專利名稱：一種pax9基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用的制作方法
一種PAX9基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說關(guān)于一種PAX9基因的原位雜交檢測(cè)試 劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
根據(jù)國內(nèi)外權(quán)威機(jī)構(gòu)提供的資料，我國每年癌癥的新增人數(shù)170萬，死亡 人數(shù)近160萬，患者600萬，全球每年新增癌癥患者800萬，死亡人數(shù)接近800 萬，患者約有8400萬人，到2020年以上人數(shù)將翻一番，這是一組可怕的數(shù)字。
2005年美國衛(wèi)生研究院、癌癥研究院、疾控中心等多家單位做了一個(gè)年度 報(bào)告，"認(rèn)為人類在抗癌大戰(zhàn)中是失敗"，也就是說癌癥死亡率沒有降低，其列 舉出造成抗癌大戰(zhàn)失敗的幾個(gè)因素是1.腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性；2.腫瘤細(xì)胞耐藥性； 3.抗癌藥物設(shè)計(jì)思路不完善等。同時(shí)，該報(bào)告中亦提出應(yīng)重新審視現(xiàn)有診治癌 癥的措施。
本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致癌癥死亡率不降的另二個(gè)重要原因 是l.不能做到真正的早期診斷；2.轉(zhuǎn)移的病理機(jī)制不清楚。依照傳統(tǒng) 的醫(yī)學(xué)影像及和其它生化(如蛋白標(biāo)記物)指標(biāo)來診斷癌癥，認(rèn)為占 位性癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷(更小些有時(shí)無癥狀體 征)，這一概念值得認(rèn)真討論。影像醫(yī)學(xué)的2公分以下癌塊屬早期這 一界定科學(xué)性是不夠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)模瑥募?xì)胞學(xué)角度，l公分的腫塊約有一億 個(gè)腫瘤細(xì)胞，2公分的腫塊其三維空間的細(xì)胞疊加數(shù)遠(yuǎn)不止2億個(gè)腫 瘤細(xì)胞，從癌變前期到單克隆癌細(xì)胞產(chǎn)生及形成2公分的癌塊，其病理演變過程相當(dāng)長，可能是一年或兩年、甚至三年以上，很難證實(shí)的 是在這個(gè)過程中，腫塊是癌癥唯一的發(fā)生地和單獨(dú)的病灶。臨床上已 證實(shí) 一旦形成腫塊的同時(shí)，其他癌細(xì)胞通過不同途徑遷移到其他部 位克隆生長； 一旦切除原發(fā)灶后，其他器官復(fù)發(fā)灶或多發(fā)癌塊灶先后 形成或轉(zhuǎn)移。因此，在臨床上以2公分以下的腫塊大小來界定早期與 否，不夠嚴(yán)謹(jǐn)(有些病例，在發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶時(shí)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶， 不在我們表述的內(nèi)容中)，這時(shí)已經(jīng)是晚期了，這是導(dǎo)致癌癥死亡率 不降的真正原因。
隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，癌癥基因組學(xué)等研 究的深入展開，至今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診 斷，在癌變前期或癌細(xì)胞形成(單克隆時(shí))或突破血管壁早期轉(zhuǎn)移時(shí)， 就能做到早期預(yù)測(cè)診斷。
PAX9基因被認(rèn)為是致肺癌的協(xié)同基因，PAX9基因的表達(dá)增高， 表示病人已患肺癌且多數(shù)已轉(zhuǎn)移。美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了 位于人類第14號(hào)染色體上PAX9和TTFl、NKX2-8基因有協(xié)同致肺癌 發(fā)生和導(dǎo)致轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步研究表明PAX9和 TTF1、NKX2-8基因能再 激活一種早期的胎兒基因表達(dá)模式，導(dǎo)致肺癌產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移，PAX9基 因與20%肺癌癌變有關(guān)，他們發(fā)現(xiàn)這些基因的異常變化在晚期肺癌更 常見，有可能是癌癥復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因子。
