專利名稱：：轉(zhuǎn)錄因子圈套序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)錄因子圈套序列及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：神經(jīng)干細(xì)胞是一種可以分化為神經(jīng)元，膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞并且可以自我更新以補(bǔ)充大腦細(xì)胞的細(xì)胞，有效的促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向所需的表型分化為神經(jīng)退行性病變和神經(jīng)系統(tǒng)損傷的功能重建帶來了令人振奮的希望。Snyder等從新生小鼠神經(jīng)外胚層細(xì)胞建立了(^17.2永生性神經(jīng)干細(xì)胞株，大量的試驗(yàn)已經(jīng)證明其可以分化為神經(jīng)元，膠質(zhì)細(xì)胞和少突細(xì)胞，尤其由于永生化的細(xì)胞本身所具有的容易貯備，管理，可商品化培養(yǎng)的特點(diǎn)，使對(duì)C17.2的研究成為當(dāng)前的熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄因子圈套(TFD)策略(transcriptionfactor"decoy"strategy)是應(yīng)用與順式元件相一致的人工合成的寡核苷酸雙鏈(ODNs)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,競(jìng)爭結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，從而抑制正常的內(nèi)源性基因表達(dá)，目前不論在體外還是在體內(nèi)，既可作為基因表達(dá)調(diào)節(jié)研究的新方法，又可作為一種新型的基因治療手段，具有以下優(yōu)點(diǎn)潛在的藥物靶點(diǎn)(轉(zhuǎn)錄因子)非常豐富；圈套ODNs的合成相對(duì)簡單且可靶向特異的組織；不必弄清靶性轉(zhuǎn)錄因子的精確分子結(jié)構(gòu)；圈套ODNs可阻斷與同一順式元件連接的多種轉(zhuǎn)錄因子的效應(yīng)，其抑制構(gòu)成性表達(dá)因子的能力比反義ODNs更強(qiáng)，因此國外眾多學(xué)者一致認(rèn)為該策略可作為一種有效的手段用于治療某些人類疾病。肝細(xì)胞核因子4(HNF4-1)和Myc相關(guān)的鋅指蛋白l(MAZ-1)能夠直接進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,從而對(duì)機(jī)體的各種生理活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控,具有重要的作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一在于提供一種轉(zhuǎn)錄因子圈套序列。本發(fā)明的目的之二在于提供該轉(zhuǎn)錄因子在促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的方向分化中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之三在于提供該轉(zhuǎn)錄因子圈套序列在增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞的遷移能力中的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種轉(zhuǎn)錄因子圈套序列，其特征在于該圈套序列具有序列表中SEQNO1_5所示的序列。上述的轉(zhuǎn)錄因子圈套序列在促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的方向分化中的應(yīng)用。上述的轉(zhuǎn)錄因子圈套序列在增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞的遷移能力中的應(yīng)用。通過Invitrogen公司合成了轉(zhuǎn)錄因子MAZ-1，HNF4-1的圈套序列，經(jīng)過RealtimePCR檢測(cè)MAZ-1(46mer)和HNF4-1(42mer)dODNs共同作用對(duì)靶基因Rho-GDIy的下調(diào)效果最好。當(dāng)MAZ-1，HNF4-1dODNs轉(zhuǎn)染入神經(jīng)干細(xì)胞C17.2后，MTT法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞的增殖沒有影響，但是其細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著的變化，經(jīng)免疫組化雙染色證實(shí)神經(jīng)干細(xì)胞C17.2具有向神經(jīng)元方向分化的趨勢(shì)，體外遷移試驗(yàn)證明MAZ-1，HNF4-1dODNs能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的遷移。本發(fā)明為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病及移植的廣泛應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。圖1為實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)MAZ-1和HNF4-ldODNs對(duì)目的基因Rho-GDlYmRNA表達(dá)水平的影響。圖2MTT法檢測(cè)MAZ-1和HNF4-1dODNs對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖的影響。圖3免疫組化雙染色證實(shí)神經(jīng)干細(xì)胞(:17.2具有向神經(jīng)元方向分化的趨勢(shì)。圖4體外遷移試驗(yàn)證明MAZ-1，HNF4-1dODNs能夠促進(jìn)神經(jīng)千細(xì)胞的遷移。具體實(shí)施例方式采用如下的具體實(shí)施方案實(shí)施例一MAZ-1,HNF4-1轉(zhuǎn)錄因子圈套的設(shè)計(jì)，參見表l本實(shí)驗(yàn)不僅設(shè)計(jì)了無意的對(duì)照圈套序列(nonsensecontroldODNs:53mer)，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)序列相一致的圈套序列(MAZ-1:14mer;HNF4-l:20mer)，而且為了保證圈套序列的穩(wěn)定性，提高圈套序列的作用效果，還設(shè)計(jì)了分別包含兩段或者三段與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)相一致的序列，中間包含/的酶切位點(diǎn)(MAZ-l:30mer，46mer;HNF4-l:42mer)。表lMAZ1，HNF4-1轉(zhuǎn)錄因子圈套寡核苷酸序列和無意的對(duì)照序列(橫線表示與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)一致的序列)。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實(shí)施例二在Lipofectamine2000介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞系C17.2，三天后用RNeasyMiniKit(Qiagen,USA)抽提轉(zhuǎn)染72小時(shí)的細(xì)胞的腿，再根據(jù)TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶以oligo(dT)為引物將抽提的總RNA反轉(zhuǎn)成第一鏈cDNA。