專利名稱：：Pnma5基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種基因，尤其涉及一種PNMA5基因的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肝癌是一種較為常見的惡性腫瘤。肝癌在我國惡性腫瘤死亡率中分別排第2和第3位，每年有約ll萬人死于肝癌，約占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%(FeitelsonMA，SunB,LiuJ，etal.Geneticmechanismsofh印atocarcinogenesis[J].Oncogene,2002，21(2):2593-2604)。因此，提高肝癌早期診斷水平、選擇科學(xué)合理的治療方法和采取有效的預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移措施將是改變這種局面的三個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前診斷原發(fā)性肝癌最重要的腫瘤標(biāo)志物是甲胎球蛋白(AFP)，但在我國原發(fā)性肝癌患者中，血清AFP水平高于正常值者只占60%70%;其中只有約32%的患者血清AFP水平能達(dá)到診斷標(biāo)準(zhǔn)(>400"g/L)，其余均為低濃度陽性。此外，部分肝炎、肝硬變等非肝癌患者的血清AFP水平也可異常升高。這些都影響了AFP這一指標(biāo)的診斷特異性。因此，有待開發(fā)新的特異性腫瘤標(biāo)記物，以提高原發(fā)性肝癌的診斷水平。此外，由于我國肝癌患者多合并嚴(yán)重的肝硬化，且易肝內(nèi)播散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，使手術(shù)切除受到很大限制，而且放化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對正常細(xì)胞和免疫系統(tǒng)也有破壞和抑制作用。因此，治療肝癌除了傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療方式外，還需要腫瘤治療疫苗的輔助治療。腫瘤-睪丸(cancer-testis,CT)基因表達(dá)的抗原可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和/或體液免疫，為腫瘤免疫治療的研究和應(yīng)用開辟了新的路徑。Scanlan等人根據(jù)RT-PCR結(jié)果將已知的CT基因分為4大類第l類為睪丸特異性表達(dá)基因；第2類是組織限制性表達(dá)基因，除睪丸、卵巢和胎盤外，僅在腦或胰腺或肝臟中表達(dá)；第3類屬組織差異性表達(dá)基因，除睪丸、卵巢和胎盤外，在其他3-6種組織中有共同表達(dá)；第4類為組織普遍性表達(dá)基因，在所有組織共同表達(dá)(MatthewJ.Scanlan,AndrewJ.G爭Simpson,andLloydJ.Old.Thecancer/testisgenes:Review,standardization,andcommentary.CancerI誦unity,2004,4(1),1-8)。因此，發(fā)現(xiàn)新的腫瘤相關(guān)CT基因，可促進(jìn)抗原特異性腫瘤疫苗的發(fā)展，為腫瘤免疫治療提供新的機(jī)遇(ELkeJ，Dirk丄Knuth3Alexander.Clinicalcancervaccinetrials.CurrOpinI腿unol，2002，14(2):178-182)。PNMA5基因,又叫KIAA1934基因，定位在X染色體上(NagaseT，KikunoR，Ohara0.Predictionofthecodingsequencesofunidentifiedhumangenes.XXI.Thecompletesequencesof60newcDNAclonesfrombrainwhichcodeforlargeproteins.DNARes.2001，8(4):179-187)。該基因全長為3194bp，編碼一個(gè)448個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，它與腫瘤-睪丸-腦抗原家族成員PNMAl、P醒A2及P麗A3有很高的同源性。有關(guān)PNMA5基因功能的研究非常少，目前，未見文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于PNMA5基因與肝癌的關(guān)系。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種PNMA5基因的應(yīng)用，該P(yáng)NMA5基因可作為肝癌診斷的標(biāo)記分子，提高了肝癌診斷的準(zhǔn)確性。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一種PNMA5基因在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用，使腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移得到有效控制。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種PNMA5基因在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述診斷肝癌的產(chǎn)品包括用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR或免疫檢測診斷肝癌的產(chǎn)叩o在本發(fā)明中，所述用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增PNMA5基因的引物。