專利名稱：：一種2型糖尿病相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及疾病相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，涉及2型糖尿病相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是指一種2型糖尿病相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：2型糖尿病惠也叫成人發(fā)病型糖尿病，多在3540歲之后發(fā)病，占糖尿病患者90%以上。2型糖尿病患者體內(nèi)產(chǎn)生胰島素的能力并非完全喪失，有的患者體內(nèi)胰島素甚至產(chǎn)生過(guò)多，但胰島素的作用效果卻大打折扣，因此患者體內(nèi)的胰島素是一種相對(duì)缺乏。通常在臨床上應(yīng)用胰島素釋放試驗(yàn)來(lái)區(qū)別糖尿病的類型，試驗(yàn)時(shí)進(jìn)食75克葡萄糖，空腹及進(jìn)食后30分鐘、60分鐘、120分鐘、1S0分鐘各抽血一次測(cè)胰島素及C肽。若空腹血胰島素及C肽低于正常，且進(jìn)食后不增高者考慮為1型糖尿病患者；若空腹血胰島素及C肽正常、增高或稍低，進(jìn)食后有增高但高峰值延遲，則考慮為2型糖尿病患者。2型糖尿病是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用所引起的，屬于多基因疾病，由數(shù)個(gè)糖尿病基因相互作用所引起的。2型糖尿病患者的病情一般較緩和，由于現(xiàn)在的檢測(cè)手段過(guò)于滯后，有的患者甚至自覺(jué)十分健康。如果對(duì)于糖尿病不能早期診斷并給予恰當(dāng)?shù)姆乐?，將可能出現(xiàn)各種慢性并發(fā)癥，如心、腦血管疾病，病情嚴(yán)重者可造成身殘或早亡；下肢血管病變(糖尿病足，病情嚴(yán)重者需截肢而致殘)；糖尿病腎病，晚期需要透析治療；糖尿病視網(wǎng)膜病變，晚期可以失明以及糖尿病神經(jīng)病變所引起的一系列癥狀和體征，這些并發(fā)癥的出現(xiàn)將使糖尿病患者的生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。對(duì)此我們應(yīng)該盡量多了解一些與糖尿病相關(guān)的知識(shí)，做到來(lái)病先防，有病正確對(duì)待并及早調(diào)治。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的就是針對(duì)以上存在的問(wèn)題與不足，提供一種2型糖尿病相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法設(shè)計(jì)巧妙、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為是否進(jìn)一步采取有針對(duì)性的健康管理以及后續(xù)的檢測(cè)手段提供參考依據(jù)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下—種2型糖尿病相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)方法，其特點(diǎn)是，包括步驟a.提取來(lái)自人的樣本的基因組DNA;b.根據(jù)兩個(gè)2型糖尿病相關(guān)基因的序列設(shè)計(jì)二對(duì)引物對(duì)，對(duì)所述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；c.對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并分析測(cè)序結(jié)果來(lái)判斷所述兩個(gè)2型糖尿病相關(guān)基因是否發(fā)生突變。較佳的，所述兩個(gè)2型糖尿病相關(guān)基因是PRKCZ基因和CAPN10基因。更佳地，所述二對(duì)引物對(duì)分別用于檢測(cè)PRKCZ基因的rs427811位點(diǎn)，及CAPN10基因的rs3792267位點(diǎn)。較佳的，其中一對(duì)所述引物對(duì)是SEQIDN0:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。較佳的，其中一對(duì)所述引物對(duì)是SEQIDN0:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于二個(gè)侯檢位點(diǎn)的整合，通過(guò)選取二個(gè)2型糖尿病的侯檢位點(diǎn)，根據(jù)PRKCZ基因和CAPN10基因分別設(shè)計(jì)特異性引物，并對(duì)來(lái)自人的樣本的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，設(shè)計(jì)巧妙、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，根據(jù)二個(gè)侯檢位點(diǎn)的具體狀況作為2型糖尿病健康管理的主線，監(jiān)控疾病的發(fā)生發(fā)展。如果是2型糖尿病遺傳傾向較高或很高的人群，建議減少一切2型糖尿病的外在致病因素，并每半年進(jìn)行一次檢查，做到早預(yù)防，早發(fā)現(xiàn)，早治療，延緩甚至避免疾病的發(fā)生。具體實(shí)施例方式為更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。1.