專利名稱：一種利用金屬螯合親和膜提純菠蘿蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白酶的提純領(lǐng)域，特別是涉及一種利用金屬螯合親和膜提純菠蘿蛋白酶 的方法。
背景技術(shù)：
菠蘿蛋白酶(Bromelain)簡稱菠蘿酶，亦稱為鳳梨酶或風(fēng)梨酵素，酶學(xué)編號 EC3.4.22.32，是從菠蘿果莖、柄、葉、皮提取出來，經(jīng)精制、提純、濃縮、酶固定 化、冷凍干燥而得到的一種純天然植物蛋白酶。它是一類巰基蛋白酶，其活性中心 為疏基(一SH)，能進行蛋白質(zhì)水解等各種生化反應(yīng)，它可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥 及生物等行業(yè)，作為食品添加劑可用于肉質(zhì)嫩化，啤酒澄清，還用于干酪、明膠及水解 蛋白等的生產(chǎn)。
菠蘿蛋白酶的傳統(tǒng)提取工藝為吸附法和沉淀法，但是這兩種方法工藝繁瑣，純度不 能達到制藥工業(yè)的需求?！陡呋钚圆ぬ}蛋白酶提取的研究》 一文是采用納米氧化鋅吸 附、陶瓷膜超濾濃縮和冷凍干燥技術(shù)工藝，從菠蘿莖、皮中提取菠蘿蛋白酶，可以有效保 持蛋白酶的活性，還有報道是利用酒精作為沉淀劑來提純菠蘿蛋白酶，這些方法都存 在產(chǎn)物純度低，酶活低等缺陷。專利CN1980165公開了一種菠蘿蛋白酶的物理提取方 法，包括將原料進行清洗、粉碎預(yù)處理，再搾汁、離心、冷凍，然后經(jīng)過濾、超濾、 反滲透和真空干燥處理；專利CN1186118提供了一種菠蘿蛋白酶的提取方法，是將 菠蘿植株進行冷凍預(yù)處理，然后破碎搾汁、超濾、反滲透、再冷凍干燥，物理提取 方法所得菠蘿蛋白酶的純度和酶活性高，然而成本較高，工藝耗能大。
膜是具有選擇性分離功能的材料，利用它能夠?qū)崿F(xiàn)料液不同組分的分離、純化和濃縮， 其特點是表面積大、擴散路徑短、操作壓低、處理量大，膜可以在分子范圍內(nèi)進行分離， 但傳統(tǒng)膜分離技術(shù)只有分離相對分子質(zhì)量相差10倍以上的物系，不能滿足生化分離的需 要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用金屬螯合親和膜提純菠蘿蛋白酶的方法， 該方法快速、高效、簡便、分離量大，適于工業(yè)規(guī)模化。
本發(fā)明的一種利用金屬螯合親和膜提純菠蘿蛋白酶的方法，包括 (1)尼龍膜的改性活化后的尼龍膜浸入100 ml 1 wt%~3 wt。/。的羥乙基纖維素溶液 中，室溫反應(yīng)1~3 h,然后轉(zhuǎn)入烘箱，60-90'C烘干1~3 h，用1 wt%~3 wt。/。曲通拉(X—IOO)(聚乙二醇辛基苯基醚)的氫氧化鈉NaOH溶液洗去未反應(yīng)的羥乙基纖維素，再在去離子水 中清洗1~3天；
(2) 尼龍膜螯合金屬鋅離子將上述尼龍膜浸入4 5ml環(huán)氧氯丙烷、40 55ml氫氧化 鈉和3~6mmol硼氫化鈉的混合溶液中，室溫反應(yīng)1~3 h后，加入20~30ml環(huán)氧氯丙垸溶液 和40~50ml氫氧化鈉溶液，繼續(xù)恒溫振蕩反應(yīng)8~18 h，洗滌后再將膜浸入U0 120ml碳酸 鈉、6 9mmol硼氫化鈉和80 90mmol偶聯(lián)劑亞氨基二乙酸(IDA)的混合溶液，50~70。C 反應(yīng)10 15h，最后浸入500ml 50 150ppm的硫酸鋅溶液，反應(yīng)1 3 h，得到螯合鋅離子 的金屬親和膜；
(3) 蛋白酶的吸附洗脫將金屬親和膜上疊成膜堆，放入膜橋，蠕動泵送入緩沖液 和洗脫液，以0.05mol/LpH-8.0的Tris-HCl緩沖液平衡15min，流速2.0ml/min;接著送 入100ml 0.25 2.0 mg/ml pH值=5.0 9.0的菠蘿蛋白酶溶液，其中氯化鈉濃度為0 2.0 mol/L，反應(yīng)10 100min進行吸附，然后以Tris-HCl緩沖液洗去未吸附上的蛋白質(zhì)，最后 以洗脫劑進行洗脫，得到菠蘿蛋白酶；