所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增PNMA5基因的引物。所述用免疫檢測診斷肝癌的產(chǎn)品包括與P國A5蛋白特異性結(jié)合的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對PNMA5蛋白特異的抗體。例如，將提純的人PNMA5基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動(dòng)物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人P麗A5蛋白或它的抗原片段的細(xì)胞也可以用來對動(dòng)物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜交瘤技術(shù)制備(例如，Kohleretal.，Nature256:495,1975;Kohleretal.，Eur.J.Immunol.6:511，1976;Kohleretal.,Eur.J.Immunol.6:292,1976)。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑PNMA5功能的抗體，也可以是不影響人PNMA5功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人PNMA5基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人PNMA5基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的PNMA5基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以利用在原核細(xì)胞例如￡co力'中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化P麗A5蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以利用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而得到。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種PNMA5基因在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。所述治療肝癌的藥物包括通過RNA干擾抑制PNMA5基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸，或基于PNMA5抗原蛋白的腫瘤疫苗，或用于抑制PNMA5蛋白活性的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，所述RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。以細(xì)胞為基礎(chǔ)的RNAi篩選在功能基因?qū)W研究方面具有許多優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在大多數(shù)細(xì)胞類型都能使用RNAi方法，并且相對較容易下調(diào)或沉默任何目的基因的表達(dá)。在本發(fā)明中，所述腫瘤疫苗是指用腫瘤組織中的特殊物質(zhì)來激發(fā)患者體內(nèi)的免疫功能，使患者的免疫功能能夠殺傷腫瘤細(xì)胞。腫瘤疫苗主要指治療性疫苗，是在病人得病后再用疫苗的方法進(jìn)行治療，以控制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。腫瘤疫苗具有個(gè)體性，因?yàn)槊恳粋€(gè)病人所得的腫瘤類型、分期都不一樣，腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的物質(zhì)也不同，而腫瘤疫苗又是由病人本身的腫瘤制成，因此針對患者具體的腫瘤制備的腫瘤疫苗具有個(gè)體化特征，其副作用小，針對性強(qiáng)。所述腫瘤疫苗制備時(shí)，用手術(shù)方法切取腫瘤患者的腫瘤組織并無菌冷凍保存，以提取腫瘤抗原。本發(fā)明的PNMA5抗原蛋白可作為腫瘤抗原被提取。獲得腫瘤抗原是第一步，接著要獲得樹突狀細(xì)胞，即從病人血液的單個(gè)核細(xì)胞中獲得。采出單個(gè)核細(xì)胞后再進(jìn)行篩選和體外培養(yǎng)，然后用腫瘤抗原PNMA5在體外刺激樹突狀細(xì)胞，使該樹突狀細(xì)胞能夠傳遞免疫信息，最后將訓(xùn)練好的樹突狀細(xì)胞回輸?shù)襟w內(nèi)，使體內(nèi)產(chǎn)生針對腫瘤抗原P麗A5的免疫應(yīng)答。本發(fā)明治療肝癌的藥物施用方式可以是口服、全身施用(例如，透過皮膚、鼻吸入或者用栓劑)或腸胃外施用(例如，肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)。本發(fā)明的藥物也可被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明PNMA5基因在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，因此PNMA5基因可作為診斷肝癌的特異標(biāo)志基因，使肝癌診斷更加準(zhǔn)確、快速。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)還證明沉默PNMA5基因的表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞生長，因此P醒A5基因?yàn)榉乐胃伟┨峁┝诵碌闹委煱悬c(diǎn)和有效新藥。