專利名稱：念珠菌、嗜血菌和支原體組合培養(yǎng)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥用試劑盒，尤其是涉及念珠菌、嗜血菌和支原體組合培 養(yǎng)試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
念珠菌、嗜血菌和支原體是人類泌尿生殖道中危害人體健康的常見致病微生 物，主要引起尿道炎、陰道炎、前列腺炎、宮頸炎、盆腔炎、不孕不育、新生兒感 染等疾病。
目前，臨床上對念珠菌、嗜血菌和支原體的檢測主要采用培養(yǎng)基培養(yǎng)。這種 培養(yǎng)方法在靈敏度、特異性、穩(wěn)定性等方面存在著一定缺陷，對最終檢測結(jié)果判斷 的準(zhǔn)確性產(chǎn)生不良影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種操作簡便、方: 法可靠、性質(zhì)穩(wěn)定、結(jié)果易于觀察和判斷的念珠菌、嗜血菌和支原體組合培養(yǎng)試劑: 盒及其應(yīng)用。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)
念珠菌、嗜血菌和支原體組合培養(yǎng)試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括培養(yǎng)基、 C02發(fā)生片，所述的培養(yǎng)基包括念珠菌培養(yǎng)基、嗜血菌培養(yǎng)基、支原體培養(yǎng)基， 所述的培養(yǎng)基的pH值為6.3±0.5。
所述的培養(yǎng)基的配方(每1000ml)包括
基礎(chǔ)基 600~800ml; 馬或牛血清 50~200ml; 酵母提取物 2~8g;
尿素 2~10g;L-精氨酸鹽酸鹽 l~5g;酚紅 0.1~0.8g;復(fù)合生長因子 5~20ml;抗生素 5~20ml;葡萄糖 5~20g;瓊脂 10 12g;所述的嗜血菌培養(yǎng)基的配方還包括血紅蛋白或10%血清或2%卵黃 10~30g/l000ml培養(yǎng)基。所述的基礎(chǔ)基的配方(每1000ml)包括牛心粉5~20g、蛋白胨l~10g、 NaC12 8g。所述的復(fù)合生長因子包括1%DMEM、 0.5MDNA和1%胱氨酸等。 所述的抗生素選自慶大霉素、氯霉素、萬古霉素、多粘菌素、氟康唑、青霉菌素中的一種或幾種。一種念珠菌、嗜血菌和支原體組合培養(yǎng)試劑盒的應(yīng)用方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1) 取待檢標(biāo)本；(2) 將待檢標(biāo)本劃線接種于念珠菌培養(yǎng)基、嗜血菌培養(yǎng)基和支原體培養(yǎng)基上；(3) 將培養(yǎng)基于30 37'C培養(yǎng)24 48小時(shí)，觀察生長情況；(4) 結(jié)果分析a. 培養(yǎng)基變色和肉眼可見典型念珠菌菌落，則念珠菌陽性，其中大的、綠色 為白色念珠菌，蘭灰色為熱帶念珠菌，粉紅色為克柔念珠菌，其它念珠菌為白色至 粉色；b. 培養(yǎng)基肉眼可見典型嗜血菌菌落，則嗜血菌陽性，其中加德納菌、鏈球菌 和淋病奈瑟菌等的菌落為肉眼可見、小的透明或半透明；c. 培養(yǎng)基由淡黃色變紅色或紫紅色，顯微鏡下放大40 100倍，看到棕褐色的 解脲脲原體菌落和人型支原體的油煎蛋樣菌落，則支原體陽性。所述的待檢標(biāo)本包括人類泌尿生殖道分泌物、尿、前列腺液或精液等。 本發(fā)明用于念珠菌、嗜血菌和支原體的檢測，也可用于男女性秘尿生殖道的微 生態(tài)的評價(jià)，確診細(xì)菌性、念珠菌性、支原體性的感染及其療效的評價(jià)。本發(fā)明的培養(yǎng)基使用的原料、蒸餾水無毒和無放射性，不含對人體有害的物質(zhì)， 并僅用于體外診斷，不與人體接觸，不會對使用人員的身體健康造成任何危害。培 養(yǎng)基生產(chǎn)、質(zhì)控和包裝過程中無污水、無污物、無放射性產(chǎn)生和排放，沒有任何環(huán) 保問題。