專利名稱：蚯蚓體腔細(xì)胞提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的細(xì)胞提取方法，具體地說，涉及的是一 種蚯頓體腔細(xì)胞提取方法。
背景技術(shù)：
近年來，國(guó)內(nèi)外己相繼開展了利用蚯蚓作為載體對(duì)可能造成土壤環(huán)境污染的 化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)試，并根據(jù)這些化學(xué)物質(zhì)對(duì)蚯蚓的毒害程度來評(píng)價(jià)其可能對(duì)環(huán)境 的危害程度。也就是說利用蚯蚓作為土壤環(huán)境的一種指示生物。這方面的研究工 作最早在上世紀(jì)四、五十年代就已開展，但只是在近二、三十年來隨著化學(xué)藥品 在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的大量使用和城市及工業(yè)固體廢棄物的大量排放，土壤污染問 題日益嚴(yán)重的情況下，蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)研究工作才得到了較為普遍的重視和發(fā) 展。1981年歐共體(EEC)做出規(guī)定 一種新的化學(xué)藥品登記進(jìn)入市場(chǎng)之前要求具 有針對(duì)于一種藻類， 一種水蚤， 一種高等植物， 一種魚類， 一種蚯蚓和一種有富 積作用的物種的毒理試驗(yàn)資料以及生物降解試驗(yàn)資料。
蚯蚓的免疫系統(tǒng)由先天免疫屏障、細(xì)胞免疫和體液免疫三方面構(gòu)成。蚯蚓的 免疫防御體系由外部屏障結(jié)構(gòu)和防止毒物入侵體內(nèi)后進(jìn)一步蔓延的內(nèi)部免疫機(jī) 制所組成，這種內(nèi)部免疫機(jī)制有自然免疫和獲得性免疫兩種類型，包括細(xì)胞免疫 和體液免疫。在蚯頓的免疫防御體系中，屏障免疫和自然免疫起主要作用，而獲 得性免疫不發(fā)達(dá)。目前己有報(bào)道蚯蚓免疫系統(tǒng)作為生物標(biāo)志物對(duì)土壤中重金屬的 污染的指示作用。
作為環(huán)節(jié)動(dòng)物的典型代表，蚯頓的體細(xì)胞依據(jù)形態(tài)學(xué)和來源分為兩類(1)
具有紅細(xì)胞的血液系統(tǒng)，這一部分與免疫關(guān)系不大。(2)體腔液中的細(xì)胞群，這
些細(xì)胞都不同程度的與免疫過程有關(guān)，或者他們的代謝作用和分泌作用與體液免 疫相關(guān)。此外，排除速度快、特異性小、記憶時(shí)間短是蚯頓細(xì)胞免疫防衛(wèi)的特點(diǎn)。 蚯蚓的先天性免疫和適應(yīng)性免疫的細(xì)胞功能主要是通過體腔細(xì)胞執(zhí)行，因此，蚯 蚓體腔細(xì)胞在細(xì)胞免疫中發(fā)揮著重要的作用。體腔細(xì)胞依染色方法和超微結(jié)構(gòu)形 態(tài)學(xué)、以及功能特性又分為阿米巴樣細(xì)胞和油細(xì)胞。
早期獲得蚯頓體腔細(xì)胞主要是刺破蚯蚓體腔獲取細(xì)胞。目前多采用超聲波刺 激，針刺，電壓剌激、酒精等刺激物的非損傷方法獲取蚯蚓的體腔細(xì)胞。隨著生 物技術(shù)在細(xì)胞水平、亞細(xì)胞水平和分子水平的發(fā)展，以上各種方法提取的蚯蚓體 腔細(xì)胞的數(shù)量和成活率已不能滿足目前對(duì)土壤污染快速檢測(cè)的需要。
纖維針結(jié)合超聲波刺激法提取的蚯蚓體腔細(xì)胞的數(shù)量多且成活率較目前已 報(bào)道的其他方法高，可用于以蚯蚓體腔細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的細(xì)胞流式技術(shù)的單細(xì)胞 凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，滿足對(duì)土壤污染快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)的需要。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，M. Hendawi等在《Ecotoxicology and Environmental Safety》(生態(tài)毒理與環(huán)境安全)(2004， 59: 17-22)上發(fā)表的 "A new ultrasound protocol for extrusion of coelomocyte cells from the earthworm Eisenia fetida"(—種從赤子愛勝蚓提取體腔細(xì)胞的新的超聲波 提取法)，該文中提出用超聲波提取法、乙醇法和電壓刺激法獲取蚯蚓體腔細(xì)胞， 且該超聲波提取法獲得的蚯蚓體腔細(xì)胞數(shù)量明顯大于用乙醇法和電壓刺激法獲 得的蚯躬l體腔細(xì)胞數(shù)量。具體方法為將放置于緩沖液的蚯蚓多次(10次)暴 露于超聲波2-3s。其不足在于該方法雖然提取的蚯蚓體腔細(xì)胞數(shù)量較其他兩 種方法多，但成活率僅為68.2±7.8% ，不能滿足以蚯蚓體腔細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的 細(xì)胞流式技術(shù)和單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種蚯蚓體腔細(xì)胞提取方法，即 用纖維針結(jié)合超聲波刺激法提取的蚯蚓體腔細(xì)胞的技術(shù)，保證所提取的離體細(xì)胞 的數(shù)量和成活率，為進(jìn)一步開展蚯蚓細(xì)胞毒理實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟
第一步，蚯頓(Eisenia andrei)清腸。
選用蚯蚓為安德愛勝蚓(Eisenia andrei)，預(yù)養(yǎng)一段時(shí)間，然后選擇具有 環(huán)帶的健壯成體，平均體重在300mg左右。蚯蚓清腸24小時(shí)后，用濃度為0. Olmol L—'、pH7. 2的PBS緩沖液反復(fù)沖洗干凈蚯蚓，加入3mL含有2. 5mM乙二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA)的PBS。
