專利名稱：：一株紅球菌以及利用該菌株制備光學(xué)純手性亞砜的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，涉及一株紅球菌及其用于生產(chǎn)光學(xué)純手性亞砜的用途。
背景技術(shù)：
：有機(jī)硫化合物在有機(jī)合成中很早就得到了廣泛的應(yīng)用。光學(xué)活性的亞砜在不對(duì)稱合成中的應(yīng)用也日漸增多，成為誘導(dǎo)許多不對(duì)稱轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要工具。尤其在過(guò)去的20年中，手性亞砜化合物作為手性輔助試劑在不對(duì)稱合成領(lǐng)域中的應(yīng)用呈現(xiàn)指數(shù)級(jí)的增長(zhǎng)，確立了手性亞砜官能團(tuán)在碳碳鍵和碳雜鍵形成過(guò)程中作為最有效、最通用手性控制因素的地位。手性亞砜化合物作為最成功、最有效的手性控制因素之一，至少存在三個(gè)有利的因素(l)手性亞砜具有高度的立體化學(xué)穩(wěn)定性。由大多數(shù)亞砜的熱力學(xué)常數(shù)計(jì)算表明，亞砜的兩個(gè)異構(gòu)體要在200'C左右才能發(fā)生轉(zhuǎn)化或消旋化。(2)它是手性信息的有效載體。亞砜類化合物具有一個(gè)錐形結(jié)構(gòu)，與其它手性基團(tuán)相比，它至少有三個(gè)具有明顯位阻和電子差異的取代基，即氧原子、孤對(duì)電子、兩個(gè)取代基(烷基或芳基)。當(dāng)兩個(gè)取代基不同時(shí)，亞砜就具有手性特征。(3)兩種構(gòu)型的對(duì)映異構(gòu)體都能較容易得到。手性亞砜的功能進(jìn)一步表現(xiàn)在一些含有硫原子手性中心的具有藥理活性的化合物中。例如苯并吡唑類質(zhì)子泵抑制劑是治療胃潰瘍、十二指腸潰瘍、反流性食管炎、Zollinger-Emson綜合癥、HP感染等眾多病癥的有效藥物。目前使用較多的是替莫拉唑(Timoprazole)、皮可拉唑(Picoprazole)、奧美拉唑(Omeprazole)、蘭索拉唑(Lansoprazole)、潘妥拉唑(Pantoprazole)、雷貝拉唑(Rabeprazole)等。2002年這些質(zhì)子泵抑制劑的全球銷售額達(dá)219億美元。然而在一些這類藥物當(dāng)中，只有一種對(duì)映體表現(xiàn)出所需要的或者更好的藥理活性，因此這又進(jìn)一步說(shuō)明了獲得光學(xué)活性的亞砜是非常必要的。生產(chǎn)光學(xué)活性亞砜的途徑可以分為兩種，一種傳統(tǒng)的途徑是外消旋亞砜的動(dòng)力學(xué)拆分，另一種途徑是前手性硫醚的不對(duì)稱氧化。外消旋體的拆分需要先將硫醚首先化學(xué)氧化為外消旋的亞砜，然后再對(duì)其進(jìn)行拆分，過(guò)程比較繁瑣并且最高的理論得率只有50%。而與傳統(tǒng)的拆分相比較，硫醚的不對(duì)稱氧化則更加直接和經(jīng)濟(jì)，它直接以前手性的硫醚為底物，理論得率可以達(dá)至!1100%。近年來(lái)，金屬催化劑和酶己經(jīng)成功地用于前手性硫醚的不對(duì)稱氧化來(lái)生產(chǎn)光學(xué)活性的亞砜。但是利用金屬催化劑進(jìn)行的硫醚不對(duì)稱氧化反應(yīng)，反應(yīng)條件比較苛刻，操作比較繁瑣，對(duì)環(huán)境不友好以及得到的產(chǎn)物"值普遍不高。而利用分離得到的酶進(jìn)行反應(yīng)，還需要先將酶分離純化出來(lái)，而酶的分離純化是非常困難的，并且在反應(yīng)過(guò)程中還需要添加昂貴的輔因子(NADH或NADPH)。利用微生物整細(xì)胞作為催化劑進(jìn)行硫醚的不對(duì)稱氧化反應(yīng)，可以克服以上金屬催化劑和酶進(jìn)行的反應(yīng)所具有的缺點(diǎn)，它避免了酶的分離純化，而且由于細(xì)胞本身具有輔酶再生體系，可避免使用昂貴的輔因子，并且反應(yīng)過(guò)程簡(jiǎn)單、對(duì)環(huán)境友好，對(duì)于制備規(guī)模生產(chǎn)光學(xué)活性的亞砜是比較方便的。