目前對(duì)PAX9基因的研究都采用高通量基因芯片技術(shù)，而這一方 法多用于科研方面，不適應(yīng)臨床應(yīng)用，特別是個(gè)性化的應(yīng)用在我國現(xiàn) 階段條件尚不成熟。根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料及査新報(bào)告PAX9基因的檢 測(cè)技術(shù)未見報(bào)道，而用抗原抗體(ELISA)方法檢測(cè)PAX9蛋白也還處于研發(fā)階段。
原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 結(jié)合起來，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測(cè)特異性核酸分子的 技術(shù)。其原理是使含有特異序列、經(jīng)過標(biāo)記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條 件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ)核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫 細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)標(biāo)記探針進(jìn)行探測(cè)，從而在細(xì)胞原位顯示特異的DNA或RNA分 子。
中國專利文獻(xiàn)CN1556221公開了"IC53基因及其相關(guān)產(chǎn)物診斷和治療結(jié)腸 癌的用途及一種診斷結(jié)腸癌的試劑盒"。中國專利文獻(xiàn)CN1769485公開了 "櫛 孔扇貝病原類立克次氏體的原位雜交檢測(cè)方法及其試劑盒"。中國專利文 獻(xiàn)CN1556410公開了 "一種魚類病毒的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法"。中國專利 文獻(xiàn)CN1680597公開了"一種用于定量檢測(cè)丙型肝炎病毒(HCV)的熒光定量PCR 試劑盒"。中國專利文獻(xiàn)CN2918435，公開了 "一種檢測(cè)肥胖相關(guān)基因SNP的寡 核苷酸芯片及試劑盒"。但是，關(guān)于PAX9基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè) 技術(shù)未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種PAX9基因的原位雜交檢測(cè)試劑 盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用，能夠檢測(cè)早期肺癌。
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種PAX9基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒， 在制備檢測(cè)肺癌疾病藥物中的應(yīng)用，所述的試劑盒包括雜交探針、標(biāo)記 物，其中所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.l所示。PAX9基因序列見SEQ ID NO. 1，PAX9基因的核苷酸序列長度是3113bp， CDS是718. . 1743，位于染色體14ql2-ql3"位點(diǎn)上。
作為可選的技術(shù)方案，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.l所示的RNA序列。
作為可選的技術(shù)方案，所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。 作為可選的技術(shù)方案，所述的放射性核素選自&、 35S、 1251或"P中的一種。
作為可選的技術(shù)方案，所述的非放射性標(biāo)記物選自生物素、地高辛、堿性
磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種。
作為可選的技術(shù)方案，所述的非放射性標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。 作為可選的技術(shù)方案，還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。 本發(fā)明還提供了一種PAX9基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針、
標(biāo)記物，其中，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標(biāo)
記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。
本發(fā)明還提供了一種PAX9基因原位雜交檢測(cè)方法，該方法包括以下
步驟