圖1是本發(fā)明通過RT-PCR檢測PNMA5基因在人類正常組織中的表達(dá)圖；圖2是本發(fā)明通過RT-PCR檢測PNMA5基因在人肝癌組織和癌旁組織中的差異表達(dá)圖3是本發(fā)明通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測PNMA5基因在人肝癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)的箱線圖4是本發(fā)明利用RT-PCR檢測PNMA5基因在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)圖5是本發(fā)明利用RT-PCR和熒光定量PCR檢測siRNAs沉默F(xiàn)ocus和PLC細(xì)胞中PNMA5基因表達(dá)的結(jié)果圖6是本發(fā)明Focus和PLC細(xì)胞在轉(zhuǎn)染siRNA-NC、siRNA-l和siRNA-2后的生長曲線圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測PNMA5基因在人類正常組織及肝癌組織中的表達(dá)情況。1.組織分離(Tissueisolation)本發(fā)明所用肝癌及癌旁組織均來自臨床肝癌的手術(shù)病人。手術(shù)切除的肝癌組織一經(jīng)離體，迅速切取病灶及周圍5公分以外正常組織，并放入液氮中保存。癌和癌旁的診斷均以病理診斷為最終依據(jù)。15種人體正常組織(腦、心、肺、脾、腎、胃、食管、小腸、卵巢、乳腺、前列腺、胰腺、肝、胎肝及睪丸)RNA均購自Clontech公司。逆轉(zhuǎn)錄酶為M-MLVReverseTranscriptase,PromegaCO.。PCR試齊!jTaqDNA聚合酶、dNTP等均為大連寶生物技術(shù)有限公司。P麗A5基因(GeneID:114824)的引物是Forward:5，-AAGCCAGTGTCTCTGCACCT-3，(SEQIDN0:1)、Reverse:5'-CTTGATCTCGACCTGGCTTC-3，(SEQIDN0:2)，PCR產(chǎn)物長度為400bp。作為內(nèi)對照的p-actin引物是Forward:5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3'(SEQIDN0:3)、Reverse:5'-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3'(SEQIDNO:4);p-actin擴(kuò)增片斷長度為400bp。2.總RNA的抽提試劑盒抽提RNA試劑采用TRIzolreagent(GIBC0/BRL)，該試劑是基于酸性酚一步抽提法生產(chǎn)的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要進(jìn)行無RNA酶處理，以保證實(shí)驗(yàn)中無RNA酶的環(huán)境。3.RNA的抽提步驟將碾杵和勻漿器等器皿在20(TC干烤4h，去除RNA酶，冷卻；加入液氮中預(yù)冷，將組織從液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙將組織放入預(yù)先加入TRIzol試劑的勻槳器中，勻漿數(shù)分鐘；將勻漿后的液體轉(zhuǎn)入無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4°C離心分層；將上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4。C離心分層；將上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶的離心管中，加異丙醇，4t:離心沉淀RNA;用75%乙醇洗滌沉淀2次；用無RNA酶的去離子水溶解沉淀。抽提的RNA質(zhì)量鑒定紫外分光光度計(jì)測定260/280比值(比值均在1.72.0);并在MOPS甲醛變性膠中觀察有無降解，本發(fā)明所用RNA均無降解。為了去除基因組DNA的污染，全部RNA均用無RNA酶的DNA酶I(美國Ambion公司)消化。4.cDNA的合成取總RNA2Pg，隨機(jī)引物1^1，70。C保溫3min，立即冰上變性5min。加入5Xbuffer,DTT和0.05g*L—1的dNTP各2W及1W的逆轉(zhuǎn)錄酶，充分混勻后，42°C2h。模板使用終濃度通常為0.01gL—'。5.半定量RT-PCR7以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增P麗A5基因，同時(shí)以P-actin作為模板量的對照。PCR條件為94。C預(yù)變性3min;94。C變性30s，57。C退火30s，72。C延伸40s，共35循環(huán)(e-actin為25循環(huán))；72。C延伸5min。用2%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物。6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PNMA5基因僅在睪丸、卵巢和大腦組織中表達(dá)，其它組織中未見表達(dá)(見圖1)。利用半定量RT-PCR方法檢測PNMA5基因在12對人類肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PNMA5基因在5(42%)例肝癌中明顯上調(diào)，陽性結(jié)果(見圖2)。在圖2中，"N"指癌旁組織，"C"指肝癌組織。7.根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可通過RT-PCR診斷肝癌設(shè)計(jì)PNMA5基因的PCR引物，檢測腫瘤組織中PNMA5基因RNA的含量，RNA含量高則說明患肝癌的可能性高，反之則低。