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明念珠菌、嗜血菌和支原體組合培養(yǎng)試劑盒具有操作簡 便、方法可靠、性質(zhì)穩(wěn)定、結(jié)果易于觀察和判斷等特點(diǎn)，提供一種更科學(xué)、更方便、 更人性化、更準(zhǔn)確的診斷工具，有利于生物或醫(yī)療實(shí)踐和商品化運(yùn)輸，具有良好的 社會及經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。 實(shí)施例1一種念珠菌、嗜血菌和支原體組合培養(yǎng)試劑盒，具體如下 1.組成、配方與原理 1.1組成培養(yǎng)基、C02發(fā)生片1.2配方每升包括以下成分，pH為6.3士0.5 (25±1°C)，固相加瓊脂10~12g基礎(chǔ)基(含牛心粉10g、蛋白胨5g、 NaC15g) 700ml馬(或牛)血清 100ml酵母提取物 4g尿素 6gL-精氨酸鹽酸鹽 3g酚紅 0.5g復(fù)合生長因子 10ml抗生素 10ml葡萄糖 10g嗜血菌培養(yǎng)基另加血紅蛋白 20g復(fù)合生長因子包括1%DMEM 3ml、 0.5%DNA 3ml和1%胱氨酸4ml;念珠 菌培養(yǎng)基的抗生素為慶大霉素，嗜血菌培養(yǎng)基的抗生素為萬古霉素5ml和多粘菌 素5ml，支原體培養(yǎng)基的抗生素為氟康唑4ml和青霉菌素6ml。1.3原理本發(fā)明培養(yǎng)基偏酸(pH6.3±0.5)，含有嗜血菌、念珠菌、解脲支 原體與人型支原體生長的豐富營養(yǎng)，該培養(yǎng)基可用于淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)、 腦膜炎奈瑟菌(N.meningitis)、鏈球菌屬Streptococcus、加德納菌(Gardnerella vaginalis)和幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)的生長、分離培養(yǎng)和傳代，還含尿 素(解脲支原體鑒定的底物)和精氨酸(人型支原體鑒定的底物)、酚紅指示劑， 和抑菌劑(可抑制人體內(nèi)大多數(shù)的細(xì)菌)。當(dāng)解脲支原體或人型支原體在該培養(yǎng)基中生長，就能分解尿素或精氨酸，產(chǎn) 銨，使培養(yǎng)基pH上升(pH7.0或8.0以上)，變堿，酚紅出現(xiàn)顏色變化，就可指 示解脲支原體或人型支原體的生長。解脲支原體或人型支原體的分離、正確的鑒定 須在固體培養(yǎng)基上，根據(jù)菌落特征進(jìn)行。固體培養(yǎng)基除看顏色變化外(由淡黃色變 紅色或紫紅色)，在顯微鏡下放大40~100倍，能看到棕褐色的解脲支原體菌落和 油煎蛋樣的人型支原體菌落。嗜血菌在培養(yǎng)基上的出現(xiàn)肉眼可見的，無色(或紅色)透明或不透明針尖樣 小菌落，加德納菌、鏈球菌和淋病奈瑟菌等的菌落為肉眼可見、小的透明或半透明。念珠菌在培養(yǎng)基上的菌落為白色或奶白色或顯色等，大的、綠色為白色念珠 菌，蘭灰色為熱帶念珠菌，粉紅色為克柔念珠菌，其它念珠菌為白色至粉色。2. 色澤嗜血菌培養(yǎng)基為巧克力色、棗紅色或淡黃色固體；念珠菌培養(yǎng)基、 支原體培養(yǎng)基為黃色透明固體。3. 狀態(tài)固體，表面光滑平整，無氣泡，無裂紋。4. 裝量檢測方法打開被檢樣品蓋子，用刻度吸管吸取液體(固體在微波爐中加熱 溶解后)并測其裝量。結(jié)果培養(yǎng)基為2.5 4ml，層厚度為3ml，不多于或少于規(guī)定裝量的10%。5. pH值偏酸(pH6.3±0.5)，適合念珠菌、嗜血菌和支原體生長的pH值為 5.0-7.0。6. 特異性選用泌尿生殖道中有代表性的常見菌大腸埃希氏菌ATCC25922、 金黃色葡萄球菌ATCC25923對培養(yǎng)基的特異性進(jìn)行考核。