第二步，將纖維針細(xì)管插入蚯蚓體腔。
纖維針選用長(zhǎng)lcm，內(nèi)徑為0.5mm中空的纖維針細(xì)管。
第三步，用超聲波儀震蕩刺激蚯蚓。
選用的超聲波儀頻率為2服Hz 、功率為300W，震蕩刺激蚯蚓。用超聲波儀 震蕩刺激蚯蚓的時(shí)間為1秒或2秒。目測(cè)溶液微黃后移去蚯蚓，用移液器收集 黃色細(xì)胞。
第四步，細(xì)胞記數(shù)和鏡檢。
加入12mL的Hank， s液清洗三次。4。C下離心20min，轉(zhuǎn)速為250g mirf1， 除去上清液，加入RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)和鏡檢。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是纖維針結(jié)合超聲波刺激法因?yàn)橛兄苯?的、中空的通道與體腔相連接，當(dāng)蚯蚓遭受超聲波刺激時(shí)會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)迅速釋 放大量的體腔細(xì)胞，且在短時(shí)間內(nèi)超聲波的輕微刺激不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，成活 率較高，達(dá)到了90%以上，保證了以蚯蚓體腔細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的細(xì)胞流式技術(shù)的 單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí) 施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述 的實(shí)施例。
纖維針結(jié)合超聲波刺激法在操作時(shí)一定要注意超聲波刺激的時(shí)間，因?yàn)槌?br> 波刺激時(shí)間如過長(zhǎng)雖然獲得的單位體重細(xì)胞數(shù)量多，但往往在超聲波連續(xù)刺激的
作用下把最初已離體的蚯蚓體腔細(xì)胞致死，如只保證獲取的離體細(xì)胞數(shù)量而沒有
保證成活率，在蚯蚓細(xì)胞毒理實(shí)驗(yàn)中，對(duì)毒物毒性評(píng)價(jià)無法判斷是否是因?yàn)槎疚?br> 的脅迫對(duì)蚯蚓體腔細(xì)胞造成了損傷，還是因?yàn)椴僮鬟^程中，特別是提取蚯蚓體腔
細(xì)胞過程中已經(jīng)對(duì)細(xì)胞造成損傷。因此，保證離體體腔細(xì)胞的成活率是保證后期
細(xì)胞毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，盡量減少實(shí)驗(yàn)誤差的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。
以下實(shí)施例中，所用的Hank' s液、RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液分別如下
Hank' s液
磷酸二氫鉀 0.06g
氯化鈉 8.0g
碳酸氫鈉 0. 35g
氯化鉀 0. 4g
葡萄糖 l.Og
磷酸氫二鈉 0. 06g 加三蒸水H20至1000ml。然后高壓滅菌，4'C下保存。
RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液
RPMI-1640 104g
H印es 2.38g
丙酮酸鈉 0.1 lg
碳酸氫鈉 2. Og
葡萄糖 2.5g
用三蒸水定容到1000ml溶解后，用0. 22 p m孔徑的濾膜過濾除菌。分裝成 每瓶200-250ml， 4 。C保存，可用1個(gè)月左右。
實(shí)施例1
將平均體重為300mg具有環(huán)帶的健壯成體安德愛勝蚓(Eiseniaandrei)。清 腸24小時(shí)，用濃度為0. Olmol L—'、 pH7. 2的PBS緩沖液反復(fù)沖洗干凈蚯蚓，加 3mL含有2. 5mM乙二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA) PBS于10mL離心管，用 長(zhǎng)lcm，內(nèi)徑為0.5mm中空的纖維針細(xì)管插入蚯蚓體腔后放入離心管。迅速用頻 率為28KHz 、功率為300W的超聲波儀震蕩刺激蚯蚓1秒，可看到纖維針細(xì)管內(nèi) 液體迅速變黃色，將細(xì)胞移入50mL離心管然后加入12mL的Hank' s液清洗三次。
4 。C下離心20tnin，轉(zhuǎn)速為250g min—1，除去上清液，加入RPMI-1640細(xì)胞 培養(yǎng)液。臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)算細(xì)胞存活率。
將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上；將細(xì)胞懸液吸出少 許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間，靜置3min;鏡下觀察， 計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算細(xì) 胞數(shù)/ml二4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4X10000。
所得的細(xì)胞沉淀加入RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，取一滴細(xì)胞液于載玻片上，用 甲醛固定3min，瑞氏染液染色、鏡檢(10X40)。計(jì)算得單位體重細(xì)胞數(shù)為4.60±0.05 (106個(gè)/ g)，成活率(％)為 97. 51±0. 87。
實(shí)施例2