基因組DNA提取1.l試劑和儀器1.1.1試劑和耗材基因組DNA抽提試劑盒(TIANampBLOODDNAkit,DP318-03;TIANampMicro微量樣品基因組DNA提取試劑盒，DP316;TIANamp口腔拭子基因組DNA提取試劑盒，DP322-03)含細(xì)胞裂解液CL;緩沖液GA;緩沖液GS;緩沖液GB;緩沖液GD;漂洗液PW;洗脫緩沖液TB;CarrierRNA;RNase-freeddH20;蛋白酶K(20mg/ml);吸附柱；收集管(2ML);1.5ML無(wú)菌收集管。無(wú)水乙醇。1.1.2儀器DENVILLE260離心機(jī)；XW-80A旋渦混合器；H.H.S指針式電熱恒溫水浴鍋。1.2提取步驟從全血中提取基因組DNA1.2.1取200ill的抗凝全血至1.5ml的E卯endorf管中，如果樣本的量少于200iil，則加入緩沖液GS補(bǔ)充至200ia。如果樣本量多于200iil，需要用細(xì)胞裂解液CL處理，具體步驟如下在樣品中加入1-2.5倍體積的細(xì)胞裂解液CL，顛倒混勻，10，OOOrpm離心1分鐘，吸取上清，留下細(xì)胞核沉淀(如果裂解不徹底，可重復(fù)以上步驟一次)，向離心收集到的細(xì)胞核沉淀中加200iU緩沖液GS，振蕩至徹底混勻。1.2.2加入20ill的蛋白酶K溶液，混勻，再加入200y1的緩沖液GB，立刻充分顛倒混勻。56t:水浴樣本10分鐘，水浴過(guò)程中請(qǐng)每隔3分鐘上下輕柔顛倒混勻樣本，溶液應(yīng)變清亮。(如溶液未徹底變清亮，可延長(zhǎng)裂解時(shí)間至溶液變清亮為止)。1.2.3加入200y1無(wú)水乙醇，充分顛倒混勻，這時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。1.2.4將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12，OOOrpm(13，400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。1.2.5向吸附柱中加入500iU緩沖液GD(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12，000rpm(13，400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。1.2.6向吸附柱中加入700y1漂洗液PW(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12，000rpm(13，400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。1.2.7向吸附柱中加入500iil漂洗液PW，12，000rpm(13，400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液。1.2.8將吸附柱放回收集管中，12，OOOrpm(13，400Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。4吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。1.2.9將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50-200ii1洗脫緩沖液TB，室溫放置2-5分鐘，12，000rpm(13，400Xg)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。注意洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50iU，體積過(guò)小影響回收效率。為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12，OOOrpm(13，400Xg)離心2分鐘。洗脫液的pH對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)(可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率；且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在_20°C，以防DNA降解。2.基因目的片段擴(kuò)增進(jìn)行2個(gè)PCR反應(yīng)，詳見(jiàn)下表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>PCR循環(huán)條件<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>7min;4°C°°PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)擴(kuò)增片段大小，確定是否為檢測(cè)目的片段，如是將目的片段的膠塊割下，進(jìn)行膠回收純化。3.膠回收純化3.1PCR產(chǎn)物純化試劑盒北京博大泰克生物工程有限公司。3.2Kit組成及保存(室溫保存)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3.3準(zhǔn)備工作濃縮緩沖液按1:3的比例加入無(wú)水乙醇，混勻。蓋緊瓶蓋保存。3.3步驟(離心使用國(guó)產(chǎn)TGL-16B離心機(jī))3.3.1制膠用400mlTAE溶液溶解6g的Agarose,終濃度為1.5%(質(zhì)量體積比，1.5gAgarose/100mlTAE)。用微波爐加熱溶解Agarose(可加熱兩次，每次三分鐘，防止爆沸)。室溫冷卻至60°C。加入18ul的濃度為10mg/ml的EB，混勻后，將膠倒入一茬好梳子的膠槽中。