菌種大腸埃希菌(ATCC25922)由中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心提供金黃色葡萄球菌(ATCC25923)由中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心提供設(shè)備培養(yǎng)箱(36°C±1°C)，無菌吸管，營養(yǎng)瓊脂平板，沙包弱培養(yǎng)基 方法(1) 將測試所需細(xì)菌(大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌)分別接種于營養(yǎng)瓊脂平板，經(jīng)37。C24h培養(yǎng)后，用生理鹽水配制成細(xì)菌懸液(濃度為2"06個(gè)菌/1111)， 置4'C備用(6h內(nèi)使用)；(2) 用無菌吸管分別吸取O.lml大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌懸液，分別加 入到被檢培養(yǎng)基中，然后置培養(yǎng)箱(36°C±1°C)培養(yǎng)；(3) 培養(yǎng)24h后，取出觀察結(jié)果；(4) 結(jié)果大腸埃希菌生長，金黃色葡萄球菌不生長。7. 敏感性選取3個(gè)念珠菌、淋病奈瑟菌和解脲脲原體的臨床分離株，接種量約102CFU/ml 105CFU/ml時(shí)，固體培養(yǎng)基變色和能看到典型菌落，對培養(yǎng)基的 敏感性進(jìn)行考核。選擇接種量在102CFU/ml 105CFU/ml，主要考慮以下因素1) 絕大多數(shù)臨床樣本淋病奈瑟菌的濃度在102CFU/ml 105CFU/ml; 2)因?yàn)榻臃N量為 10kFU/ml左右時(shí)，接種量小，淋病奈瑟菌在微孔中的分布可能不均勻；接種量為 105CFU/ml以上時(shí)，相對濃度較大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣可能存在偏差。8. 準(zhǔn)確性菌種淋病奈瑟菌(CMCC29106) 37。C48h培養(yǎng)物解脲脲原體(ATCC27618) 37'C24h培養(yǎng)物白色念珠菌(ATCC 10231) 37。C48h培養(yǎng)物 設(shè)備培養(yǎng)箱(36°C±1°C)，無菌吸管 方法(1) 取被檢培養(yǎng)基；(2) 用無菌吸管各吸取O.lml念珠菌、淋病奈瑟菌和解脲脲原體上述菌種培養(yǎng) 物加入到培養(yǎng)基中，然后置培養(yǎng)箱(36°c±rc)培養(yǎng)；(3) 培養(yǎng)，取出觀察結(jié)果；(4) 結(jié)果培養(yǎng)已知的目標(biāo)菌淋病奈瑟菌標(biāo)準(zhǔn)株(CMCC29106) 48h培養(yǎng)基 上應(yīng)生長，菌落為無色(或紅色)透明或半透明針尖樣小菌落；培養(yǎng)已知的解脲脲 原體(ATCC27618) 37'C36h，固體培養(yǎng)基變色和能看到典型菌落；培養(yǎng)已知的白 色念珠菌(ATCC10231) 37°C36h，固體培養(yǎng)基變色和能看到典型菌落；用非目標(biāo)菌金黃色葡萄球菌(ATCC25923)標(biāo)準(zhǔn)株等接種在培養(yǎng)基上不生長。9. 規(guī)格20人份/每盒。10. 微生物要求包裝開封后，培養(yǎng)基無肉眼可見的混濁或菌落。將沒有接種 任何標(biāo)本的培養(yǎng)基置35'C-37'C隔水恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，確認(rèn)生產(chǎn)過程沒 有造成污染，驗(yàn)證用戶使用過程中的一般性操作不會造成雜菌污染培養(yǎng)基。11. 重復(fù)性(批內(nèi)差)控制產(chǎn)品的批內(nèi)差，每一批產(chǎn)品隨機(jī)抽樣5人份，按 產(chǎn)品要求檢驗(yàn)，差異不大于SD士0.5。12. 批間差異要求控制產(chǎn)品的批間差異，三批不同產(chǎn)品隨機(jī)抽樣5人份，按 產(chǎn)品要求檢驗(yàn)，差異不大于SD士0.5。13. 穩(wěn)定性本發(fā)明從生產(chǎn)日起，有效期為3個(gè)月。