存的克魯維酵母菌株劃線接種于YEPD固體培養(yǎng)基上，在25℃-37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時以上，YEPD固體培養(yǎng)基組成為酵母抽提物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，經(jīng)高溫滅菌；取一環(huán)YEPD固體培養(yǎng)基上的菌種接入YEPD液體培養(yǎng)基中25℃-37℃搖床活化培養(yǎng)12小時-20小時，YEPD液體培養(yǎng)基組成為酵母抽提物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，經(jīng)高溫滅菌；(3)種子液準(zhǔn)備用全菊芋粉或者菊芋汁配制種子培養(yǎng)液，糖濃度為4％-18％(w/v)，經(jīng)高溫滅菌；將活化的克魯維酵母按0.5％-5％(v/v)量接入種子培養(yǎng)液中，25℃-37℃搖床培養(yǎng)12小時-60小時，作為后續(xù)發(fā)酵的種子液；(4)發(fā)酵采用如下三種發(fā)酵方式之一種第一種，在糖濃度為4％-18％(w/v)菊芋汁中添加全菊芋粉配制發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)總糖濃度達到20％-30％(w/v)，按照5％-20％(v/v)量接入種子液，在28℃-42℃厭氧條件下攪拌培養(yǎng)24小時-144小時，結(jié)束發(fā)酵，醪液送去蒸餾；第二種，直接用水溶解全菊芋粉，攪拌均勻，調(diào)節(jié)總糖濃度達到20％-30％(w/v)，按照5％-20％(v/v)量接入種子液，在28℃-42℃厭氧條件下攪拌培養(yǎng)24小時-144小時，結(jié)束發(fā)酵，醪液送去蒸餾；第三種，用水溶解全菊芋粉，攪拌均勻，調(diào)節(jié)總糖濃度達到5％-20％(w/v)，按照5％-20％(v/v)量接入種子液，在28℃-42℃厭氧條件下攪拌培養(yǎng)12小時以上，補加全菊芋粉，攪拌均勻，所添加的全菊芋粉與初始使用的全菊芋粉總糖濃度之和達到20％-30％(w/v)，繼續(xù)在28℃-42℃厭氧條件下攪拌培養(yǎng)，發(fā)酵總時間24小時-144小時，發(fā)酵結(jié)束后醪液送去蒸餾。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種利用菊芋原料生產(chǎn)乙醇的方法。該方法包括，原料處理鮮菊芋清洗干凈，榨汁，或切片，烘干，磨粉；種子液制備克魯維酵母在以菊芋粉或菊芋汁為完全組分的種子培養(yǎng)液中培養(yǎng)；發(fā)酵全菊芋汁或全菊芋粉配制的培養(yǎng)基中接入種子液，厭氧發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，最后蒸餾獲得乙醇。本發(fā)明中種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基成分均為菊芋汁或菊芋粉，不需添加任何輔助成分，而且發(fā)酵培養(yǎng)基中的菊芋原料不需預(yù)先糖化處理，利用種子液中克魯維酵母所分泌產(chǎn)生的菊粉酶直接水解糖化菊芋原料中的多聚果糖，并同時進行發(fā)酵，產(chǎn)物乙醇濃度達到12％(v/v)。本發(fā)明方法簡單，實現(xiàn)糖化與發(fā)酵同步進行，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12R1/645GK101265485SQ20081003711
公開日2008年9月17日 申請日期2008年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月8日
發(fā)明者靜 俞, 劉建平, 李育陽, 江佳稀 申請人:復(fù)旦大學(xué)