(4) 測試酶活性和蛋白質(zhì)含量，計算純化倍數(shù)。
所述的步驟(1)中尼龍膜活化是指尼龍膜先在25。Clmol/LHCl中水解24h，然后浸 入20ml甲醛溶液，加入0.2ml85wt.。/o的磷酸，于60。C反應(yīng)7h， 40 50。C熱水洗滌。 所述的步驟(1)中NaOH溶液的濃度為0.1 0.3mol/L。
所述的步驟(2)中環(huán)氧氯丙垸濃度為95wt%~100wt%，氫氧化鈉和碳酸鈉溶液的濃度
為1 3 mol/L;環(huán)氧氯丙垸、氫氧化鈉與硼氫化鈉的混合溶液中，三者的體積比為0.9~1丄
8 11: 0.003 0.005。
所述的步驟(2)中洗滌分別用去離子水和4.0vol。/。 8.0vol。/。的醋酸洗滌。 所述的步驟(3)中最佳提純條件為反應(yīng)時間為60min， pH=7.0，菠蘿蛋白酶的吸
附濃度為2.0mg/ml，離子強度為Omol/L的氯化鈉溶液，即菠蘿蛋白酶溶液中不含氯化鈉溶液。
所述的步驟(3)中洗脫劑為0.5 1.5mol/L的硫氰酸鈉。 有益效果
(1) 本發(fā)明方法操作簡單，快速、高效、分離量大，純化倍數(shù)和酶活性較高；
(2) 原料來源方便，便于工業(yè)大規(guī)模提取純化。


圖1為不同反應(yīng)時間的菠蘿蛋白酶溶液吸附曲線；圖2為不同pH的菠蘿蛋白酶溶液吸附曲線； 圖3為不同濃度的菠蘿蛋白酶溶液的吸附曲線； 圖4為不同離子強度的菠蘿蛋白酶溶液吸附曲線； 圖5為利用金屬螯合膜吸附菠蘿蛋白酶的洗脫曲線。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例1尼龍膜的活化和鍵合羥乙基纖維素進行改性，具體步驟如下(1) 尼龍膜(10張)先在25'C 1 mol/L HC1中水解24 h，然后用甲醛進行活化。10 張水解的尼龍膜浸入20ml甲醛溶液(>36.5wt.%)，加入0.2ml磷酸(85wt.%)，于60°C 反應(yīng)7 h， 40-5(TC熱水水洗多次。(2) 將上述甲醛活化的尼龍膜(10張)，浸入100ml質(zhì)量分數(shù)為2 %的羥乙基纖維 素溶液，室溫反應(yīng)1 h，然后轉(zhuǎn)入9(TC烘箱，1 h后取出，用1%曲通拉(X—100)的NaOH 溶液(O.lmol/L)洗去未反應(yīng)的羥乙基纖維素，再在去離子水中清洗2天。實施例2改性后的尼龍膜螯合金屬鋅離子，具體步驟如下(1) 上述改性后的100張(大約10克)尼龍膜浸入4.6 ml環(huán)氧氯丙烷、46 ml 2 mol/L 的氫氧化鈉和5mmo1硼氫化鈉混和液中，室溫反應(yīng)2 h后，再直接向混和液加入23 ml環(huán) 氧氯丙垸、46ml2mol/L的氫氧化鈉，60'C反應(yīng)12h，用去離子水洗多次。(2) 將上述結(jié)合環(huán)丙垸的10張膜(大約1克)浸入含有86 mmol的亞氦基二乙酸 (IDA)、 8mmo1硼氫化鈉和114.4 ml 2 mol/L的碳酸鈉的混合溶液，60'C恒溫振蕩反應(yīng)12h，用去離子水、5 vol.n/。醋酸和去離子水洗多次。(3) 將上述的膜浸入500mll00ppm的硫酸鋅溶液，反應(yīng)2 h，就可得到螯合鋅離子 的金屬膜。實施例3用金屬螯合膜吸附菠蘿蛋白酶，進行條件優(yōu)化，具體步驟如下 (1)反應(yīng)時間的確定。將IO張改性尼龍膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動泵送入100ml1.0mg/ml菠蘿蛋白酶的Tris-HCl溶液(pH=8)，流速為2.0ml/min，分別反應(yīng)10min， 20 min， 30min， 40min， 50min， 60min， 80min和100min，進行吸附，測定菠蘿蛋白酶吸 附的量。實驗結(jié)果如圖l，最適的反應(yīng)時間選擇在60min。(2) 反應(yīng)pH的確定。