a、 將試劑盒中的雜交探針與底物中待測(cè)RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；
b、 檢測(cè)a步驟得到的雜交復(fù)合體。
作為可選的技術(shù)方案，所述a步驟中形成雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交 的溫度為42。C;核酸雜交的時(shí)間為16—24小時(shí)，所述的底物選用血液細(xì)胞標(biāo) 本或組織細(xì)胞標(biāo)本。
本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒是采用核酸雜交技術(shù)和組化免疫方法相結(jié)合，以PAX9 基因?yàn)闄z測(cè)對(duì)象，合成探針是PAX9基因的DNA或RNA序列，檢測(cè)的底物是人 體血液標(biāo)本白細(xì)胞或組織細(xì)胞的RNA的表達(dá)量。原位雜交技術(shù)的顯示方法能提供PAX9基因的半定量或定量表達(dá)程度判定。根據(jù)雜交后免疫組化顯色判定以
上兩基因的表達(dá)量，正常人PAX9基因在胎兒發(fā)育高表達(dá)，成年人低表達(dá)，PAX9 基因在肺癌晚期病人超高表達(dá)，和正常人有顯著差異。本發(fā)明的診斷試劑盒的 組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原 理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜交、 免疫組化染色、鏡下進(jìn)行定量分析、結(jié)果報(bào)告，其中雜交的具體步驟包括
儀器操作
1) .將待測(cè)標(biāo)本放入反應(yīng)槽中；
2) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)加消化液；
3) .儀器自動(dòng)棄去液體
4) .儀器自動(dòng)棄去液體
5) .儀器自動(dòng)棄去液體
6) .儀器自動(dòng)棄去液體
7) .儀器自動(dòng)棄去液體
8) .儀器自動(dòng)棄去液體
自動(dòng)后固定； 自動(dòng)預(yù)雜交(42°C); 自動(dòng)清洗； 自動(dòng)雜交(42°C); 自動(dòng)清洗；
自動(dòng)與DIG抗體培養(yǎng)(室溫);
9) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗，顯色；
10) .取出封片鏡檢。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于
1、 本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。
2、 本發(fā)明的檢測(cè)方法操作方便、簡(jiǎn)單，能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍使用和推 廣?？朔四壳皩?duì)PAX9基因的研究都采用高通量基因芯片方法，而這些方法 多用于科研方面，不適應(yīng)臨床應(yīng)用的缺陷。
3、 本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測(cè)肺癌發(fā)生、浸潤轉(zhuǎn)移動(dòng)態(tài)過程，同時(shí)可檢測(cè)肺癌治療后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)狀況，以及用于癌癥預(yù)防醫(yī)學(xué)檢測(cè)。本發(fā)明 的診斷試劑盒與臨床上其它檢測(cè)癌胚蛋白標(biāo)志物，以及影像醫(yī)學(xué)檢査有顯著不 同。本發(fā)明可以在基因水平上(肺癌變前期或癌細(xì)胞增殖)檢測(cè)基因(PAX9 基因)異常表達(dá)，在影像醫(yī)學(xué)檢査未發(fā)現(xiàn)占位性癌病灶之前，癌癥生化指標(biāo)未 產(chǎn)生異常之前，亦未形成腫塊之前，能及早做到以上基因表達(dá)異常的信息采集， 給臨床肺癌病患一個(gè)真正的早期診斷和轉(zhuǎn)移侵入以及治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及早預(yù) 測(cè)。這樣才有可能實(shí)施肺癌的早期診斷、早期預(yù)防、早期治療，有可能從源頭 上徹底根治肺癌惡疾。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例中肺癌病人PAX9基因過量表達(dá)圖。 圖2是本發(fā)明實(shí)施例中正常人PAX9基因表達(dá)圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合圖對(duì)本發(fā)明提供的一種PAX9基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒及其檢 測(cè)方法和應(yīng)用的具體實(shí)施方式