巳有一些文獻(xiàn)報(bào)道利用整細(xì)胞對(duì)硫醚進(jìn)行不對(duì)稱氧化得到光學(xué)活性的亞砜。例如，Beecher等人(歷oec/mo/.丄e".，1994,16:909陽(yáng)912)利用尸WMfifo/no"as;^"V/a[NCBI10007和^c/"eto6flc^"ca/coflc幼'a^NCBI9871對(duì)苯甲硫醚進(jìn)行不對(duì)稱氧化，結(jié)果苯甲亞砜的產(chǎn)率分別為87。/。和97。/。,ee分別為27%和85%。Beecher等人(歷ofec/j"o/.1995，10:1069-1074)又利用&cc/iflraw3;cMcerev/w'aeNCYC73不對(duì)稱氧化苯甲硫醚，亞砜的得率為30%，"為60%。Adam等人(7Wra/ze士o":^sywmefry，2004,15:983-985)利用尸seMcfomonas,etfeWfo&ergew^對(duì)苯甲硫醚進(jìn)行不對(duì)稱氧化，底物的轉(zhuǎn)化率為87%，"為91%。但這些以整細(xì)胞作為催化劑進(jìn)行的硫醚不對(duì)稱氧化，產(chǎn)物的"值普遍不高，很難滿足合成過(guò)程中純度的要求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一株紅球菌及其用于制備光學(xué)活性亞砜的用途，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。本發(fā)明的紅球菌(及/w^ococc^sp.ECU0066)是一種屬于紅球菌屬的菌株，是發(fā)明人從土壤樣品中，經(jīng)過(guò)初篩、復(fù)篩及分離純化得到的高選擇性硫醚單加酶產(chǎn)生菌，該菌株已于2008年06月18日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，，保藏號(hào)為CGMCCNo.2547。上述的菌株是從上海、江蘇、山東等地區(qū)的200份土壤中篩選得到的，篩選的具體步驟如下從不同的環(huán)境中采集土壤樣品，利用苯甲硫醚為唯一碳源進(jìn)行兩輪富集培養(yǎng)，篩選硫醚單加氧酶產(chǎn)生菌。通過(guò)反復(fù)篩選，分離得到一株高活力和高選擇性的硫醚單加酶產(chǎn)生菌。本發(fā)明的菌種具有如下的微生物學(xué)特征1、形態(tài)大小球狀，2~3拜，不產(chǎn)芽孢，無(wú)鞭毛，革蘭氏染色陽(yáng)性；2、適宜生長(zhǎng)環(huán)境適宜的生長(zhǎng)溫度為2535。C，可以在pH59環(huán)境中生存；3、平板培養(yǎng)菌落特性在3(TC平板上培養(yǎng)12h可形成小的菌落，36h形成粘稠、濕潤(rùn)的白色菌落，邊緣光滑，中間突出。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，有紅色素生成，最后變成深紅色菌落。根據(jù)"伯杰氏鑒定手冊(cè)"提供的鑒定方法和上述的微生物學(xué)特征，并經(jīng)16SrDNA鑒定，確認(rèn)該菌株為紅球菌屬(及o/iof/ococcwssp.)，標(biāo)號(hào)為及o/iodococcw51sp.ECU0066。但該微生物菌體與之前報(bào)道的紅球菌株有明顯的不同，其主要不同之處在于:該菌能氧化一系列的硫醚，具有較高的產(chǎn)率和良好的選擇性，與之前的紅球菌相比較有很大的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的紅球菌株/o/zo^cocowsp.ECU0066可以用于生產(chǎn)單一對(duì)映體的苯甲亞砜或其衍生物，生產(chǎn)的方法包括如下的步驟(1)菌種的準(zhǔn)備將紅球菌ECU0066在滅過(guò)菌(121。C，20~40min)的豐富培養(yǎng)基(例如葡萄糖1%，蛋白胨0.5%,酵母膏0.5%，瓊脂1.5%)平板上劃線，于2530'C靜置培養(yǎng)約2天后挑取單菌落，作為種子進(jìn)行斜面培養(yǎng)(培養(yǎng)條件同上)，約2天后保存于4'C冰箱中備用。