專利名稱：腸道病毒71型核酸擴(kuò)增液態(tài)芯片檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腸道病毒71型的檢測(cè)試劑
背景技術(shù)：
腸道病毒71型(enterovirus71， EV71)是小RNA病毒科 (Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus)成員。EV71感染主要引起患 者手足口病(HFMD)，并且是該病的主要病原體。另外，EV71還可引起無(wú) 菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣的麻痹等多種神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病， 并可暴發(fā)流行，導(dǎo)致死亡，嚴(yán)重危害人類健康。
為了在EV71相關(guān)疾病暴發(fā)時(shí)能夠迅速查明病因，從而及時(shí)采取正確、 有效的控制措施，亟需針對(duì)EV71的準(zhǔn)確、快速、高靈敏度、高特異性、 高通量的新型診斷手段。腸道病毒感染具有"一因多病， 一病多因"的特 點(diǎn)，僅根據(jù)臨床癥狀不易做出正確的診斷。例如，引發(fā)手足口病的腸道病 毒就有20多種(型)，柯薩奇病毒A組的16、 4、 5、 9、 10型，B組的2、 5型，以及腸道病毒71型均為手足口病較常見的病原體，其中以腸道病 毒71型和柯薩奇病毒A16型(Coxsakie A16，簡(jiǎn)稱CoxA16)最為常見。腸 道病毒的傳統(tǒng)檢測(cè)方法是病毒分離、血清中和試驗(yàn)和分子生物學(xué)診斷技 術(shù)。病毒分離操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高、分離率低。免疫學(xué)方法雖然比 分離培養(yǎng)法更加簡(jiǎn)便、快速，但是整個(gè)檢測(cè)時(shí)間仍需1周左右的時(shí)間。病 人感染病毒后，血清中產(chǎn)生特異性抗體需要一段時(shí)間。另外，EV71感染 后只有2 10天(平均3 5天)的潛伏期，而傳染力始于發(fā)病的前幾天， 所以免疫學(xué)方法敏感度較低，尤其不適合早期診斷。毒株抗原變異、抗原 抗體交叉反應(yīng)、患者個(gè)體差異等均在較大程度上影響了該法的準(zhǔn)確性與特異性。近年來(lái)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)廣泛應(yīng)用于病毒特異性基因的
檢測(cè)，盡管它也具有靈敏、特異、快速的優(yōu)點(diǎn)，但結(jié)果判定需要電泳，且 反應(yīng)產(chǎn)物容易產(chǎn)生污染而導(dǎo)致假陽(yáng)性。
由此可見，目前常用的腸道病毒71型檢測(cè)手段均存在較大的不足，不 能滿足疾病暴發(fā)時(shí)對(duì)大量臨床樣本，尤其是早期樣本準(zhǔn)確、快速診斷的要 求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有腸道病毒71型檢測(cè)手段均存在較 大的不足的問題
為了解決上述問題，本發(fā)明公開了一種腸道病毒71型核酸擴(kuò)增液態(tài)芯 片檢測(cè)試劑盒，包括
一對(duì)EV71基因組特異性引物A和A，，其中A禾口/或A，的5'端標(biāo) 記有生物素；
一對(duì)EV71基因組特異性引物B和B，，其中B和/或B，的5'端標(biāo) 記有生物素；
一種交聯(lián)與引物A和A'擴(kuò)增片段序列配對(duì)的探針E的熒光編碼微球
C;
一種交聯(lián)與引物B和B'擴(kuò)增片段序列配對(duì)的探針F的熒光編碼微球
D;
QRT-PCR試劑；
熒光物標(biāo)記的親和素。
本發(fā)明中，定義"EV71基因組特異性引物"是指以GeneBank中已公開 的EV71核酸序列為模板，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過公知的引物設(shè)計(jì)軟件得到 針對(duì)EV71基因組特異性引物序列，相應(yīng)的引物可以通過核酸合成儀制備 得到。本發(fā)明中所述引物A和A' 、 B和B，的序列均不相同。
在一實(shí)施方式里，所述的熒光編碼微球C為luminex公司的144微球。 在一實(shí)施方式里，所述的熒光編碼微球D為luminex公司的146微球。在一些實(shí)施方式里，所述熒光物標(biāo)記的親和素中熒光物選自異硫氰酸 熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、藻紅蛋白、3價(jià)鑭系螯