實(shí)施例2實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)使用TaKaRa生物公司的新型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ThermalCyclerDiceDetectionSystem,日本)，檢測PNMA5基因在上述12對人類肝癌組織及其對應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)。反應(yīng)體系如下總體積20ul，SYBRPremixEXTaq10ul，引物(10uM)各0.4ul，DNA2ul，ddH207.2ul，上下顛倒混勻試劑，離心后放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。儀器使用按廠家的說明操作。(3-Actin被用來當(dāng)作內(nèi)對照。所述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次以確保結(jié)果的可靠性。肝癌和癌旁組織中的PNMA5基因的表達(dá)水平按以下方法進(jìn)行計(jì)算PNMA5ACt=平均PNMA5_Ct-平均(3-actinJ]t，PNMA5A△Ct=PNMA5ACt—癌組織-PNMA5ACt一癌旁組織，癌和癌旁組織中的PNMA5基因的倍數(shù)關(guān)系用2—PNMA5AA"來計(jì)算。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)(x2檢驗(yàn))，P〈0.01定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示，PNMA5基因在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，大于2倍的有7例(58%，P〈0.01)，其中大于4倍以上的有3例，因此，PNMA5基因在肝癌組和癌旁組中的表達(dá)有明顯差異(見圖3和表1)。在圖3中，"*"代表口<0.01，方框內(nèi)橫線代表每組檢測值A(chǔ)Ct的中值，方框外的上下短線分別代表檢測值中的最高值和最低值。本發(fā)明熒光定量PCR檢測的陽性率高于上述普通RT-PCR的結(jié)果，這可能與熒光定量PCR的高靈敏度有關(guān)。8表lPNMA5基因在12對肝癌樣本中的表達(dá)分析<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，可通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR診斷肝癌設(shè)計(jì)PNMA5基因的PCR引物，檢測肝癌組織中PNMA5基因RNA的含量，RNA含量高則說明患肝癌的可能性高，反之則低。實(shí)施例3免疫檢測1.抗原蛋白獲得(1)利用基因工程表達(dá)可從Genbank數(shù)據(jù)庫中獲得人P醒A5基因的cDNA序列，通過PCR擴(kuò)增獲得編碼框，插入原核生物或真核生物表達(dá)載體中，表達(dá)PNMA5蛋白，并按基因工程表達(dá)產(chǎn)物的純化體系純化蛋白質(zhì)。(2)通過培養(yǎng)高表達(dá)PNMA5基因的人體來源細(xì)胞或組織，再分離純化PNMA5蛋白。2.抗體制備可采用以下幾種方法制備抗體(1)細(xì)胞融合法用上述制備的PNMA5蛋白免疫動(dòng)物(包括兔子、山羊等)，獲得脾臟細(xì)胞，再與骨髓瘤細(xì)胞融合，并按常規(guī)單克隆抗體制備技術(shù)制備單克隆抗體。(2)利用噬菌體表面展示庫，克隆免疫動(dòng)物的脾臟IgG可變區(qū)并表達(dá)成基因工程單克隆抗體。(3)利用純化的蛋白質(zhì)免疫動(dòng)物，制備多抗血清。3.檢測(1)用制備的抗體(多抗或單抗)，用組織化學(xué)方法進(jìn)行肝癌的病理檢測，陽性信號為肝癌。(2)取患者血清，用ELISA方法檢測，陽性反應(yīng)為肝癌可疑病人。(3)將PNMA5抗體作為蛋白質(zhì)芯片的探針之一，用于多種腫瘤診斷。實(shí)施例4肝癌細(xì)胞株模型的選擇為了尋找深入研究P醒A5基因功能的細(xì)胞模型，利用半定量的RT-PCR技術(shù)，檢測PNMA5基因在5個(gè)常見的人類肝癌細(xì)胞(BEL7405、SMMC7721、PLC、YY8103和Focus)中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)P麗A5基因在Focus和PLC中高表達(dá)，在BEL7405、SMMC7721和YY8103細(xì)胞僅有較弱的表達(dá)(見圖4)。因此，選擇Focus和PLC作為進(jìn)一步研究PNMA5基因的細(xì)胞模型。肝癌細(xì)胞株Focus、PLC由本實(shí)驗(yàn)室保種，復(fù)蘇后在含10%胎牛血清、200單位/毫升青霉素、200皮克/毫升鏈霉素的DMEM(GIBC0)培液中，5%C02、37。C條件下培養(yǎng)，以用于siRNA轉(zhuǎn)染。實(shí)施例5基于肝癌細(xì)胞株P(guān)LC、Focus對PNMA5基因進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)為了研究RNA干擾對PNMA5基因的瞬間沉默作用，首先針對PNMA5基因的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)并化學(xué)合成2條特異性siRNA片段(siRNA-l、siRNA-2)，同時(shí)合成1條與人類無同源性的無關(guān)siRNA作為陰性對照(siRNA-NC)，詳細(xì)序列見表2。將該些siRNA片段分別瞬間轉(zhuǎn)染Focus和PLC細(xì)胞，培養(yǎng)5d后收集細(xì)胞，利用RT-PCR和熒光定量PCR技術(shù)分析PNMA5基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組(siRNA-NC)相比，轉(zhuǎn)染siRNA-l和siRNA-2的Focus和PLC細(xì)胞中PNMA5基因均被明顯下調(diào)(見圖5A，5B，5C，5D)。