然后，通過引物(Rho-GDI"/,GAPDH)進(jìn)行PCR以檢測(cè)目的基因Rho-GDt/，內(nèi)標(biāo)為GAPDH。Realtime-PCR結(jié)果，參見圖1。顯示顯示不同的MAZ-1,HNF4-1dODNs對(duì)其作用的靶基因Rho-GDlY的作用效果不同，但是均具有抑制作用，46mer的斷Z-l和42mer的HNF4-1共同作用對(duì)效果最好。*,p<0.05，**,p<0.01。實(shí)施例三在LipofectamineTM2000介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染MAZ-1(46mer)和HNF4-1(42mer)dODNs神經(jīng)干細(xì)胞系C17.2實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，培養(yǎng)12、24、36、48小時(shí)后，96孔板各孔加入5mg/mLMTT液體20^1，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。然后取出培養(yǎng)板，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入200plDMSO,酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀自動(dòng)振搖培養(yǎng)板l分鐘，以490nm為參考波長測(cè)定吸光度值。圖2結(jié)果顯示HNF4-l和MAZ-ldODNs對(duì)細(xì)胞的增殖沒有明顯影響。實(shí)施例四在用MAZ-1(46mer)和HNF4-1(42mer)d0DNs轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞系C17.2五天后，在激光共聚焦顯微鏡下分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組(圖3E，31)和對(duì)照組(圖3A)進(jìn)行常光觀察，同時(shí)拍攝照片以做記錄。棄培養(yǎng)基，用緩沖溶液漂洗細(xì)胞后，進(jìn)行Nestin和neurofilament(NF)免疫組化雙染色，用FITC/TRITC偶連的二抗顯色，在特定波長的熒光下表達(dá)NF的細(xì)胞發(fā)紅色的熒光(TRITC)，表達(dá)Nestin的細(xì)胞發(fā)綠色熒光(FITC)，結(jié)果顯示對(duì)照組細(xì)胞的形態(tài)比較規(guī)則(圖3A)，僅有Nestin被檢測(cè)到；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變(圖3E,31),長出很長的神經(jīng)突起，不僅檢測(cè)到Nestin(圖3G,3K)，并且檢測(cè)neurofilament(NF)(圖3M,30)也有表達(dá)，但是未檢測(cè)出GFAP的表達(dá)，這表明當(dāng)Rho-GDIy下調(diào)之后神經(jīng)干細(xì)胞系C17.2有向神經(jīng)元細(xì)胞分化的趨勢(shì)。實(shí)施例五在完全相同的培養(yǎng)條件下，以共轉(zhuǎn)染MAZ-1(46mer)和HNF4-1(42mer)dODNs和pEGFP-Cl質(zhì)粒的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，以轉(zhuǎn)染相同數(shù)量無意對(duì)照序列的細(xì)胞和不做任何處理的細(xì)胞為對(duì)照組，連續(xù)30小時(shí)測(cè)量兩組細(xì)胞平均溝間距離(averagegaps,AGs)。以對(duì)照組第1天的AGs為100%,測(cè)連續(xù)30小時(shí)之內(nèi)，對(duì)照組細(xì)胞(圖6A-D)的AGW分別為100±4，78±2,64±5;無意序列細(xì)胞(圖6E-H)的AG。/。分別為102±7，80±9，68±6;實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞(圖61-L)的AG。/6分別為100±7，56±8，42土4。隨著時(shí)間的推移，MAZ-1(46mer)和HNF4-1(42mer)dODNs處理過的試驗(yàn)組細(xì)胞向中間生長的越來越多，表明細(xì)胞遷移能力較強(qiáng)；而對(duì)照組細(xì)胞遷移能力較弱，表明轉(zhuǎn)錄因子MAZ-1和HNF4-1與神經(jīng)干細(xì)胞的遷移能力密切相關(guān)。序列表〈110〉上海大學(xué)〈120>轉(zhuǎn)錄因子圈套序列及其應(yīng)用<160>5〈210〉1<211>20〈212〉腿〈213〉人工合成〈400>1TCATTGCCAAAGGGCACGAT〈210〉2〈211〉42〈212〉DNA〈213>人工合成<400〉2TCATTGCCAAAGGGCACTGAATTCATTGCCAAAGGGCACGAT<210〉3〈211〉14〈212>DNA〈213>人工合成<400〉3TATGGGGAGGGACT〈210〉4〈211〉30〈212〉DNA<213>人工合成〈400>4TATGGGGAGGGTGAATTCAGGGGAGGGACT〈210〉5<211>46〈212〉薩<213>人工合成〈400〉5TATGGGGAGGGTGAATTCAGGGGAGGGTGAATTCAGGGGAGGGACT權(quán)利要求1.一種轉(zhuǎn)錄因子圈套序列，其特征在于該圈套序列具有序列表中SEQNO1-5所示的序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子圈套序列在促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的方向分化中的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子圈套序列在增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞的遷移能力中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)錄因子圈套序列及其應(yīng)用。當(dāng)神經(jīng)干細(xì)胞C17.2轉(zhuǎn)染本發(fā)明的圈套序列，對(duì)其目的基因Rho-GDIγ具有明顯的抑制作用。MTT法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞的增殖沒有影響，但是其細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著的變化，經(jīng)免疫組化雙染色證實(shí)神經(jīng)干細(xì)胞C17.2具有向神經(jīng)元方向分化的趨勢(shì)，體外遷移試驗(yàn)證明本發(fā)明的圈套序列能夠促進(jìn)細(xì)胞的遷移，本發(fā)明為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病及移植的廣泛應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。文檔編號(hào)C12N15/11GK101280303SQ20081003773公開日2008年10月8日申請(qǐng)日期2008年5月20日優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日發(fā)明者劉小燕,文鐵橋,霄李,嬌王申請(qǐng)人:上海大學(xué)