合物如銪(Eu3+)、鋱(Tb3+)、鈰(Ce3+)等中之一，其中優(yōu)選藻紅蛋白。 在一些實(shí)施方式里，所述的熒光基團(tuán)是FAM， TET， VIC，或HEX。 在一實(shí)施方式里，所述的EV71特異性引物A和A'的核苷酸序列為5' -GCGGGTAGTGTGTCGTAAC-3 ， (SEQ ID NO:4)和5， -GGTGGTCACAGACTTCAAGGTT-3 ， (SEQ ID NO:5);所述與引物A和 A'擴(kuò)增片段序列配對(duì)的探針E的核苷酸序列為5' -NH-TTTTTTGGATTGGCCATCCGGTGTGCA-3'(SEQ ID NO:6)。
在一實(shí)施方式里，所述的EV71特異性引物B和B，的核苷酸序列為5' -GATTGAGACACGCTGTGTTCT-3' (SEQ ID NO:7)禾卩5'-GCCTTCAAGAGGGAGGTCTATC-3， (SEQ ID NO:8);所述與引物B和 B'擴(kuò)增片段序列配對(duì)的探針F的核苷酸序列為5' -NH-TTTTTTCAGCAGAGCGGGATTAGTTGGAC-3' (SEQ ID NO:9)。 核酸擴(kuò)增液態(tài)芯片EV71檢測(cè)技術(shù)步驟
(1) 引物與探針的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)兩對(duì)EV71特異性引物及相應(yīng)的雜交探 針對(duì)兩個(gè)區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測(cè)。
(2) 探針與熒光編碼微球的交聯(lián)。
(3) EV71 RT-PCR反應(yīng)液的制備將各反應(yīng)成分按一定濃度混合在一起。
(4) 病毒核酸檢測(cè)通過PCR擴(kuò)增，熒光編碼微球探針與產(chǎn)物的雜 交，最后進(jìn)行液態(tài)基因芯片檢測(cè)。
(5) 結(jié)果判斷，根據(jù)參照品檢測(cè)數(shù)據(jù)計(jì)算Cutoff值，從而判斷樣品屬性。
本發(fā)明所公開的液態(tài)生物芯片檢測(cè)不僅擁有更為優(yōu)異的特異性與靈敏
度，更擁有常規(guī)檢測(cè)技術(shù)不可能具有的特點(diǎn)高通量，同時(shí)結(jié)果穩(wěn)定，重
復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便。獨(dú)特的擴(kuò)增位點(diǎn)選擇，尤其是液態(tài)芯片的雙區(qū)域檢測(cè)，
5可以顯著地降低因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)及新亞型病毒株出現(xiàn)而導(dǎo)致的檢測(cè)假陰性，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，最 終符合當(dāng)前腸道病毒臨床檢驗(yàn)的快速、靈敏、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高通量的要求。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一歩闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用 于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件 的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。比例和 百分比基于重量，除非特別說明。下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。 (一)熒光定量PCREV71檢測(cè)試劑對(duì)臨床樣本的檢測(cè)(液態(tài)芯片檢 測(cè)同步進(jìn)行，在此分開描述)(1) 引物與探針的設(shè)計(jì)針對(duì)EV71基因組特異性保守序列設(shè)計(jì)一對(duì) 引物與一條5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)和3'端標(biāo)記BHQ的Taq-Man探針，探 針標(biāo)記FAM基團(tuán)。探針序列5 ， -TCGCACAGCACAGCTGAGACCAC-3 ， (SEQIDNO:3)。上游引物5'畫GATTGAGACACGCTGTGTTCT-3， (SEQ ID NO:l);下游引物5，-GCCTTCAAGAGGGAGGTCTATC-3， (SEQ ID NO:2);(2) EV71 QRT-PCR反應(yīng)液的制備將各反應(yīng)成分混合在一起，成分 及濃度(20pL體系)為2x反應(yīng)Mixl0pL，上游引物終濃度0.4 ^M， 下游引物終濃度0.2 (aM，探針終濃度0.4pM。