專利名稱：：日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白基因、其編碼蛋白及應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種肌聯(lián)蛋白，特別是涉及一種日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白基因、其編碼蛋白及應用。
背景技術：
：血吸蟲病由血吸蟲的感染引起，在世界上有76個國家，受感染者約1.5億。致病的血吸蟲有3種，g先日本血吸蟲(Schistosomaj即onicum)，曼氏血吸蟲(S.mansoni)和埃及血吸蟲(S.haematobium)。在我國流行的是日本血吸蟲。血吸蟲病的流行給人民身體健康和經(jīng)濟發(fā)展都造成巨大的損失，因此，防治血吸蟲病、開發(fā)研制血吸蟲臨床診斷試劑和抗血吸蟲的藥物具有巨大的社會和經(jīng)濟效益。日本血吸蟲作為寄生蟲能在人體和動物體內(nèi)存在很多年而不被宿主的免疫機制殺死，與它的免疫逃避能力有關。其免疫逃避機制有抗原模擬、抗原偽裝和免疫調(diào)節(jié)。其中免疫調(diào)節(jié)指的是血吸蟲的蛋白能夠調(diào)節(jié)、干擾(主要是抑制)宿主的免疫系統(tǒng)，使其不能發(fā)揮正常的免疫攻擊效能，從而有利于血吸蟲的生存。血吸蟲的排泄/分泌抗原(Excretory/Secretoryprotein,ESP)就是一類可以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)。這些蛋白來自血吸蟲的表皮和腸道上皮，或者是特化的排泄/分泌器官。血吸蟲各個蟲期都產(chǎn)生這類蛋白。ESP是潛在藥物靶點和疫苗分子，因為抑制這些蛋白可以干擾血吸蟲的免疫逃避機制從而增強宿主的免疫殺滅功能；ESP是潛在的診斷分子，因為這些蛋白游離于宿主的血液中，可以很方便地用現(xiàn)有手段檢測。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白基因、其編碼蛋白及應用，該蛋白可以成為血吸蟲臨床診斷的靶標分子。為解決上述技術問題，本發(fā)明的日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白的基因，包括具有SEQIDN0.l所示的核苷酸序列。所述的SEQIDNO.1所示的核苷酸序列編碼具有SEQIDNO.2所示序列的蛋白。本發(fā)明的日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白，包括具有SEQIDN0.2所示氨基酸序列的蛋白、或由該蛋白發(fā)生一個或多個氨基酸的置換、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白，該蛋白是具有SEQIDNO.l序列編碼的蛋白。利用蛋白質(zhì)組學手段，我們在國際上首次分析了日本血吸蟲的體外提取的ESP的組成成分。我們發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲的肌聯(lián)蛋白(Titin)是其ESP的主要成分之一，表明該蛋白可能在血吸蟲的免疫調(diào)節(jié)、免疫逃避方面發(fā)揮重要作用；同時，通過直接分析感染動物(兔子)的血液，發(fā)現(xiàn)該蛋白的確在宿主血液中也存在，這也使它成為很好的診斷標記分子。本發(fā)明的日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白作為免疫原，在制備血吸蟲疫苗方面的應用；作為潛在的藥物作用靶點，在篩選化學和其他種類藥物方面的應用；作為特異性血吸蟲抗原，在制備抗血吸蟲抗體方面的應用；在血清學診斷方面的應用；日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白的編碼基因，在基因治療方面的應用。具體實施方式—、方法1、日本血吸蟲排泌蛋白的分離和鑒定實驗1).日本血吸蟲成蟲排泌產(chǎn)物的制備和蛋白提取日本血吸蟲成蟲從感染動物體內(nèi)分離出來后用1XPBS(磷酸鹽緩沖液)洗2次，大約800條成蟲用lmlPBS懸浮，10分鐘后低速離心(500rpm)把上清吸出收集，重復10編，把上清合并。用丙酮沉淀上清中的蛋白，溶解沉淀用50mMTris-HCl(pH8.3)，5mMEDTA，lmMphenylmethylsulfonylfluoride(PMSF)，0.5%sodiumdodecylsulfate(SDS)and0.5mMDTT，O.5%SDS，超聲促溶。2).日本血吸蟲排泌蛋白的酶解過程排泌蛋白混合物用lOmMDTT和55mM的碘乙酰氨處理，稀釋后用胰酶酶解過夜。3).日本血吸蟲排泌蛋白酶解肽段的在線色譜分離和質(zhì)譜鑒定酶解產(chǎn)生的肽混合物，用真空將溶液體積抽減到30iU。之后，每個組分的肽混合物上樣到一個反相捕獲柱(C18，5iim，300A，300iimi.dX5mm，LCPackings)，在20iU/min的流速下脫鹽。然后這個捕獲柱和一個分析用的75iimX150mmC18柱(LCPackings)相連接，肽混合物就在200nl/min的流速下，從這個柱子上洗脫進入裝有ProtanaNanoES的電噴霧離子源的QSTARpulseri中。Agilent1100毛細液相系統(tǒng)(AgilentTechnologies)用來提供流動相A(O.5%乙酸/水)和流動相B(0.5%乙酸/乙腈)，線性梯度是60分鐘內(nèi)5%B到50%B，30分鐘內(nèi)50%B到90%B，然后是在90%B停留15分鐘。