在圖5中，A和C分別為RT-PCR檢測siRNAs沉默F(xiàn)ocus和PLC細(xì)胞中PNMA5基因的表達(dá)，B和D分別為熒光定量PCR檢測siRNAs沉默F(xiàn)ocus和PLC細(xì)胞中PNMA5基因的表達(dá)。表2特異性RNA干擾片段的序列siRNA名稱序列(5'-3')UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT(SEQIDNO:5)ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT(SEQIDN0:6)GCCCAGGCGAAGAGACCUUUGdTdT(SEQIDNO:7)CAAAGGUCUCUUCGCCUGGGCdTdT(SEQIDNO:8)GGGCCGAAGUAUGACAGAUdTdT(SEQIDNO:9)AUCUGUCAUACUUCGGCCCdTdT(SEQIDNO:10)實(shí)施例6轉(zhuǎn)染PNMA5基因特異性siRNA后的細(xì)胞增殖分析為了研究上述3種siRNAs對Focus和PLC細(xì)胞生長的影響，利用CCK-8(cellcountingkit-8,細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒，Dojindo)的技術(shù)分別檢測轉(zhuǎn)染siRNAs三天后，細(xì)胞生長曲線的變化。siRNA-NCRsiRNA-1FRsiRNA-2FR10在96孔板中每孔接種3X103肝癌細(xì)胞(無血清培養(yǎng)液)，待細(xì)胞密度達(dá)到40%左右時(shí)，利用Lipofectamine2000(Invotrogen)轉(zhuǎn)染試劑分別將上述3種siRNA按終濃度50nmol/L(0.25^)的量轉(zhuǎn)染進(jìn)肝癌細(xì)胞中，4h后換成含10X胎牛血清的DMEM。以24h為一個(gè)檢測單位培養(yǎng)5天，每天檢測l次該細(xì)胞密度。每孔待測細(xì)胞液中加10ACCK-8，37。C孵育lh。利用酶標(biāo)儀(Bio-Tek,MQX200)在450nm波長下檢測其吸光度以代表細(xì)胞存活能力，繪制生長曲線。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。結(jié)果顯示，與對照組(siRNA-NC)相比較，轉(zhuǎn)染siRNA-1和siRNA-2后Focus和PLC細(xì)胞的生長均受到明顯抑制，p<0.05(見圖6A和6B)。在圖6中，A為Focus細(xì)胞的生長曲線圖，B為PLC細(xì)胞的生長曲線圖。該結(jié)果表明，沉默PNMA5基因的表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的生長增殖水平。實(shí)施例7PNMA5抗原蛋白作為腫瘤疫苗的應(yīng)用1.原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本在術(shù)中取材，術(shù)后均經(jīng)病理診斷確證。采用美國PEL-FREEZA-SSPUNITRAY試劑盒對肝癌組織DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，根據(jù)電泳結(jié)果對細(xì)胞株HLA-A位點(diǎn)分型。2.總RNA的提取和cDNA的合成利用Trizol試劑(GibcoBRL公司)提取肝癌組織總RNA，溶于適量焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的超純水中并定量。取5!igRNA標(biāo)本，用逆轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptII合成cDNA。3.抗原基因cDNA的PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體積為50ul。其中含2ulcDNA、25pmo1CT抗原基因PNMA5的引物。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。4.PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測序參照《分子克隆》(第3版)的方法。5.DC(樹突狀細(xì)胞)的體外分離和培養(yǎng)患者外周靜脈血經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液Ficoll梯度離心后分離界面單個(gè)核細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)洗滌2次后，用無血清培養(yǎng)基AIM—V培養(yǎng)液(GibcoBRL公司)懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度到3X106個(gè)/ml，接種入6孔培養(yǎng)板。在37°C、5%0)2孵箱中培養(yǎng)過夜后，輕輕吹打懸浮細(xì)胞并回收凍存，用以制備效應(yīng)細(xì)胞。在貼壁細(xì)胞培養(yǎng)液中加入含1000U/ml粒單集落刺激因子和500U/ml白細(xì)胞介素的AIM-V。培養(yǎng)至第7天時(shí)，收獲懸浮的DC。6.多肽合成PNMA5抗原多肽由多肽合成儀合成。T2細(xì)胞或HLA-A2的EBV(EpsteinBarrVirus,非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒)轉(zhuǎn)染的人B淋巴細(xì)胞與終濃度為20ug/ml的PNMA5抗原多肽共孵育4小時(shí)，洗滌后作為靶細(xì)胞。7.