將10張改性尼龍膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動泵送入100ml 不同pH值的1.0 mg/ml菠蘿蛋白酶的Tris-HCl溶液，循環(huán)反應(yīng)2 h，流速為2.0 ml/min， 加入菠蘿蛋白酶的Tris-HCl溶液的pH值分別為5.0， 6.0， 7.0， 8.0， 9.0進行吸附，測定 菠蘿蛋白酶吸附的量。實驗結(jié)果如圖2，最適的反應(yīng)pH選擇在7.0。(3) 反應(yīng)起始菠蘿蛋白酶溶液濃度的確定。將10張改性尼龍膜上疊成膜堆，放入膜 橋，以蠕動泵送入從100ml 0.25 mg/ml到2.0 mg/ml濃度不等的菠蘿蛋白酶反應(yīng)液，循環(huán) 反應(yīng)2h，流速為2.0 ml/min，測定菠蘿蛋白酶吸附的量。實驗結(jié)果如圖3，最佳吸附濃度 為2.0mg/ml的菠蘿蛋白酶反應(yīng)液。(4) 反應(yīng)離子強度的確定。將10張改性尼龍膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動泵送 入含有不同量氯化鈉的100ml 1.0卯m的菠蘿蛋白酶溶液，循環(huán)反應(yīng)2 h，流速為2.0 ml/min，所加入的氯化鈉濃度為0， 0.25， 1.0， 1.5， 2.0mol/L (即離子強度)，測定菠蘿蛋 白酶吸附的量。實驗結(jié)果如圖4，最佳離子強度為Omol/L的氯化鈉溶液(即不含氯化鈉溶 液)。實施例4用1.0mol/L的硫氰酸鈉溶液洗脫吸附菠蘿蛋白酶的膜，具體步驟如下 將10張吸附菠蘿蛋白酶的膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動泵送入1.0mol/L的硫氰酸鈉溶液，流速為2.0 ml/min，進行洗脫，測定菠蘿蛋白酶洗脫的量，得到菠蘿蛋白酶的活性保留率和洗脫率都在95%以上。實施例5螯合膜組成膜堆對菠蘿蛋白酶進行分離純化包括如下步驟10張上述方法制備的金屬螯合膜上疊成膜堆，作為分離介質(zhì)，放入一種過濾容器膜橋， 以分離菠蘿蛋白酶。以蠕動泵送入緩沖液和洗脫液等。首先以0.05 mol/LTris-HCl緩沖液 (pH8.0)平衡15min，流速1.0ml/min;接著送樣，30ml的1.0mg/ml的菠蘿蛋白酶溶液， 然后以0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)洗去未吸附上的蛋白質(zhì)。最后以0.05mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)配制的1.0mol/LNaSCN進行洗脫，得到目標(biāo)蛋白質(zhì)菠蘿蛋白酶， 其純化倍數(shù)為13.8。實施例6精確稱取一定量按上述方法制備的金屬螯合膜，置于0.05mol/L，不同pH值的緩沖液 配制的菠蘿蛋白酶溶液中，室溫震蕩不同時間后，測量吸附前后蛋白質(zhì)溶液在280nm下的 吸光度，按下式計算吸附量《=(Cj-Ct)P^/m《是吸附在單位膜量上的銅離子量(mg/g); Ci和Ct是吸附前和吸附后硫酸銅溶液的濃 度；Fs是硫酸銅溶液的體積；w是反應(yīng)的膜的質(zhì)量。
權(quán)利要求
1.一種利用金屬螯合親和膜提純菠蘿蛋白酶的方法，包括(1)尼龍膜的改性活化后的尼龍膜浸入100ml 1wt％～3wt％的羥乙基纖維素溶液中，室溫反應(yīng)1～3h，然后轉(zhuǎn)入烘箱，60-90℃烘干1～3h，用1wt％～3wt％曲通拉X-100聚乙二醇辛基苯基醚的氫氧化鈉NaOH溶液洗去未反應(yīng)的羥乙基纖維素，再在去離子水中清洗1～3天；(2)尼龍膜螯合金屬鋅離子將上述尼龍膜浸入4～5ml環(huán)氧氯丙烷、40～55ml氫氧化鈉和3～6mmol硼氫化鈉的混合溶液中，室溫反應(yīng)1～3h后，加入20～30ml環(huán)氧氯丙烷溶液和40～50ml氫氧化鈉溶液，繼續(xù)恒溫振蕩反應(yīng)8～18h，洗滌后再將膜浸入110～120ml碳酸鈉、6～9mmol硼氫化鈉和80～90mmol偶聯(lián)劑亞氨基二乙酸IDA的混合溶液，50～70℃反應(yīng)10～15h，最后浸入500ml 