將平均體重為300mg具有環(huán)帶的健壯成體安德愛勝頓(Eiseniaandrei)。清 腸24小時(shí)，用濃度為O.Olmol L—'、 pH7. 2的PBS緩沖液反復(fù)沖洗干凈蚯蚓，加 3mL含有2. 5mM乙二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA) PBS于10mL離心管，用 長(zhǎng)lcm，內(nèi)徑為0.5mm中空的纖維針細(xì)管插入蚯蚓體腔后放入離心管。迅速用頻 率為28KHz 、功率為300W的超聲波儀震蕩刺激蚯蚓2秒，可看到纖維針細(xì)管內(nèi) 液體迅速變黃色，將細(xì)胞移入50mL離心管然后加入12mL的Hank， s液清洗三次。
4 。C下離心20min，轉(zhuǎn)速為250g min—、除去上清液，加入RPMI-1640細(xì)胞 培養(yǎng)液。臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)算細(xì)胞存活率。
將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上；將細(xì)胞懸液吸出少 許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間，靜置3min;鏡下觀察， 計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算細(xì) 胞數(shù)/ml二4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4X10000。
所得的細(xì)胞沉淀加入RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，取一滴細(xì)胞液于載玻片上，用 甲醛固定3min,瑞氏染液染色、鏡檢(10X40)。
計(jì)算得單位體重細(xì)胞數(shù)為6.057± 0 . 044 (106個(gè)/ g)，成活率(％)為 97. 25±0. 10。
權(quán)利要求
1.一種蚯蚓體腔細(xì)胞提取方法，其特征在于包括以下步驟第一步，蚯蚓清腸；第二步，將纖維針細(xì)管插入蚯蚓體腔；第三步，用超聲波儀震蕩刺激蚯蚓第四步，細(xì)胞記數(shù)和鏡檢。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蚯蚓體腔細(xì)胞提取方法，其特征是，所述蚯蚓為 安德愛勝蚓，預(yù)養(yǎng)一段時(shí)間，然后選擇具有環(huán)帶的健壯成體，平均體重在300mg 左右，蚯頓清腸24小時(shí)后，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗干凈蚯蚓，加入含有乙二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸的PBS。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的蚯蚓體腔細(xì)胞提取方法，其特征是，所述PBS緩 沖液濃度為O.Olmol lA pH7.2。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的蚯蚓體腔細(xì)胞提取方法，其特征是，所述加入含 有乙二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸的PBS，是指加入3mL含有2. 5mM乙二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸的PBS。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蚯蚓體腔細(xì)胞提取方法，其特征是，所述纖維針 選用長(zhǎng)lcm、內(nèi)徑為0.5mm中空的纖維針細(xì)管。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的蚯蚓體腔細(xì)胞提取方法，其特征是，所述超聲波 儀頻率為28KHz，功率為300W。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的蚯蚓體腔細(xì)胞提取方法，其特征是，所述超聲波 儀震蕩刺激蚯蚓的時(shí)間為1秒或2秒，目測(cè)溶液微黃后移去蚯蚓，用移液器收 集黃色細(xì)胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蚯蚓體腔細(xì)胞提取方法，其特征是，所述細(xì)胞記 數(shù)和鏡檢，是指加入12mL的Hank， s液清洗三次，4。C下離心20min，除去上 清液，加入RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)算細(xì)胞存活率。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蚯蚓體腔細(xì)胞提取方法，其特征是，所述離心， 其轉(zhuǎn)速為250g rain—全文摘要
一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的蚯蚓體腔細(xì)胞提取方法，包括以下步驟第一步，蚯蚓清腸；第二步，將纖維針細(xì)管插入蚯蚓體腔；第三步，用超聲波儀震蕩刺激蚯蚓第四步，細(xì)胞記數(shù)和鏡檢。本發(fā)明用纖維針結(jié)合超聲波刺激法提取的蚯蚓體腔細(xì)胞的技術(shù)，保證所提取的離體細(xì)胞的數(shù)量和成活率，為進(jìn)一步開展蚯蚓細(xì)胞毒理實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N5/06GK101343622SQ20081004248
公開日2009年1月14日 申請(qǐng)日期2008年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月4日
發(fā)明者江 朱, 陸貽通 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)