通過以下方式鑒定本發(fā)明治療肝癌的腫瘤CT抗原疫苗，通過DC遞呈PNMA5抗原肽活化效應(yīng)T細(xì)胞，產(chǎn)生特異性針對PNMA5抗原表位的免疫應(yīng)答(1)DC膜標(biāo)志的鑒定用熒光標(biāo)記抗體，HLA-DR(購自Pharmingen公司)檢測，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型。(2)DC細(xì)胞的處理DC經(jīng)離心后重懸浮在2mlAIM-V中，并加入PNMA5抗原肽至該多肽終濃度為40ug/ml。37°C、5%0)2培養(yǎng)18小時(shí)，經(jīng)3000rad放射線照射后，洗滌待用。(3)效應(yīng)細(xì)胞的制備非貼壁細(xì)胞復(fù)蘇后，與照射后的DC細(xì)胞以20:1混合共孵育6-7天，再按照相同比例加入DC，6-7天后，再次重復(fù)刺激一次，作為效應(yīng)T細(xì)胞。于0、7、10、14、19天，分別留取培養(yǎng)上清，用于細(xì)胞因子檢測。(4)細(xì)胞因子檢測采用細(xì)胞因子檢測試劑盒(購自美國Endogen公司)檢測培養(yǎng)上清中分泌的細(xì)胞因子。8.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)本發(fā)明PNMA5抗原肽刺激的DC所活化的效應(yīng)T細(xì)胞，能產(chǎn)生特異性針對PNMA5抗原表位的免疫應(yīng)答，從而特異性殺傷結(jié)合有該相同PNMA5抗原肽的靶細(xì)胞，說明本發(fā)明PNMA5抗原蛋白可以作為潛在的肝癌治療性疫苗。實(shí)施例8以PN區(qū)5基因表達(dá)產(chǎn)物為靶分子設(shè)計(jì)的基因治療以PNMA5基因表達(dá)產(chǎn)物為靶分子，設(shè)計(jì)一種攜帶某基因的表達(dá)載體，導(dǎo)入該載體，其產(chǎn)物對PNMA5基因的表達(dá)有抑制作用，或?qū)NMA5蛋白活性有抑制作用。12<110>上海人類基因組研究中心〈120〉PNMA5基因的應(yīng)用〈130〉NP-08-12215〈160〉10<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc—feature〈222〉(1)..(20)〈223〉引物<400〉1aagccagtgtctctgcacct〈210〉2〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220>〈221>misc_feature〈222〉(l)..咖<223>引物〈400〉2cttgatctcgacctggcttc<210>3〈211〉25<212>腿〈213〉人工序列<220><221>misc—feature〈222〉(1)..(25)〈223〉引物序歹!j表202013<400〉3tcacccacactgtgcccatctacga25〈210〉4<211>25〈212〉廳〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc—feature<222〉(l)..咖〈223>引物〈400〉4cagcggaaccgctcattgccaatgg25〈210〉〈211〉〈212>〈213>〈220〉〈221〉<222〉〈223〉521RNA人工序列misc—腿(l)..(21)siRNA<400>5uucuccgaacgugucacgutt21〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉<220〉<221><222〉〈223〉621RNA人工序列misc—RNA(l)..(21)siRNA〈400〉6acgugacacguucggagaatt21/〈210〉7<211〉23<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>權(quán)利要求1.一種PNMA5基因的應(yīng)用，其特征在于，所述PNMA5基因在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述診斷肝癌的產(chǎn)品包括:用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR或免疫檢測診斷肝癌的產(chǎn)品。3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增PNMA5基因的引物。4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增PNMA5基因的引物。5.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用免疫檢測診斷肝癌的產(chǎn)品包括與PNMA5蛋白特異性結(jié)合的抗體。6.—種PNMA5基因的應(yīng)用，其特征在于，所述PNMA5基因在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述治療肝癌的藥物包括通過RNA干擾抑制PNMA5基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸，或基于PNMA5抗原蛋白的腫瘤疫苗，或用于抑制PNMA5蛋白活性的蛋白質(zhì)。全文摘要本發(fā)明公開了一種PNMA5基因的應(yīng)用，用于制備診斷肝癌的產(chǎn)品和制備治療肝癌的藥物。本發(fā)明的PNMA5基因，可作為診斷肝癌的特異標(biāo)志基因，使肝癌診斷更加準(zhǔn)確、快速，且為防治肝癌提供了新的治療靶點(diǎn)和有效新藥。文檔編號C12Q1/68GK101497922SQ20081004310公開日2009年8月5日申請日期2008年2月2日優(yōu)先權(quán)日2008年2月2日發(fā)明者滕小梅,韓澤廣,健黃申請人:上海人類基因組研究中心