(2)菌株的培養(yǎng)將所述的紅球菌及o/w^cocc^sp.ECU0066采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法，在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)2436h，溫度205(TC;再以上述培養(yǎng)液作為種子，基于發(fā)酵培養(yǎng)基體積的接種量為l10。/。(v/v)，接種至50ml的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在2050。C下10(M60rpm搖床上培養(yǎng)24^48h，離心得到靜息細(xì)胞；所說(shuō)的發(fā)酵培養(yǎng)基可采用常規(guī)的培養(yǎng)基，其中各組分的含量如下葡萄糖10~50g,蛋白胨1~20g，KH2P041~10g,K2HP041~10g，NaCl0.1~2g，MgS040.1~2g，水1000ml，pH3~8。(3)底物的生物轉(zhuǎn)化將收獲的靜息細(xì)胞，懸浮于pH為6.08.0的磷酸鉀緩沖溶液中，靜息細(xì)胞的含量為10100g(濕重)/L;加入前手性底物苯基甲基硫醚或其衍生物，最終濃度為5~100mM，在2540。C和100-160rpm的恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)618h，然后從反應(yīng)液中收集產(chǎn)物(5)-(-)-苯甲亞砜，精制后得到純品無(wú)色油狀液體，產(chǎn)率44.2%，ee99%，比旋光度[a]g=-134.5。(c0.7,acetone)。所述的苯甲硫醚及其衍生物具有如下結(jié)構(gòu)式R廣S-R2，其中取代基&或R2分別選自苯基、Cl4的烷基、Cl4的烷基苯基、Cl4的垸氧基苯基、鹵代苯基、噻唑基或噻吩基中的任意一種，且I^4R2。由上述公開(kāi)的技術(shù)方案可見(jiàn)，采用本發(fā)明的紅球菌株生產(chǎn)光學(xué)純的手性亞砜，不僅具有較好的催化效果，能夠合成光學(xué)純度(>99%)的亞砜，而且催化劑易于制備、反應(yīng)條件溫和、底物適應(yīng)性廣，具有很好的工業(yè)應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。具體實(shí)施例方式通過(guò)下述實(shí)施例將有助于進(jìn)一步理解本發(fā)明，但是不能限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例l菌株的篩選配制富集培養(yǎng)基，成分如下(NH4)2SO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，K2HPO46.0g/L，MgSO40.5g/L，CaCl20.05g/L;另配制豐富培養(yǎng)基，組成如下葡萄糖15g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，KH2P041.0g/L，K2HP041.0g/L，MgSO40.5g/L，pH7.0。取少量的土樣懸浮于2ml的富集培養(yǎng)基中，加入苯甲硫醚的吐溫-80乳化液或甲醇溶液為唯一碳源，在254(TC條件下進(jìn)行兩輪富集培養(yǎng)，總共需要2~4天；富集培養(yǎng)之后進(jìn)行薄板層析，半定量地檢測(cè)產(chǎn)物苯甲亞砜的有無(wú)或含量。對(duì)有明顯硫醚氧化產(chǎn)物的富集培養(yǎng)液，取少量稀釋涂布于豐富培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)1~2天，然后根據(jù)菌落的形態(tài)和顏色的不同挑取單菌落。