做詳細(xì)說明。 實(shí)施例1
一種PAX9基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物、增效 劑，其中，所述的雜交探針序列如SEQ IDNO. 1所示。雜交探針用地 高辛標(biāo)記。試劑盒中的其它液體和標(biāo)本組成如下
消化液100y 1/管l管/盒無色透明液體
保護(hù)液100ul/管l管/盒無色透明液體
預(yù)雜交液1300 ul/管2管/盒無色透明液體
正義雜交液10u 1/管l管/盒無色透明液體反義雜交液10u 1/管l管/盒無色透明液體
封閉液1000 u 1/管l管/盒無色透明液體
堿性磷酸酶抗體l"/管l管/盒無色透明液體
顯色劑A175u 1/管l管/盒黃色液體
顯色劑B320ul/管l管/盒無色透明液體
緩沖液I 10x90ml/瓶l瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液II 10x80ml/瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液m 10x20m/瓶3瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液IV 10x90ml/瓶l瓶/盒淺黃色或無色透明液體
固定液90ml/瓶l瓶/盒無色透明液體
陽性對(duì)照標(biāo)本6片/盒
上述試劑成分說明(所有試劑購自SIGMA)
1、 消化液20mg/ml蛋白酶K， 100mg蛋白酶K，加DEPC- H20 5ml;
2、 保護(hù)液0.2g的glycine加入lml的1X緩沖液I;
3、 預(yù)雜交液1X緩沖液II 7.5ml 50 XD 3ml
10mg/ml yest t-RNA 750ul llmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul 0. 04M EDTA 3ml 50% formamide 15ml
4、 封閉液0.03g的bloking (購買自羅氏公司)加入lmllX緩沖液
III;
5、 lOx緩沖液I: (PH7. 1-7.4)NaCl 80g
Na2HP04. 12H20 3 60g KC1 2g KH2P04 2g
加三蒸水至ll，并高壓滅菌；
6、 lOx緩沖液II: (PH7.0) NaCl 175.3g
擰檬酸鈉88.2g HCl 幾滴
加三蒸水至ll，并高壓滅菌；
7、 緩沖液III: (PH7.9) Tris 121, lg
NaCl 87,66g HCl60ml左右 加三蒸水至ll，并高壓滅菌；
8、 緩沖液IV:
1M Tris-HCl(PH9. 5): Tirs 121. lg加HCl 3ml左右，加水900ml，調(diào)PH 至9.5，加水至ll，并高壓滅菌；
1MNaCl: NaCl 58.44加水至11，并高壓滅菌；
0. 5MMgCl2: 10L65g MgCL. 6仏0加水至11，并高壓滅菌；
9、 固定液多聚甲醛40g加1X緩沖液I至11，稍加熱(約50-60度)攪 拌至溶解；
10、 顯色劑A: NBT lg加70。/oDMFl 1.44ml;
ii11、 顯色劑B: BCIP lg加100%DMF30ml。 本發(fā)明的試劑盒可以多人份使用或一人份使用。 實(shí)施例2
一種PAX9基因原位雜交檢測(cè)方法及其試劑盒應(yīng)用 一、標(biāo)本處理
1、用10ml的離心管，裝4. 5ml淋巴細(xì)胞分離液，再將3 ml抗凝血緩慢 加入含有淋巴細(xì)胞分離液(血淋巴細(xì)胞分離液=1:1.5)的離心管 中，2000r/min離心10 min;
2、 吸取中間層白細(xì)胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的1X緩沖液 I，混勻，1500g/min離心10 min;
3、 棄上清.沉淀加入約兩倍的1X緩沖液I，混勻，1500g/min離心10 min;
4、 棄上清，并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液，滴 在玻片上推片，自然干燥。(有條件的醫(yī)院可以用制片機(jī)制片。)3 ml血，可以 做4張片子；
5、 用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1 X緩沖液I洗5min。 每缸可以放16片；
6、 標(biāo)本可保存在-2(TC，或繼續(xù)做實(shí)驗(yàn)。
二、將試劑盒中試劑配制成使用濃度
1、 將10X緩沖液I用三蒸水按1:10稀釋成1X緩沖液I ;
2、 將20X緩沖液II用三蒸水按1:10稀釋成2 X緩沖液II;
按1:100稀釋成0. 2 X緩沖液II ;按1:200稀釋成0. 1 X緩沖液II;
3、 將IOX緩沖液III用三蒸水按1:10稀釋成1X緩沖液III;
4、 IOX緩沖液IV用三蒸水按1:10稀釋成X緩沖液IV (取1#， 2#， 3tt各lOml，加水至100ml既可)。 三、實(shí)驗(yàn)步驟..
