專利名稱：一種提高桿狀病毒表達(dá)載體表達(dá)目的基因水平的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高桿狀病毒表達(dá)載體表達(dá)目的基因水平 的方法。
背景技術(shù)：
桿狀病毒是自然界存在的一類天然宿主為鱗翅目和鞘翅目昆蟲的病毒，被用作防治農(nóng) 林害蟲的生物農(nóng)藥和在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的基因工程表達(dá)載體。其標(biāo)準(zhǔn)株為苜蓿銀紋 夜蛾核型多角體病毒(Ji/to《rap力a csh'/orm'ca multicapsid nucleopolyhedrovirus， 簡稱Ac麗PV)。
桿狀病毒一昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)最早由Smith & Summer于1983年建立1，經(jīng)過20多年 的發(fā)展現(xiàn)在已經(jīng)成為了一種最常用的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。其基本原理是將目的基因置于桿 狀病毒超量表達(dá)啟動子的調(diào)控下，使目的基因在感染末期超量表達(dá)。桿狀病毒感染昆蟲細(xì) 胞時，在感染的極晚期有兩個蛋白質(zhì)可以超量表達(dá)多角體蛋白和plO蛋白。它們對病毒 在體外培養(yǎng)細(xì)胞中復(fù)制都是非必須的，所以可以利用這兩個基因的啟動子啟動目的基因的 表達(dá)，可以在感染末期高水平地生產(chǎn)所需的蛋白。其主要的優(yōu)點有2' 3:病毒遺傳背景清楚； 基因容量大，能承載較大目的基因；生物安全性好，天然情況下不能感染人類；表達(dá)目的 蛋白效率高；可對表達(dá)的蛋白進(jìn)行糖基化修飾；容易擴(kuò)大規(guī)模，達(dá)到生產(chǎn)要求。迄今，已 經(jīng)通過桿狀病毒一 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了各種目的基因數(shù)以千計，例如雞胃酶解肌 球蛋白4、視紫質(zhì)激酶5、人類beta-干擾素'等。綜合其特點，桿狀病毒是一種優(yōu)良的蛋白 表達(dá)載體，尤其適合于生物工程的酶類，藥物類等活性蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)。但是，桿狀病 毒載體表達(dá)目的基因時，其表達(dá)水平與天然的多角體蛋白的表達(dá)水平仍有非常大的差距， 表明目的蛋白表達(dá)水平仍然有較大的提高空間。
染色質(zhì)調(diào)控元件是一類通過調(diào)節(jié)DNA組蛋白的甲基化、乙?；?，及調(diào)節(jié)染色質(zhì)區(qū)室化 來改變DNA的高級結(jié)構(gòu)，影響DNA的轉(zhuǎn)錄活性的序列。其代表包括絕緣子，如雞的e球蛋 白基因HS4絕緣子，果蠅的scs和scs' ，gyp絕緣子等。它能阻止異染色質(zhì)的擴(kuò)散，以維 持被保護(hù)基因的持續(xù)表達(dá)6'7。目前絕緣子序列被廣泛應(yīng)用于血液病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因 治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可提高桿狀病毒表達(dá)載體表達(dá)目的基因水平的方法。 本發(fā)明提出的提高桿狀病毒表達(dá)載體表達(dá)目的基因的方法，是在桿狀病毒基因組中的適當(dāng)位置插入真核細(xì)胞染色質(zhì)調(diào)控元件的DNA序列。
本發(fā)明中，所述適當(dāng)位置包括鄰近目的基因表達(dá)框的上游一側(cè)或下游一側(cè)，或上、下 游兩側(cè)，或其他合適的任何位置。
本發(fā)明中，所述的桿狀病毒，包括但不限于苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(A/"^ra; 力s csJi/br"ica multicapsid nucleopolyhedrovirus， AcMNPV)。