(3) 參照品的制備以腸道病毒71型的核酸為模板，通過RT-PCR 方法獲得PCR產(chǎn)物后，稀釋成特定濃度制成強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照和臨界陽(yáng)性對(duì)照。 陰性對(duì)照以采用"金標(biāo)"確認(rèn)為EV71陰性結(jié)果的糞便標(biāo)本制備而成。(4) 病毒核酸抽提病毒核酸抽提由深圳市疾病預(yù)防控制中心(CDC) 提供(利用Promega病毒核酸磁珠抽提試劑盒在Beckman Biomek 3000 核酸自動(dòng)提取儀上完成)，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)在該機(jī)構(gòu)微生物檢測(cè)中心完成。(5) 病毒核酸檢測(cè)取病毒RNA核酸9.3pL， QRT-PCR反應(yīng)液10.2 (iL，反應(yīng)酶0.5^L，同時(shí)設(shè)置臨界陽(yáng)性對(duì)照、強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。反 應(yīng)條件50°C， 15min;95 。C ， 2 min; 95 。C ， 15 sec， 60 。C ， 30 sec，50個(gè)循環(huán)。采用Stmtagene Mx3005 P熒光定量PCR儀，熒光信號(hào)收集時(shí) 設(shè)定為FAM熒光素，熒光信號(hào)收集設(shè)在6(TC。(6)結(jié)果判斷閾值(threshold)可以自動(dòng)生成，也可根據(jù)儀器噪音 情況調(diào)整，設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線(無(wú)規(guī)則 的噪音線)的最高點(diǎn)，且Ct值二50.0為準(zhǔn)。檢測(cè)樣本中5<Ct^50，樣本報(bào)告為陽(yáng)性；檢測(cè)樣本中Ct值為"NoCt"， 樣本報(bào)告為陰性；對(duì)于較弱的擴(kuò)增，單個(gè)曲線要單獨(dú)分析，調(diào)整閾值線剛 好高過基線，如果擴(kuò)增曲線高過閾值線，則該樣品為陽(yáng)性。(二) EV71核酸擴(kuò)增液態(tài)芯片檢測(cè)試劑對(duì)臨床樣本的檢測(cè)(1) 引物與探針的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)兩對(duì)EV71特異性引物，5'端標(biāo)記有生 物素(biotin);另外還有一對(duì)相應(yīng)的雜交探針，末端帶有氨基。上游引物 1: 5 ， -Biotin-GCGGGTAGTGTGTCGTAAC-3 ，；下游引物1:5 ，-GGTGGTCACAGACTTCAAGGTT-3';探針1: 5'-NH-TTTTTTGGATTGGCCATCCGGTGTGCA-3，；上游引物2: 5,隱GATTGAGACACGCTGTGTTCT-3 ，；下游引物2: 5'-Biotin-GCCTTCAAGAGGGAGGTCTATC-3,;探針2: 5 ，-NH-TTTTTTCAGCAGAGCGGGATTAGTTGGAC-3'。(2) 探針與熒光編碼微球的交聯(lián)將兩種特異探針分別與144和146 號(hào)熒光編碼微球交聯(lián)(交聯(lián)過程略)。(3) EV71 RT-PCR反應(yīng)液的制備將各反應(yīng)成分混合在一起，成分 及濃度(20^L體系)為2x反應(yīng)Mix 10 pL，引物終濃度均為0.4 )iM。(4) 病毒核酸檢測(cè)PCR擴(kuò)增取病毒RNA核酸9.18pL， RT-PCR反應(yīng)液10.32 ^L,反 應(yīng)酶0.5pL，同時(shí)設(shè)置臨界陽(yáng)性對(duì)照、強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照(制備方法 同熒光定量)。反應(yīng)條件50°C， 15min; 95 °C ， 2 min; 95 °C ， 15 sec， 55°C， 20sec， 72 °C ， 30 sec， 50個(gè)循環(huán)。雜交取微球稀釋液15 與兩種交聯(lián)有探針的微球各2 混合，然后加入上述擴(kuò)增產(chǎn)物5^L，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照(空白對(duì)照為lxTE)。雜
交條件95°C， 5min， 55°C， 20min。
檢測(cè)加入2 [ig/mL藻紅蛋白(PE， Invitrogen) 36 ^L，55 。C孵育 30min。然后在液態(tài)芯片200分析儀(QIAGEN)上檢測(cè)。樣品板設(shè)置為 55 °C;上樣體積為50pL;取樣時(shí)間(timeout)為75 sec; gate設(shè)置下 限7 500，上限15 000;單位為MFI;最少檢測(cè)微球數(shù)為100;數(shù)據(jù)輸出 為"data collection only"。整個(gè)過程依Luminex 200分析儀系統(tǒng)說明手冊(cè)進(jìn) 行。