將挑取的單菌落接種于2ml發(fā)酵液體培養(yǎng)基(其組成同豐富培養(yǎng)基)中，預(yù)培養(yǎng)24h，然后加入苯甲硫醚的甲醇溶液，使其終濃度為10mM，生物轉(zhuǎn)化18h之后，用乙酸乙酯萃取后點(diǎn)樣進(jìn)行薄板層析，檢測(cè)苯甲亞砜的生成量，對(duì)有明顯硫醚氧化活性的菌株進(jìn)行保藏。將保存的有明顯活性的菌株接種于50ml的發(fā)酵液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h后，離心收集菌體。然后將離心下來(lái)的菌體再懸浮于IOml的磷酸緩沖液(50mM，pH7.0)中，再加入底物苯甲硫醚進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化18h后，用等體積的乙酸乙酯萃取后進(jìn)行HPLC(使用日本Daicel公司的手性色譜柱ChiracelOD-H,小0.46cmx25cm，流動(dòng)相為正己烷/異丙醇=93:7，v/v，流速lml/min)分析測(cè)定產(chǎn)物的對(duì)映體過(guò)量值(^p)和底物的轉(zhuǎn)化率。最后在800多株候選菌株中篩選出了能立體選擇性氧化苯甲硫醚生成OS)-苯甲亞砜的微生物及oto^coo^ysp.ECU0066。實(shí)施例2微生物的培養(yǎng)培養(yǎng)基配方葡萄糖15g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，KH2PO41.0g/L，K2HP041.0g/L，MgS040.5g/L，pH7.0，121°C高溫滅菌20min。取4'C保藏的紅球菌斜面，挑取一環(huán)接種至裝有50ml培養(yǎng)基的250ml的搖瓶中。在30'C下，160rpm培養(yǎng)12h，按5%(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接至裝有100ml培養(yǎng)基的500ml的搖瓶中，于3(TC、160rpm繼續(xù)培養(yǎng)30h，離心收獲細(xì)胞。測(cè)得發(fā)酵液的酶活力約為34U/L，細(xì)胞濃度約30g(濕重)/L，單位濕細(xì)胞的酶活為1.0U/g濕細(xì)胞。細(xì)胞酶活力單位的定義為在30'C、pH8.0的條件下，每分鐘催化苯甲硫醚氧化生成l.Onmol苯甲亞砜所需要的細(xì)胞量。實(shí)施例3利用靜息細(xì)胞制備(5)-(-)-苯甲亞砜將離心得到的紅球菌及o幻必cocowsp.ECU0066靜息細(xì)胞12g懸浮于100ml磷酸緩沖液(50mM,pH8.0)中，加入底物苯甲硫醚，使其終濃度為5mM，在3(TC和160rpm的恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)4h后，將反應(yīng)液以12，000xg離心l0min，除去細(xì)胞。在上清液中加入NaCl至飽和，用50ml的乙酸乙酯萃取，重復(fù)三次。離心得到的細(xì)胞用20ml乙酸乙酯浸泡，重復(fù)兩次，將這兩部分乙酸乙酯合并，然后用飽和的NaCl溶液洗滌兩次，每次IOml。得到的乙酸乙酯萃取液用無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，得到產(chǎn)物的結(jié)晶粗品，通過(guò)硅膠柱層析(石油醚:乙酸乙酯，體積比2:l)純化后得到(S)-(-)-苯甲亞砜無(wú)色油狀液體，產(chǎn)率44.2%，光學(xué)純度99%ee，[a]g=-134.5。(c0.7,acetone)。實(shí)施例4~10光學(xué)純苯甲亞砜衍生物的合成稱取實(shí)施例2的濕重12g的及o/wfifococc"ssp.ECU0066靜息細(xì)胞，以下列表中所列的苯甲硫醚衍生物為底物，底物濃度為5mM，反應(yīng)體積為IOOml，在30'C和160rpm的恒溫?fù)u床振蕩反應(yīng)大約4h，間歇取樣測(cè)定反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，至轉(zhuǎn)化完全時(shí)結(jié)束反應(yīng)。將反應(yīng)液以12，000xg離心10min，除去細(xì)胞。