穩(wěn)定性是試劑類產(chǎn)品的一 項(xiàng)重要指標(biāo)，本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定在保存期間和末對留樣進(jìn)行規(guī)定的試驗(yàn)， 一方面可以檢測 試劑本身的長期穩(wěn)定性，另一方面也可以檢測試劑包裝材料的長期穩(wěn)定性，從而確 保在保存期內(nèi)試劑質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求。14. 有效期在2 8"C有效期為3個(gè)月。 實(shí)施例2一種念珠菌、嗜血菌和支原體組合培養(yǎng)試劑盒，包括培養(yǎng)基、co2發(fā)生片， 培養(yǎng)基pH為6.3±0.5 (25士rC)。所述的培養(yǎng)基的配方(每1000ml)包括基礎(chǔ)基(含牛心粉20g、蛋白胨lg、 NaC12g)600ml馬(或牛)血清200ml酵母提取物2g尿素10gL-精氨酸鹽酸鹽lg酚紅0.8g復(fù)合生長因子20ml抗生素20ml葡萄糖5g瓊脂10g嗜血菌培養(yǎng)基另加10°/。血清20g復(fù)合生長因子包括l%DMEM5ml、 0.5%DNA 7ml和1%胱氨酸8ml;念珠菌 培養(yǎng)基的抗生素為氯霉素，嗜血菌培養(yǎng)基的抗生素為萬古霉素6ml和多粘菌素 14ml，支原體培養(yǎng)基的抗生素為氟康唑5ml和青霉菌素15ml。上述念珠菌、嗜血菌和支原體組合培養(yǎng)試劑盒的應(yīng)用方法，包括以下步驟(1) 取待檢標(biāo)本，包括人類泌尿生殖道分泌物、尿、前列腺液或精液等；(2) 將待檢標(biāo)本劃線接種于培養(yǎng)基念珠菌培養(yǎng)基、嗜血菌培養(yǎng)基和支原體培 養(yǎng)基上；(3) 將培養(yǎng)基于30 37。C培養(yǎng)24 48小時(shí)，觀察生長情況；(4) 結(jié)果分析-a. 培養(yǎng)基變色和肉眼可見典型念珠菌菌落，則念珠菌陽性，其中大的、綠色 為白色念珠菌，蘭灰色為熱帶念珠菌，粉紅色為克柔念珠菌，其它念珠菌為白色至 粉色；b. 培養(yǎng)基肉眼可見典型嗜血菌菌落，則嗜血菌陽性，其中加德納菌、鏈球菌 和淋病奈瑟菌等的菌落為肉眼可見、小的透明或半透明；c. 培養(yǎng)基由淡黃色變紅色或紫紅色，顯微鏡下放大40 100倍，看到棕褐色的 解脲脲原體菌落和人型支原體的油煎蛋樣菌落，則支原體陽性。實(shí)施例3一種念珠菌、嗜血菌和支原體組合培養(yǎng)試劑盒，包括培養(yǎng)基、C02發(fā)生片，培養(yǎng)基pH為6.3士0.5 (25士rC)。所述的培養(yǎng)基的配方(每1000ml)包括基礎(chǔ)基(含牛心粉5g、蛋白胨10g、 NaC18g) 800ml馬(或牛)血清 50ml酵母提取物 8g尿素 2gL-精氨酸鹽酸鹽 5g酚紅 O.lg復(fù)合生長因子 5ml抗生素 5ml葡萄糖 20g瓊脂 12g 嗜血菌培養(yǎng)基另加2%卵黃 5g復(fù)合生長因子包括l%DMEM2ml、 0.5%DNA lml和1%胱氨酸2ml;念珠 菌培養(yǎng)基的抗生素為氯霉素，嗜血菌培養(yǎng)基的抗生素為萬古霉素lml和多粘菌素 4ml，支原體培養(yǎng)基的抗生素為氟康唑2ml和青霉菌素3ml。
權(quán)利要求
1.念珠菌、嗜血菌和支原體組合培養(yǎng)試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括培養(yǎng)基、CO2發(fā)生片，所述的培養(yǎng)基包括念珠菌培養(yǎng)基、嗜血菌培養(yǎng)基、支原體培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基的pH值為6.3±0.5。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的念珠菌、嗜血菌和支原體組合培養(yǎng)試劑盒，其特征 在于，所述的培養(yǎng)基的配方(每1000ml)包括基礎(chǔ)基600 800ml;馬或牛血清50 200ml;酵母提取物2 8g;尿素2~10g;L-精氨酸鹽酸鹽l~5g;酚紅0.1~0.8g;復(fù)合生長因子5~20ml;抗生素5~20ml;葡萄糖5~20g;瓊脂10~12g;所述的嗜血菌培養(yǎng)基的配方還包括血紅蛋白或10%血清或2%卵黃 10 30g/1000ml培養(yǎng)基。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的念珠菌、嗜血菌和支原體組合培養(yǎng)試劑盒，其特征 在于，所述的基礎(chǔ)基的配方(每1000ml)包括牛心粉5~20g、蛋白胨l 10g、 NaC12 8g。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的念珠菌、嗜血菌和支原體組合培養(yǎng)試劑盒，其特征 在于，所述的復(fù)合生長因子包括1%DMEM、 0.5MDNA和1%胱氨酸等。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的念珠菌、嗜血菌和支原體組合培養(yǎng)試劑盒，其特征 在于，所述的抗生素選自慶大霉素、氯霉素、萬古霉素、多粘菌素、氟康唑、青 霉菌素中的一種或幾種。
6. —種念珠菌、嗜血菌和支原體組合培養(yǎng)試劑盒的應(yīng)用方法，其特征在于， 該方法包括以下步驟(1) 取待檢標(biāo)本；(2) 將待檢標(biāo)本劃線接種于念珠菌培養(yǎng)基、嗜血菌培養(yǎng)基和支原體培養(yǎng)基上；(3) 將培養(yǎng)基于30 37'C培養(yǎng)24 48小時(shí)，觀察生長情況；(4) 結(jié)果分析-a. 培養(yǎng)基變色和肉眼可見典型念珠菌菌落，則念珠菌陽性，其中大的、綠色 為白色念珠菌，蘭灰色為熱帶念珠菌，粉紅色為克柔念珠菌，其它念珠菌為白色至 粉色；b. 培養(yǎng)基肉眼可見典型嗜血菌菌落，則嗜血菌陽性，其中加德納菌、鏈球菌 和淋病奈瑟菌等的菌落為肉眼可見、小的透明或半透明；c. 培養(yǎng)基由淡黃色變紅色或紫紅色，顯微鏡下放大40 100倍，看到棕褐色的 解脲脲原體菌落和人型支原體的油煎蛋樣菌落，則支原體陽性。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種念珠菌、嗜血菌和支原體組合培養(yǎng)試劑盒的應(yīng) 用方法，其特征在于，所述的待檢標(biāo)本包括人類泌尿生殖道分泌物、尿、前列腺液 或精液等。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種念珠菌、嗜血菌和支原體組合培養(yǎng)試劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒包括培養(yǎng)基、CO₂發(fā)生片，所述的培養(yǎng)基包括念珠菌培養(yǎng)基、嗜血菌培養(yǎng)基、支原體培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基的pH值為6.3±0.5，本發(fā)明用于念珠菌、嗜血菌和支原體的檢測，也可用于男女性泌尿生殖道的微生態(tài)的評價(jià)，確診細(xì)菌性、念珠菌性、支原體性的感染及其療效的評價(jià)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明念珠菌、嗜血菌和支原體組合培養(yǎng)試劑盒具有操作簡便、方法可靠、性質(zhì)穩(wěn)定、結(jié)果易于觀察和判斷等特點(diǎn)，提供一種更科學(xué)、更方便、更人性化、更準(zhǔn)確的診斷工具，有利于生物或醫(yī)療實(shí)踐和商品化運(yùn)輸，具有良好的社會及經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C12Q1/04GK101270382SQ20081003748
公開日2008年9月24日 申請日期2008年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月15日
發(fā)明者鷹 葉, 李書君, 楊敬芳 申請人:鷹 葉