(5)結(jié)果判斷中間熒光強(qiáng)度(Medium)值低于Cutoff值的樣本為 陰性，中間熒光強(qiáng)度(Medium)值高于Cutoff值的樣本為陽(yáng)性，Cutoff 值二1.25xNTC平均值+15。
(三)結(jié)果與分析
臨床試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，30例EV71臨床陽(yáng)性樣本，28例為熒 光定量PCR檢測(cè)陽(yáng)性，其中2例熒光定量PCR陰性樣本，液態(tài)芯片檢測(cè) 全部為陽(yáng)性。
由此可見，熒光定量PCR雖然也可以對(duì)病毒核酸敏感、特異的檢測(cè)， 但因?yàn)閱魏塑账岫鄳B(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)及新亞型毒株 的出現(xiàn)，而常常出現(xiàn)假陰性。液態(tài)生物芯片采用多區(qū)域檢測(cè)，可以顯著地 降低假陰性。
_表1 EV71核酸擴(kuò)增熒光定量與液態(tài)芯片雙檢試劑盒臨床試驗(yàn)結(jié)果
樣本編
號(hào)熒光定量Ct值144球讀數(shù)146球讀數(shù) 結(jié)果判斷
140.94376.5665.5 陽(yáng)性
242.2965137.5 陽(yáng)性
325.873870 陽(yáng)性
429.8729128.5 陽(yáng)性
531.21518204.5 陽(yáng)性
617.4446.5170 陽(yáng)性
738.54404351 陽(yáng)性836.9732.5229陽(yáng)性
935.2429550陽(yáng)性
1032.1166349.5陽(yáng)性
1125.2131254.5陽(yáng)性
1242.79109.537.5陽(yáng)性
1329.71134158陽(yáng)性
1421.979.5141陽(yáng)性
1525.1135564.5陽(yáng)性
1629.69197174.5陽(yáng)性
1738.31253.576陽(yáng)性
1819.8690.5160.5陽(yáng)性
1938.8528.58.5陽(yáng)性
2036.3447159陽(yáng)性
2123.73123128陽(yáng)性
2227.53219198陽(yáng)性
2321.92131647陽(yáng)性
2433.1128143.5陽(yáng)性
2536.2256221陽(yáng)性
2634.07341480陽(yáng)性
2724.58309565.5陽(yáng)性
2824.6862.5338.5陽(yáng)性
29No Ct619.5240.5陽(yáng)性
30No Ct19238.5陽(yáng)性
陰性對(duì)
照No Ct3.5陰性
照陽(yáng)性對(duì)28.01133476陽(yáng)性
Blank—65陰性
注:Ct值代表熒光定量PCR有明顯擴(kuò)增，"No Ct"表示無(wú)擴(kuò)增。"表示沒有檢測(cè)。
本發(fā)明的范圍不受所述具體實(shí)施方案的限制，所述實(shí)施方案只欲作為闡 明本發(fā)明各個(gè)方面的單個(gè)例子，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括功能等同的方法和組 分。實(shí)際上，除了本文所述的內(nèi)容外，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照上文的描述和 附圖
可以容易地掌握對(duì)本發(fā)明的多種改進(jìn)。所述改進(jìn)也落入所附權(quán)利要求 書的范圍之內(nèi)。序列表
<110〉上海佑安生物技術(shù)有限公司
<120>腸道病毒71型核酸擴(kuò)增液態(tài)芯片檢測(cè)試劑盒
<130>序列表
〈160〉 6
<170〉 Patentln version 3. 3
<210〉 1
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence <220>
<223> artificial sequence
<400> 1
gcgggtagtg tgtcgtaac 19
〈210〉 2
〈211〉 22
<212> 腿
〈213〉 artificial sequence <220>
〈223> artificial sequence
〈400〉 2
ggtggtcaca gacttcaagg tt 22
〈210> 3
<211〉 27
<212〉 DNA
<213> artificial sequence <220>