1、 取每位待檢者標(biāo)本兩張，(另外兩張留作復(fù)查用)及陽性對(duì)照標(biāo)本兩張 (每次實(shí)驗(yàn)做一對(duì)陽性對(duì)照)；
2、 在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1X緩沖液199.9ml，即為使用濃 度)20 ml。 37。C水浴預(yù)熱10分鐘。放進(jìn)16張玻片，37。C處理12 min，再用1 X緩沖液I洗5min;
3、 用0. 2。/。的保護(hù)液(保護(hù)液lml加lX緩沖液I99ml即為使用濃度)洗10min， 三蒸水洗5min，以上過程都在玻璃缸進(jìn)行。玻片自然干燥；
4、 將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預(yù)雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放 在42。C恒溫水浴箱中3h以上；
5、 取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70%， 90%， 95%的乙醇各洗 2min ，自然干燥；
6、 將玻片放入保濕盒內(nèi)，每位病人標(biāo)本兩張， 一張加正義雜交液20ul/片， 另一張加反義雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42。C恒溫水浴 箱中16-24h;
7、 取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)
在42"C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min 在42。C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min 在42'C恒溫水浴箱中用0. 1 X緩沖液II洗兩次，每次15min;
8、 用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；
9、 將玻片放入保濕盒內(nèi)，加0. 5%1封閉液(lml封閉液加5mllX緩沖液III) 100ul/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min;10、取出玻片，用IX緩沖液III洗30S，自然干燥；
〗1、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加堿性磷酸酶抗體(加入1.8mllX緩沖液 111)100ul/片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min;
12、 取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min;
13、 1 X緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73. 3ul，顯色劑B157. 5ul加 到30mllX緩沖液IV中，混勻)，室溫避光12h以上；
14、 用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的1X緩沖液I混勻)封片 鏡檢。
四、結(jié)果判斷
在光鏡下計(jì)數(shù)100-300個(gè)細(xì)胞，計(jì)算染上紫色細(xì)胞的百分比。 陽性對(duì)照標(biāo)本加反義雜交液的應(yīng)該80%以上染上紫色。 所有加正義雜交液的陰性內(nèi)對(duì)照應(yīng)無色。
肺癌病人PAX9基因過量表達(dá)圖見圖1。正常人PAX9基因表達(dá)圖見圖2。 地高辛標(biāo)記的cDNA、 RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標(biāo)記優(yōu) 點(diǎn)，還克服了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等 缺點(diǎn))，將該雜交探針與人體血液白細(xì)胞的待測(cè)RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫 組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷 目的基因的表達(dá)量。
本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過檢測(cè)底物細(xì)胞中 的PAX9基因表達(dá)量，用來確定肺癌是否發(fā)生和/或轉(zhuǎn)移，臨床研究表明，PAX9 基因是一種致肺癌基因，因?yàn)镻AX9基因在正常人中低表達(dá)，如果PAX9基因表 達(dá)過度，說明肺癌已經(jīng)發(fā)生和轉(zhuǎn)移。利用本發(fā)明檢測(cè)方法，可以判斷出PAX9 基因表達(dá)量，從而獲得癌癥的診斷信息。實(shí)施例3
用PAX9基因試劑盒檢測(cè)肺癌疾病與用TIG2基因試劑盒檢測(cè)肺癌疾病之
間對(duì)比實(shí)驗(yàn)。
為了科學(xué)評(píng)價(jià)上述基因各自在肺癌疾病的特異性、敏感性、準(zhǔn)確性。我
們用平行試驗(yàn)的方法，同時(shí)檢測(cè)上述基因的mRNA，檢測(cè)技術(shù)采用核酸原位雜交 技術(shù)，用同一例肺癌疾病患者的外周血，同時(shí)檢測(cè)PAX9基因和TIG2基因的 mRNA (進(jìn)行核酸原位雜交、免疫組化染色、鏡下記數(shù)、結(jié)果報(bào)告等均采用實(shí)施 例1和實(shí)施例2的原位雜交技術(shù)的相同方法和步驟及試劑)。發(fā)現(xiàn)PAX9基因在 肺癌疾病病人中表達(dá)量比TIG2基因在同一疾病病人的表達(dá)量要高。結(jié)果表明， PAX9基因?qū)Ψ伟┘膊≡\斷的特異性、敏感性、準(zhǔn)確性比TIG2基因更好，原位 雜交基因表達(dá)圖顯示，PAX9基因的表達(dá)量是7(F。， TIG2基因的表達(dá)量是5(m。 本發(fā)明的試劑盒作于肺癌疾病診斷的指標(biāo)有非常重要的臨床意義。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些 改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
15SEQUENCE LISTING
〈110〉芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司
〈120〉 一種PAX9基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用 〈130〉 / 〈160〉 1
〈170〉 Patentln version 3. 1 〈210〉 1 〈211〉 3113 〈212〉 DNA
〈213〉 智人(Homo sapiens) 〈400〉 1
gctctcgcaa gg卿aagcg ggcg
60
gctcgcagcc cgtggggctg atcccacctc
ccgcagggct ccggtcgtgt cgctgtcgga ccgcagaacg ccgggacgca tttccgagct 120
cgggcccgac ccaacccgct gccattctag ctacctagtg gagccgcgga gagactcttg 180
aaccgtgagg ctccttgatg 3g犯ggtgga gaggctgccg ggctattctc cgagcatctt 240
ccggccgagc tctgctcctc tccgtgcgct tgcggcttct ccttgggcta gcgcgtccgc 300
agtccctcca agtccaggcc gcagtcaccc aggtggggag ctagcctgaa ag3gacagcg 360
gaaggagttt cctggactgc gctgtcgctc accgacccgc acc肌tcacc atgcagcttg 420
ccctcggacc cgcccctttt agggcgtgtc cccagtgagt gatagacgga gccgccctgc 480
cctgctcagc ccagcccacg ttgctgctta gattgaaatg cagaactcaa gcctctttca 540
tcggggcaca gacttccttt tacttcttcc ttttgccctc tcgcctcctc ctcctgggaa 600
g,cggagg cgccggcggt cggccgggat agcaacaggc cgggccactg aggcggtgcg ,
gaaagtttct gtctgggagt gcggaactgg ggccgggttg gtgtactgct cggagcaatg 720
gagccagcct tcggggaggt gaaccagctg ggaggagtgt tcgtg肌cgg gaggccgctg ，
cccaacgcca tccggcttcg catcgtggaa ctggcccaac tgggcatccg accgtgtgac 840
atcagccgcc agctacgggt ctcgcacggc tgcgtcagca agatcctggc gcgatacaac 900
gagacgggct cgatcttgcc aggagccatc gggggcagca兆ccccgggt cactaccccc 960
accgtggtga aacacatccg gacctacaag cagagagacc ccggcatctt cgcctgggag 1020atccgggacc gcctgctggc ggacggcgtg tgcgacaagt acaatgtgcc ctccgtgagc 1080
tccatcagcc gcattctgcg caacaagatc ggcaacttgg cccagcaggg tcattacgac 1140
tcatacaagc agcaccagcc gacgccgcag ccagcgctgc cctacaacca catctactcg 1200
taccccagcc ctatcacggc ggcggccgcc aaggtgccca cgccacccgg ggtgcctgcc 1260
atccccggtt cggtggccat gccgcgcacc tggccctcct cgcactccgt caccgacatc 1320
ctgggcatcc gctccatcac cgaccaagtg agcgacagct ccccctacca cagccccaag 1380
gtggagg服t gga^gcagcct gggccgcaac aacttccccg ccgccgcccc gcacgcggtg 1440
aacgggttgg agaagggagc cctggagcag gaagccaagt acggtcaggc accaaatggt 1500
ctcccagctg tgggcagttt tgtgtcagca tccagcatgg ctccttaccc taccccagcc 1560
caagtgtcgc cttacatgac ctacagtgct gctccttctg gttatgttgc tggacatggg 1620
tggcaacatg ctgggggcac ctcattgtct ccccacaact gtgacattcc ggcatcgctg 1680
gcgttc肌gg gaatgcaggc agccag3gaa ggtagtcatt ctgtcacggc ttccgcgctc 1740
tgatgggaaa ttccgtctcc agcagcttca cccgggtctc cctgtctcag cacctcctcc 1800
cccaattccc aggtctcaca tcccacccct cctgccctcc aacccttctg ccttgaaagc 1860
tggctgtacg gactcacatc ctttgtgcta atgacactta catatttctt gccataactt 1920
ttctcttgca gaaaaactga catgacttta ggatttaaaa acaagagcaa caataagcat 1980
tgaatgagac atttgtgttg cccacatact gtcttaacat aacaaagaaa cctacacccc 2040
tcaaagggtt taaggaactt tacaaactag tctttggtaa aaccacatgt gtatatttat 2100