在分析柱后通過一個不銹鋼的兩通(ValcoInstrument)連接一個10-ym直徑的PicoTip納噴霧頭(NewObjective)，加上2500-3000伏的噴霧電壓，以獲得穩(wěn)定的噴霧。MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜譜圖通過信息依賴的采集(IDA)和任務-循環(huán)增強來記錄。在每個測定掃描中，選取3-6個信號最強、帶2到3個電荷的離子，用滾動碰撞能量打碎，以獲得串聯(lián)質(zhì)譜的信息。4).日本血吸蟲排泌蛋白的軟件搜索鑒定質(zhì)譜搜索用的數(shù)據(jù)庫，包括從11717個從公共數(shù)據(jù)庫NCBI下載的日本血吸蟲蛋白質(zhì)序列(時間是2008年10月16日)。搜索軟件是MASCOT(http:〃www.matrixscience.com/，MatrixScience)。搜索參數(shù)為最大漏切點，3個；monoisotopic;肽電荷數(shù)，+1/+2/+3;修飾，半胱氨酸carbamoylmethylation禾口methionine氧化。搜索結果合并后，用下列標準進行過濾篩選1.對每一個串聯(lián)質(zhì)譜譜圖的搜索結果列表，只提取排位在第一個的結果，其他的則丟棄；2.搜索得到的肽段中如果有KR，KK，RK，RR等序列，則這個肽段丟棄；3.搜索得到的肽段，長度在8個氨基酸以上的保留，小于8個氨基酸的丟棄；4.重復打到的肽段，只計算其中分值最高的，把這些肽段分值加起來，做為蛋白的得分；5.蛋白的得分超過60，就認為是可信的結果。低分的蛋白，手工檢查后保留或者丟棄。匹配到宿主或者牛胰酶、角蛋白的肽段，則丟棄。同時進行反向蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫的搜索。反向蛋白庫是將日本血吸蟲蛋白質(zhì)序列反轉(zhuǎn)，保持長度、組成不變。根據(jù)正向庫和反向庫搜索得到的結果，確定假陽性率。計算方法<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>假陽性控制在0%。2、從感染動物血清中直接分析日本血吸蟲的排泌蛋白1.日本血吸蟲尾蚴感染兔子，收集感染后第42天的動物血清。血清蛋白酶解后用液相色譜-質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)組成。質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜索日本血吸蟲的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，按照上述標準篩選肽段。得到的肽段用Blast搜索兔子的基因/蛋白數(shù)據(jù)庫(包括mRNA，EST，基因組測序數(shù)據(jù)等)，去掉任何匹配的肽段，保證保留下來的肽段都是血吸蟲特有的。然后利用肽段，搜索得到相應的血吸蟲蛋白序列。2.蛋白豐度定量分析計算每個蛋白鑒定得到的質(zhì)譜圖總數(shù)(Spectracount,SC)，以此代表豐度高低。二、結果1)日本血吸蟲體外排泌蛋白的蛋白質(zhì)組學鑒定結果共鑒定出110個血吸蟲蛋白。其中肌聯(lián)蛋白是豐度比較高的蛋白之一，SC總數(shù)是32，肽段得分總和為1736，共鑒定到該蛋白的5種肽段(表l)。這說明，肌聯(lián)蛋白是日本血吸蟲成蟲排泌產(chǎn)物中的主要的蛋白成分之一。成蟲在宿主(如人)體內(nèi)，其排泌產(chǎn)物必然釋放到宿主的血液循環(huán)體系中，因此，檢測血吸蟲排泌產(chǎn)物的存在，就可以檢測血吸蟲感染。而排泌產(chǎn)物中豐度高的蛋白，最容易被檢出，因此，肌聯(lián)蛋白是合適的臨床診斷分子，可以利用現(xiàn)有的普及的方法如ELISA來很方便地檢測患者血樣中的血吸蟲特征蛋白。表1日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白的在體外排泌蛋白組中的質(zhì)譜鑒定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2)我們在國際上首次從被感染的動物血清中直接鑒定日本血吸蟲的排泌蛋白。鑒定到肌聯(lián)蛋白的1種肽段(表2)，證明了日本血吸蟲的肌聯(lián)蛋白的確存在于宿主動物的血清中，可以被檢測到，因而可以成為血吸蟲臨床診斷的靶標分子。表2日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白在感染動物血清中的鑒定結果<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>序列表〈110〉上海人類基因組研究中心〈120〉日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白基因、其編碼蛋白及應用〈130>NP-08-12792〈160>2〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>3325〈212>RNA〈213〉日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)〈400〉1cctttttegttgaggtttettggteateatateatgtc皿60ctgtegctetgccagcaactgtttttcaagcatctectcctggaaatcctccacaaattt120teagtccattatgtggtggcggtg皿gttcC3g皿gg3g3acctgttcatttegaattec180gaattgatcctccaggtgatttgcaggtec卿tggtgttgcatteagtg240caggttctcgttecaatectatgtgtg皿cgtggtttegcctcattggatgteatetete300C皿tCC3gg3卿ragtggtacctetttttgtgtgatetcgaatccatetggacatgctc360agttcctgtgaatgttetecctga^ttgagatcattteg420atgcacaatttgctgatctectegtgcacctetg皿cgtg■tC3gCC皿3gagtgcaccacaattttctcagc皿ccggtgattegtegte540gtgatgttcttg皿ggtg皿cctgtgag皿ctteaatecg6003gttgattggg3C皿CC3gttggt織ggaagtcgtttte660acgccatccttgat卿ggtttegttgtcctgg腿ttggttettgtctggtcgatgate720gtggattgtetgtttgtgtegcteca皿tgcacttggacgC3C3g3g3gCcaacctgtgg780皿cteagatgCC皿CC3g皿g皿cg皿ttgttectecctctetcctggat840g3gg皿CC3ggag皿gatttcgatcategtgcc皿tgc皿■tetetccccatctttcaaggccaatttegaacctgctecggttcaagtte960acctgteattttctccgteccggttgactgtgg腿tggagatracgtgg1020ttattgagtgg^acgtgatggtcaggttgttea朋caggatctcgaatcactgg皿gtt1080t卿gcttgg皿tegccagcattetgcccagccg皿tgat1140acacttgtcatatttctecag皿tetggatcagctgactgtggtccatcc1200gtg皿gctectggtegteteatcgctgcaagccaacttccg皿朋aggtc1260tectegcgattg皿gcgateg皿gcg皿tttgcatgcacc3cgcggtecagtetggg皿g1320cctgttattettcaacaaccacaatctgttggtg腿ttg13803gg皿gg皿Cagccattcattttgatgttcaggteg皿cccgcttctgatccttcactte1440ttgttgaatgggcaatttetteac朋gtgg1500atgat卿ggattegccactctegatattttgtetactettcctgaagat3gCggtg皿t1560attggtgccgtgtegag皿t朋agctggtcteatcatgtecaagttttet1620gteacgccagtgcgtctgtegteatctttt3c皿ggtecagagggctera1680agctettg皿g皿gttg皿c卿ttgacggagatg^tet17403gg3Cg朋g3ggttgattcagctcctcattttgatgtcaagcctcaagcagctecteteg1800gtg皿ggttccccagtteaatttttegtecgtgttegtggccacagctta1860cttggtetctc皿tgacg皿ccaattgaac皿gattcgattetegtgatg1920gtgc朋te朋ttecttagaaatgagtcgttgccatgctttac朋gg朋ct朋t朋gctec1980atgttettgcttegg朋皿gctgaagctgaaacggttcttacagttgtet2040tggCgg3卿tttcagaccgatgtte朋ccag朋朋tccttec朋3朋ga2100tggttggattacgte朋gtegactgttcaccag朋tte朋te朋gcgtteacgag朋cte2160aaccgtctgcttega朋tgg3朋gaggttctga朋tg朋3gctcgtectt2220atcgttcacc卿ggtegtcaaatgttggatcaacttgcttcgagtttea2280g朋朋tctgaactte朋cgaccattggteaatggtegcc3tc朋朋tgatgc3gcateac2340ctattcacattgcattactettcatactteaatcaaatetctecttgatt2400attctetttcccaatgtttetttectgaacaaacaatteaacttttgtgcttccaaatet2460gattete皿cate皿tgatg3朋tetc朋3catt朋ttgttttettetca2520catgtttacatttetettctttgctttteaatgaaatttetcagtttctetcattteatc2580aategtttctcttetttcagaacatttettteaatgatgatetetgactt2640tga朋te朋ttttettattcattectgaat朋tec朋tggteatgatg朋tgcattcatt2700acttgteatctgatccgatecttttctttettcttagaattctttggttgcttetettca2760gtcaattacatttgtttgtttatgtgtegtttttgtttcttgattteaaaaaaaatgttt2820attecttaccgatga朋tteattcagtectactettettetga朋tg朋3attg朋tcte2880tecttcatetcte朋tgateattc朋3cc3tttgtg朋te2940actg朋tg朋tttteatgacaatetttetgttettecaat3000gttetcccccattttetggatattgcattettteaaatgttcaatttetgctgttetett3060gtttettteacagttcaccttteaatctecttttettcatg朋g朋朋朋c朋朋g朋ga3120teg朋tecattatcatcagtaaatcatttettgaatetgtatcactggtt3180acaatgattcgatcataattaagcattcteaatgtgttegggattctttc3240tettetettctgteacagteteaggctetcatec朋3gtetetecttgte3300ttattatgaa3325〈210>2〈211>761〈212>PRT〈213>日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)〈400>2MSTVAMPATVFQASTPGNPPQILSPLCGGGEVPEGEPVHLELRIDPPGDLQVQWFKDGVA60LSAGSRYNTMCERGLASLDVIYTIQEDSGTYFCVISNPYGHAQSEAVPVNVIPEIDPNQD120HLDAQFADLYQATSAPIKEYERDQRSQPKSAPQFSQQPVISSSDVLEGEPVRMEAYLNTT180GDSTLQVD麗KNGQPVGTGSRFNAILDRGLVVLEIGYCLVDDSGLYVCVATNALGRTESQ240PVELRCQPEERIVTTSILDQQSINHL緣EEPGEDFDHSANATIQGISPSF薩LEPATV300QV腳EPVIFSVPVDCGNGDHVVIEWKRDGQVVKTGSRITGSLELGIASLKIHYAQP麗360GAYTCHISTEYGSADCGPSNLLCEATGSIIMSQLPGDKEKGLLAIEAIEANLHAPRGTV420WEDESPHEAPVIIQQPQSVGEIEEGTAIHFDVQVEPASDPSLIVEWFKSGNLLTSGTRFK■VAYDRGLATLDILYTIPEDSGEYWCRVENKAGQMESNHVQVLCNASASVITHSNLLQGTE540GYNLIKAIEEVEQIDGDEYRYIEDEEVDSAPHFDVKPQMTIGEGSPVKFLVRVSGKPTP600QLTWYLNDEPIEQDSITKIYSDGAINYLEMSRCHALQGTNKLHVIAQNQLGKAEAETVLT660VVLAEDFRPDLKHVKPENPYK麗GLRKVDCSPELNKALTRTKPSAQTILEMERGSEMKA720RTYRSPEVVEAEKMLDQLASSLRKSELKRPLVNGSHQNDAA76權利要求一種日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白的基因，其特征在于包括具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.如權利要求1所述的日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白的基因，其特征在于所述的SEQIDNO.1所示的核苷酸序列編碼具有SEQIDN0.2所示序列的蛋白。3.—種日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白，包括具有SEQIDN0.2所示氨基酸序列的蛋白、或由該蛋白發(fā)生一個或多個氨基酸的置換、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。4.一種日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白在制備血吸蟲疫苗方面的應用。5.—種日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白在篩選藥物方面的應用。6.—種日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白在制備抗血吸蟲抗體方面的應用。7.—種日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白在血清學診斷方面的應用。8.—種日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白，利用其編碼基因，在基因治療方面的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白基因、其編碼蛋白及應用，該基因包括具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白，包括具有SEQIDNO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由該蛋白發(fā)生一個或多個氨基酸的置換、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白，該蛋白是具有SEQIDNO.1序列編碼的蛋白。本發(fā)明的日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白作為免疫原，在制備血吸蟲疫苗方面的應用；作為潛在的藥物作用靶點，在篩選化學和其他種類藥物方面的應用；作為特異性血吸蟲抗原，在制備抗血吸蟲抗體方面的應用；在血清學診斷方面的應用；日本血吸蟲肌聯(lián)蛋白的編碼基因，在基因治療方面的應用。文檔編號C12N15/12GK101748128SQ20081004409公開日2010年6月23日申請日期2008年12月11日優(yōu)先權日2008年12月11日發(fā)明者馮正,劉鋒,胡薇,韓澤廣申請人:上海人類基因組研究中心