<223> artificial sequence
10<400〉 3
ttttttggat tggccatccg gtgtgca 27
〈210〉 4
<211〉 21
<212> DNA
〈213> artificial sequence <220>
<223> artificial sequence
〈400〉 4
gattgagaca cgctgtgttc t 21
〈210〉 5
<211> 22
<212> DNA
<213〉 artificial sequence 〈220〉
<223〉 artificial sequence
〈400〉 5
gccttcaaga gggaggtcta tc 22
<210> 6
<211〉 29
〈212〉 DNA
〈213〉 artificial sequence <220〉
〈223> artificial sequence
〈400〉 6
ttttttcagc agagcgggat tagttggac 29
權(quán)利要求
1.一種腸道病毒71型核酸擴(kuò)增液態(tài)芯片檢測(cè)試劑盒，包括一對(duì)EV71基因組特異性引物A和A’，其中A和/或A’的5’端標(biāo)記有生物素；一對(duì)EV71基因組特異性引物B和B’，其中B和/或B’的5’端標(biāo)記有生物素；一種交聯(lián)與引物A和A’擴(kuò)增片段序列配對(duì)的探針E的熒光編碼微球C；一種交聯(lián)與引物B和B’擴(kuò)增片段序列配對(duì)的探針F的熒光編碼微球D；QRT-PCR試劑；熒光物標(biāo)記的親和素。
2. 如權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型核酸擴(kuò)增液態(tài)芯片檢測(cè)試劑盒，其 特征在于所述的EV71特異性引物A和A'的核苷酸序列如SEQ ID NO:4 和SEQIDNO:5所示；所述與A和A，擴(kuò)增片段序列配對(duì)的探針E的核苷 酸序列如SEQ IDNO:6所示。
3. 如權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型核酸擴(kuò)增液態(tài)芯片檢測(cè)試劑盒，其特 征在于所述的EV71特異性引物B和B，的核苷酸序列如SEQ ID N0:7和 SEQIDNO:8所示；所述與引物B和B'擴(kuò)增片段序列配對(duì)的探針F的核苷 酸序列如SEQ ID NO:9所示。
4. 如權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型核酸擴(kuò)增液態(tài)芯片檢測(cè)試劑盒，其特 征在于所述的熒光編碼微球C luminex公司的144微球。
5. 如權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型核酸擴(kuò)增液態(tài)芯片檢測(cè)試劑盒，其特 征在于所述的熒光編碼微球D luminex公司的146微球。
6. 如權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型核酸擴(kuò)增液態(tài)芯片檢測(cè)試劑盒，其特 征在于所述熒光物標(biāo)記的親和素中熒光物選自異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹 明、四甲基異硫氰酸羅丹明、藻紅蛋白、或3價(jià)鑭系螯合物中之一。
7. 如權(quán)利要求6所述的腸道病毒71型核酸擴(kuò)增液態(tài)芯片檢測(cè)試劑盒，其特 征在于所述的熒光物為藻紅蛋白。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腸道病毒71型的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明公開了一種腸道病毒71型核酸擴(kuò)增液態(tài)芯片檢測(cè)試劑盒，包括一對(duì)5’端標(biāo)記有生物素EV71特異性引物A和A’；一對(duì)5’端標(biāo)記有生物素EV71特異性引物B和B’；一種交聯(lián)與引物A和A’擴(kuò)增片段序列配對(duì)的探針E的熒光編碼微球C；一種交聯(lián)與引物B和B’擴(kuò)增片段序列配對(duì)的探針F的熒光編碼微球D；QRT-PCR試劑和熒光物標(biāo)記的親和素。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101665839SQ200810042338
公開日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2008年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月1日
發(fā)明者朱文斯 申請(qǐng)人:上海佑安生物技術(shù)有限公司