50～150ppm的硫酸鋅溶液，反應(yīng)1～3h，得到螯合鋅離子的金屬親和膜；(3)蛋白酶的吸附洗脫將金屬親和膜上疊成膜堆，放入膜橋，蠕動泵送入緩沖液和洗脫液，以0.05mol/L pH＝8.0的Tris-HCl緩沖液平衡15min，流速2.0ml/min；接著送入100ml 0.25～2.0mg/ml pH值＝5.0～9.0的菠蘿蛋白酶溶液，其中氯化鈉濃度為0～2.0mol/L，反應(yīng)10～100min進行吸附，然后以Tris-HCl緩沖液洗去未吸附上的蛋白質(zhì)，最后以洗脫劑進行洗脫，得到菠蘿蛋白酶；(4)測試酶活性和蛋白質(zhì)含量，計算純化倍數(shù)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用金屬螯合親和膜提純菠蘿蛋白酶的方法，其特征在于所 述的步驟(1)中尼龍膜活化是指尼龍膜先在25。Clmol/LHCl中水解24h，然后浸入 20ml甲醛溶液，加入0.2ml85wt.。/。的磷酸，于6(TC反應(yīng)7h， 40 5(TC熱水洗滌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用金屬螯合親和膜提純菠蘿蛋白酶的方法，其特征在于所 述的步驟(1)中NaOH溶液的濃度為O.l~0.3mol/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用金屬螯合親和膜提純菠蘿蛋白酶的方法，其特征在于所 述的步驟(2)中環(huán)氧氯丙垸濃度為95wt%~100wt%，氫氧化鈉和碳酸鈉溶液的濃度為 l 3mol/L;環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉與硼氫化鈉的混合溶液中，三者的體積比為0.9 l.h 8 11: 0.003 0.005。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用金屬螯合親和膜提純菠蘿蛋白酶的方法，其特征在于所述的步驟(2)中洗滌分別用去離子水和4.0vol。/。 8.0vol。/。的醋酸洗滌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用金屬螯合親和膜提純菠蘿蛋白酶的方法，其特征在于所 述的步驟(3)中最佳提純條件為反應(yīng)時間為60min， pH=7.0，菠蘿蛋白酶的吸附濃度為2.0mg/ml，離子強度為0 mol/L的氯化鈉溶液，即菠蘿蛋白酶溶液中不含氯化 鈉溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用金屬螯合親和膜提純菠蘿蛋白酶的方法，其特征在于所 述的步驟(3)中洗脫劑為0.5 1.5mol/L的硫氰酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用金屬螯合親和膜提純菠蘿蛋白酶的方法，包括(1)活化的尼龍膜經(jīng)羥乙基纖維素鍵合改性；(2)改性后的尼龍膜與環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉和硼氫化鈉的混合溶液反應(yīng)，再將膜分別浸入碳酸鈉、硼氫化鈉和偶聯(lián)劑的混合溶液和硫酸鋅溶液，得到螯合鋅離子的金屬親和膜；(3)將上述金屬親和膜上疊成膜堆，放入膜橋，蠕動泵送入Tris-HCl緩沖液和洗脫液，接著送入菠蘿蛋白酶溶液，然后以洗脫劑進行洗脫，得到菠蘿蛋白酶；(4)測試酶活性和蛋白質(zhì)含量，計算純化倍數(shù)。本發(fā)明方法快速、高效、簡便、分離量大，提取的酶活性好，適用于工業(yè)規(guī)模化。
文檔編號C12N9/50GK101307309SQ20081003866
公開日2008年11月19日 申請日期2008年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月6日
發(fā)明者何智妍, 朱利民, 聶華麗 申請人:東華大學(xué)