本發(fā)明中，目的基因表達(dá)通過病毒感染細(xì)胞進(jìn)行；其使用的細(xì)胞株包括但不限于草地 夜蛾細(xì)胞系SF9;其表達(dá)的目的基因沒有限制。
本發(fā)明中，所述的染色質(zhì)調(diào)控元件包括但不限于和和絕緣子(insulator)(如雞的P球 蛋白基因HS4絕緣子，果蠅的scs和scs' ,gyp絕緣子等)，抗抑制子(anti-r印ressor),
本發(fā)明中，所述桿狀病毒的構(gòu)建方法但不限于Bac-To-Bac法等。
本發(fā)明插入染色質(zhì)調(diào)控元件的DNA序列，這種序列能夠在表觀遺傳學(xué)層面提高目的基 因轉(zhuǎn)錄的水平，和目的蛋白質(zhì)合成的水平。本發(fā)明將真核細(xì)胞染色質(zhì)調(diào)控元件的副A序列 加入到桿狀病毒基因組中目的基因表達(dá)框附近，得到改造的病毒。用改造后的病毒感染適 當(dāng)?shù)募?xì)胞，在感染后48小時到96小時間，與未改造的病毒載體相比，目的蛋白的表達(dá)量 明顯增加。依不同目的蛋白，不同感染復(fù)數(shù)，不同蛋白收獲時間及不同培養(yǎng)基使用量，目 的蛋白表達(dá)量增加3 10倍。本發(fā)明適用于生產(chǎn)具有天然活性的蛋白質(zhì)


圖l經(jīng)改造的桿狀病毒基因結(jié)構(gòu)示意圖。Ac-EGFP為作為對照的標(biāo)準(zhǔn)的重組桿狀病毒， Ac-EGFP-I為插入絕緣子的重組桿狀病毒。
圖2帶有絕緣子的重組桿狀病毒Ac-EGFP-I和對照重組桿狀病毒Ac-EGFP感染細(xì)胞 后表達(dá)的eGFP蛋白被激發(fā)的熒光強度比較。
具體實施例方式
1. 供體質(zhì)粒構(gòu)建利用基因工程技術(shù)將外源目的基因序列插入構(gòu)建重組桿狀病毒專 用的轉(zhuǎn)移載體(例如pFastbac-l)上的多克隆位點，使之位于多角體蛋白基因啟動子，或 p10啟動子，或其他合適的啟動子的下游。同時，在目的基因表達(dá)框上游、下游的特定位 置插入染色質(zhì)調(diào)控元件的DNA片段，得到供體質(zhì)粒。
2. 目標(biāo)病毒獲得將供體質(zhì)粒上的目的基因表達(dá)框和染色質(zhì)調(diào)控元件片段插入到病 毒骨架的特定位置，得到重組病毒DNA。具體方法可以采用Bac-to-Bac系統(tǒng)(Invitrogen 公司)，或通過同源重組、Red重組等各種方法進(jìn)行。提取重組病毒DNA(方法參照Bac-to-Bac 系統(tǒng))，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將病毒DNA轉(zhuǎn)入SF9細(xì)胞，或其他合適細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)4 6 天后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，即得到目標(biāo)病毒。該病毒作為原代病毒液4'C保存?zhèn)溆?。也可利用直接在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行同源重組的方式，將供體質(zhì)粒及線性化的病毒骨架DNA共轉(zhuǎn)染細(xì) 胞，得到目標(biāo)病毒。
3. 病毒擴(kuò)增及效價測定用SF9或其他合適的細(xì)胞擴(kuò)增得到第一代病毒，并進(jìn)一步 大量擴(kuò)增，得到病毒儲備液。病毒液用終點稀釋法，空斑法，或其他合適的方法測定病毒 效價。
4. 蛋白生產(chǎn)根據(jù)病毒效價，按細(xì)胞數(shù):病毒=1:0. 01 5的比例將病毒加入培養(yǎng)細(xì)胞， 27r靜置培養(yǎng)48 96小時，或者搖瓶110轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)48 96小時。收取蛋白。 應(yīng)用實例
1. 構(gòu)建供體質(zhì)粒利用限制性內(nèi)切酶5^I酶切e《/p和pFastBac-l (Invitrogen公 司)，利用T4連接酶連接，得到重組質(zhì)粒pFB-EGFP (圖1)，經(jīng)DNA測序鑒定序列的eg/; 基因插入的方向正確性。然后，用類似方法在^/p基因和SV40 polyA信號的下游正向插 入雞P—球蛋白HS4絕緣子，獲得供體質(zhì)粒pFB-EGFP-1 (圖1)。不含絕緣子的對照病毒的 供體質(zhì)粒pFB-EGFP可作為對照。