待膠徹底凝固，取出梳齒，切下取所需膠孔量用鏟子將膠移至膠槽里后再放到電泳槽中，加入1XTAE。(備注膠槽每次放到制膠平臺(tái)時(shí)下面都要墊上一次性吸水紙，防止污染)3.3.2上樣10uL樣品+2uL溴酚藍(lán)染料，混勻，上樣。5ulDNAMarkerDL2000(北京天為時(shí)代)。3.3.3電泳接通恒直流電源，150伏特電壓電泳，根據(jù)片段大小，電泳15_25分鐘。3.3.4割膠割下含DNA的Agarose膠塊，使它盡可能小，盡可能薄的膠片，放入1.5ml離心管。盡量去掉不含DNA的瓊脂糖，這樣對(duì)提高質(zhì)量、簡(jiǎn)化操作均有利。(備注將膠槽從電泳槽里拿出，放在吸水紙上將緩沖液吸干，在紫外臺(tái)上墊上保鮮膜，用鑷子固定膠塊進(jìn)行割膠，割膠完成后，用鑷子將割好的膠轉(zhuǎn)移到離心管中，注意每轉(zhuǎn)移一個(gè)膠塊，鑷子都要放到酒精溶液中清洗，以防污染。)3.3.5溶膠加入500ul的溶膠液，55。C水浴10min，(計(jì)時(shí)器定時(shí))使膠塊完全熔化，每2min顛倒混勻一次。3.3.6目的片段〈500bp時(shí)，加入100ul的異丙醇，混勻。55。C水浴lmin，混勻。目的片段〉500bp時(shí)，可省略該步驟。3.3.7轉(zhuǎn)移將溶化的Agarose液移入吸附柱，12000rpm離心40sec。倒掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。3.3.8在吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm離心40sec。倒掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。如果室溫低于2(TC，離心前先靜置lmin。3.3.9在吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm離心40sec。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。3.3.10在12000rpm離心2min，靜置10min。3.3.11將吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5ml離心管中。在吸附膜中央加入1225ulTl液(根據(jù)電泳條帶亮度決定)，靜置5min，12000rpm離心2min。將上述DNA溶液_20°C保存。如果室溫低于2(TC，室溫靜置時(shí)間延長(zhǎng)至5min，或者5(TC水浴靜置2min，以確保DNA完全溶解并洗脫下來(lái)。3.3.12對(duì)純化后的PCR進(jìn)行電泳鑒定，2uL樣品+lul溴酚藍(lán)染料，混勻，上樣。5ulDNAMarkerDL2000(北京天為時(shí)代)。觀察條帶的亮度決定BDT反應(yīng)模板用量。4測(cè)序反應(yīng)4.l試劑50%BigDyeterminator3.l(lOOii1BDT+100ii1BDTBuffer);雙蒸水；醋酸鈉/乙醇溶液(3NNaAC2.5ml+E0H37.5ml);70%(-20。C冷凍)乙醇溶液。4.2反應(yīng)操作流程4.2.1將所有特異引物稀釋到3.2pmo1/(=3.2iiM)。4.2.2開始加樣。按先加水，再加引物，最后加模板的順序按體積從大到小將所有樣品加好(引物lPl，總體積4iU)。應(yīng)分別將試劑加在反應(yīng)管不同方向的管壁上(水加于下方，引物加在左邊，模板加在上方)。注意要特別小心，嚴(yán)禁錯(cuò)加、漏加、多加任何其中的一項(xiàng)，每加完一個(gè)項(xiàng)，應(yīng)目測(cè)檢查有無(wú)加錯(cuò)。因所加樣品及試劑均較少，防止時(shí)間太久，導(dǎo)致已加的試劑揮發(fā)，使整個(gè)反應(yīng)體系失去平衡，操作時(shí)要快速準(zhǔn)確。4.2.3加完后，蓋上封口膜，4t:離心，速度到4000rpm即可。將所有液體收集到管底。4.2.4將96孔板的缺口置于左下角，加入liUBDT，BDT要加在管壁的左邊，加完并檢查無(wú)遺漏后，蓋上封口膜，離心(同3.5.1.7)，蓋上蓋子，振蕩，再離心(同3.5.1.7)注意最后一步離心后不要將已收集到管底的液體再次振動(dòng)。4.2.5放入PCR儀中，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)(96°C2min;96。C30s，50。C30s，60。C4min，25cycles;4t:①)。此過(guò)程約需3小時(shí)。4.2.6PCR反應(yīng)結(jié)束后離心(速度達(dá)到4000rpm即可)，揭開蓋子(注意勿將管底液體振起，同時(shí)按順序?qū)⑸w子排好)，加入20iU的乙醇和NaAc的混合溶液，蓋上蓋子，振蕩后再低溫(4°C)高速離心(4000rpm)30分鐘。4.2.7揭開蓋子，蓋上吸水紙，反向離心(小心速度決不能超過(guò)600rpm，嚴(yán)格控制離心時(shí)間，當(dāng)速度達(dá)到600rpm即停止離心)。4.2.8向上步得到沉淀中加入冷凍(-20。C)的70%乙醇100iU，蓋上蓋子，充分振蕩后，離心(4000rpm)15分鐘。4.2.9倒去上清液，蓋上吸水紙，反向離心(同4.2.7)。4.2.10將洗滌好的沉淀在室溫下放置10分鐘左右，讓殘留乙醇全部揮發(fā)。4.2.11加入20ul(1朋20，將反應(yīng)管移至3700上樣底座，離心(速度達(dá)到4000rpm即停止)抽檢反應(yīng)管，看是否樣品溶液已經(jīng)離心至管底。最后將上樣底座小心放入3700儀器的上樣平臺(tái)上，開動(dòng)儀器電泳(3700電泳前先重啟一次)。