在離心之后的上清液中加入NaCl至飽和，用50ml的乙酸乙酯萃取，重復(fù)三次，離心得到的細(xì)胞用20ml的乙酸乙酯浸泡，重復(fù)兩次，將這兩部分乙酸乙酯合并，然后用飽和NaCl溶液洗滌兩次，每次IOml。將得到的乙酸乙酯萃取液用無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，得到結(jié)晶粗品，通過(guò)硅膠柱層析(石油醚:乙酸乙酯，體積比2:1)純化后得到產(chǎn)物的純品，用液相色譜分析產(chǎn)物的ee值，稱量產(chǎn)物的質(zhì)量計(jì)算產(chǎn)物的分離產(chǎn)率，并測(cè)定產(chǎn)物的比旋光度，對(duì)照文獻(xiàn)確定產(chǎn)物的絕對(duì)構(gòu)型。反應(yīng)的結(jié)果如下表所示。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>權(quán)利要求1.一株紅球菌(Rhodococcussp.ECU0066)，保藏號(hào)為CGMCCNo.2547。2.—種如權(quán)利要求1所述的紅球菌(itof/ococcwssp.ECU0066)用于制備光學(xué)純苯甲亞砜及其衍生物。3.如權(quán)利要求2所述的紅球菌(/^o^cocc^sp.ECU0066)的用途，其特征是通過(guò)如下步驟制備光學(xué)純苯甲亞砜及其衍生物(1)將所述的紅球菌及/w^ococowsp.ECU0066在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，離心得到靜息細(xì)胞；(2)將(l)收獲的靜息細(xì)胞懸浮于pH為6.0-8.0的磷酸鉀緩沖液中，加入前手性的苯甲硫醚底物及其衍生物，在2540'C反應(yīng)618h，然后采用常規(guī)的分離方法從反應(yīng)混合物中收集光學(xué)純的苯甲亞砜及其衍生物；所述的苯甲硫醚及其衍生物具有如下結(jié)構(gòu)式R廣S-R2，其中取代基&或R2分別選自苯基、C14的垸基、Cl4的垸基苯基、C14的垸氧基苯基、鹵代苯基、噻唑基或噻吩基中的任意一種，且Rt^R2。4.根據(jù)權(quán)利2所述的方法，其特征在于，靜息細(xì)胞在磷酸緩沖液中的含量為10~100g濕重/L。5.根據(jù)權(quán)利2所述的方法，其特征在于，前手性底物苯甲硫醚及其衍生物的濃度為5~100mmol/L。6.根據(jù)權(quán)利2所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下葡萄糖1050g，蛋白胨l~20g，KH2PO4l~10g，K2HPO4l~10g，NaC10.12g，MgSO40.1~2g，自來(lái)水lOOOml，pH3~8。7.根據(jù)權(quán)利3所述的方法，其特征在于，所述的硫醚底物選自苯環(huán)對(duì)位被取代的苯甲硫醚衍生物或者側(cè)鏈被取代的苯基乙基硫醚以及帶有雜環(huán)的硫醚。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一株紅球菌(Rhodococcussp.ECU0066)以及用途，該菌株保藏號(hào)為CGMCCNo.2547。以該菌株的靜息細(xì)胞為生物催化劑，對(duì)前手性的苯烷基硫醚及其衍生物進(jìn)行不對(duì)稱催化氧化，獲得了光學(xué)活性的手性苯甲亞砜及其衍生物。本發(fā)明所述的菌株及其立體選擇性生物氧化工藝不僅具有較好的催化效果，而且操作簡(jiǎn)單、安全，成本低廉，產(chǎn)物容易純化，對(duì)環(huán)境友好。文檔編號(hào)C12N1/20GK101372676SQ20081004242公開(kāi)日2009年2月25日申請(qǐng)日期2008年9月3日優(yōu)先權(quán)日2008年9月3日發(fā)明者盧文芽,張建棟,李愛(ài)濤,林國(guó)強(qiáng),許建和申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)