2. 獲得病毒DNA:將供體質(zhì)粒pFB-EGFP-I和pFB-EGFP分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10Bac (Invitrogen公司)，使目的基因表達(dá)框轉(zhuǎn)座到Ac麗PV桿狀病毒DNA骨架，得到重組病毒
DNA。
3. 獲得重組病毒從大腸桿菌中提取并純化重組病毒DNA，分別轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，5天 后收獲重組病毒。帶有絕緣子的重組病毒命名為Ac-EGFP-I，對照病毒命名為Ac-EGFP。 分別取2微升初代病毒擴(kuò)增病毒，并測定病毒效價。
4. 表達(dá)蛋白按細(xì)胞數(shù)病毒數(shù)1:1的比例將病毒加入培養(yǎng)的SF9細(xì)胞中，27'C靜 置培養(yǎng)72小時，測定帶有絕緣子的桿狀病毒Ac-EGFP-I和對照病毒Ac-EGFP感染細(xì)胞后 表達(dá)的eGFP蛋白被激發(fā)的熒光強度，結(jié)果如圖2所示。
參考文獻(xiàn)
1. Smith MD. Production of human beta interferon in insect cell infected with baculovirus express vectors. Mol Cell Biol 1983， 3:2156-2165。
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7. Emily J" K， Pamela K G. Genomic insulators: connecting properties to mechanism. Curr Opin Cell Biol, 2003,15:259—265。
權(quán)利要求
1. 一種提高桿狀病毒表達(dá)載體表達(dá)目的基因水平的方法，其特征在于在桿狀病毒基因組中的適當(dāng)位置插入真核細(xì)胞染色質(zhì)調(diào)控元件的DNA序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的桿狀病毒為苜蓿銀紋夜蛾核型多 角體病毒。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的目的基因表達(dá)通過病毒感染細(xì)胞 進(jìn)行；其使用的細(xì)胞株為草地夜蛾細(xì)胞系SF9。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的染色質(zhì)調(diào)控元件為絕緣子或抗抑 制子；染色質(zhì)調(diào)控元件在桿狀病毒基因組中插入的位置為鄰近目的基因表達(dá)框的上游一側(cè) 或下游一側(cè)，或上下游兩側(cè)。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種提高桿狀病毒表達(dá)載體表達(dá)目的基因水平的方法。本發(fā)明將真核細(xì)胞染色質(zhì)調(diào)控元件的DNA序列加入到桿狀病毒基因組中目的基因表達(dá)框附近，得到改造的病毒。用改造后的病毒感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，在感染后48小時到96小時間，與未改造的病毒載體相比，目的蛋白的表達(dá)量明顯增加。依不同目的蛋白，不同感染復(fù)數(shù)，不同蛋白收獲時間及不同培養(yǎng)基使用量，目的蛋白表達(dá)量增加3～10倍。本發(fā)明適用于生產(chǎn)具有天然活性的蛋白質(zhì)。
文檔編號C12N15/866GK101285072SQ200810038580
公開日2008年10月15日 申請日期2008年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月5日
發(fā)明者靜 張, 儷 李, 鑫 王, 江 鐘 申請人:復(fù)旦大學(xué)