tctaaatcaa cctgaacttt tgaaatgtgc aattgttgag attttgcaaa atcaataaag 2160
gaaaatactt atoga^aaaa ttatgctaca ccctctaatc aaatatggta accaagtoag 2220
ctttaattca tcattaggaa acaaatcaat aagtgacttg tttgagtgat cctttgttta 2280
agacatgacc tattttgttg aaaaatatat gtsgasccca 3gcaatatct g朋tctagct 2340
ctccctggtg ttttgacttg gttccaaata caataatgtt tatattttct attagtttgt 2400aaatacggac tctggatggt gcatttgtgt cttcattcca taagatattc ccctcccctc 2460
agccccaccc cctctctatt tttttctttc ttttttgcaa aggtgacttt ctggcaacgt 2520
ctttgtctct gtttggtggt gggctgctcg ggctcctgga cctggacttg cccccaaatt 2580
ttgtgtatgc 3gtgaaggct tcaacatctc atgaaggaca ctttatttct acagcagagg 2640
acacgaaaaa cagataaaac aagccagtct cccattttgt acctaatcaa acaacacaca 2700
tgct犯gcat at3肌g3caa geigggtggaa a^tatctgaa caag肌ggct cteaagga^g 2760
tcacttagaa acttaagttt aatgtgaaat gttttgcaaa gatgcttaaa atgaactttg 2820
tgttaagaaa accactgtga aactaaattg tcctattatt gttggcttac ctgtgtgttc 2880
a^gcaatctca gccccaaM3 atgttgtaat ttaaagaaaa tggaaaattc tgctctaatg 2940
aatgtaacaa tggcttgctg tgaagtttac attgttgtac agaagcatgt ttcgcatgta 3000
ggtaaactgg tggtggtact agaaatacaa tgttatttaa ttttaacaaa ttccctttat 30G0
tcatttctga aattaragga cacagtttaa ctcataaaaa aaaasa^taa saa 311權(quán)利要求
1. 一種PAX9基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒在制備檢測(cè)肺癌疾病藥物中的應(yīng)用，所述的試劑盒包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的雜交探針 序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的標(biāo)記 物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的放射性核 素選自3H、 35S、 1251或32P中的一種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性 標(biāo)記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的 一 種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性 標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。
8. —種PAX9基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物， 其特征在于，所述的雜交探針序列如SEQ IDNO. 1所示，所述的標(biāo)記 物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。
9. 一種PAX9基因原位雜交檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a、 將權(quán)利要求8所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測(cè)RNA接 觸，形成雜交復(fù)合體;'b、 檢測(cè)a步驟得到的雜交復(fù)合體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)方法，其特征在于a步驟中形 成雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時(shí)間為16 — 24小時(shí)，所述的底物選用血液細(xì)胞標(biāo)本或組織細(xì)胞標(biāo)本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種PAX9基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還提供了一種PAX9基因原位雜交檢測(cè)方法。另外，本發(fā)明還提供了試劑盒在制備檢測(cè)肺癌疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。本發(fā)明的檢測(cè)方法操作方便、簡(jiǎn)單，能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101469353SQ20081004226
公開日2009年7月1日 申請(qǐng)日期2008年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月29日 公開號(hào)200810042263.發(fā)明者張?jiān)聘? 裘建英 申請(qǐng)人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司