4.2.12觀察儀器運(yùn)行正常后，清理好實(shí)驗(yàn)臺(tái)，檢查門窗是否關(guān)好，未使用電器的插線板應(yīng)關(guān)掉電源，確保實(shí)驗(yàn)室在無(wú)人時(shí)的安全。5.結(jié)果分析將測(cè)序?qū)С龅腶bl格式的測(cè)序文件導(dǎo)出后，使用Chromas軟件進(jìn)行分析，結(jié)果如下反應(yīng)1:用于檢測(cè)PRKCZ基因的rs427811位點(diǎn)，該P(yáng)RKCZ基因的候檢位點(diǎn)在人群中有三種基因型TT、TG和GG，其中攜帶TT基因型為正常人群，攜帶TG和GG基因型的人群較攜帶TT基因型的人群有較高的風(fēng)險(xiǎn)罹患2型糖尿病，患病風(fēng)險(xiǎn)幾率大小GG型>TG型>TT型，測(cè)序結(jié)果表明rs427811位點(diǎn)為TT型，正常；反應(yīng)2:用于檢測(cè)CAPN10基因的rs3792267位點(diǎn)，該CAPN10基因的候檢位點(diǎn)在人群中有三種基因型AA、AG和GG，其中攜帶AA基因型為正常人群，攜帶AG和GG基因型的人群較攜帶AA基因型的人群有較高的風(fēng)險(xiǎn)罹患2型糖尿病，患病風(fēng)險(xiǎn)幾率大小GG型>AG型>AA型。測(cè)序結(jié)果表明rs3792267位點(diǎn)為GG型，異常。根據(jù)上述檢測(cè)結(jié)果，可以判斷上述受檢的PRKCZ基因正常，而CAPN10基因異常，受檢者較正常人患2型糖尿病的幾率要高，但是是否已經(jīng)患有2型糖尿病，還需要進(jìn)行進(jìn)一步的2型糖尿病檢查，并進(jìn)行專門的針對(duì)性的健康管理。綜上所述，本發(fā)明的2型糖尿病相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)方法設(shè)計(jì)巧妙、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為是否進(jìn)一步采取有針對(duì)性的健康管理以及后續(xù)的檢測(cè)手段提供參考依據(jù)。需要說(shuō)明的是，在本發(fā)明中提及的所有文獻(xiàn)在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，以上所述的是本發(fā)明的具體實(shí)施例及所運(yùn)用的技術(shù)原理，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改而不背離本發(fā)明的精神與范圍，這些等價(jià)形式同樣落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。序列表〈110〉上海基康生物技術(shù)有限公司〈120〉一種2型糖尿病相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)方法〈160>4〈210>1〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1).(22)〈223〉根據(jù)人PRKCZ基因序列設(shè)計(jì)的上游引物〈400>1朋catcgcc3朋c朋gctg322〈210>2〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉8〈221>misc_feature〈222〉(1).(21)〈223〉根據(jù)人PRKCZ基因序列設(shè)計(jì)的下游引物〈400〉2cgcttatggaccagcagtttg21〈210>3〈211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1).(22)〈223〉根據(jù)人CAPNIO基因序列設(shè)計(jì)的上游引物〈400〉3caggcagactcattgtgtagtc22<210>4〈211>21〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉<221>misc_feature〈222〉(1).(21)〈223〉根據(jù)人CAPNIO基因序列設(shè)計(jì)的下游引物〈400>4cctcaatcccacctctttact219權(quán)利要求一種2型糖尿病相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)方法，其特征在于，包括步驟a.提取來(lái)自人的樣本的基因組DNA；b.根據(jù)兩個(gè)2型糖尿病相關(guān)基因的序列設(shè)計(jì)二對(duì)引物對(duì)，對(duì)所述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；c.對(duì)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并分析測(cè)序結(jié)果來(lái)判斷所述兩個(gè)2型糖尿病相關(guān)基因是否發(fā)生突變。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2型糖尿病相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)方法，其特征在于，所述兩個(gè)2型糖尿病相關(guān)基因是PRKCZ基因和CAPN10基因。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的2型糖尿病相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)方法，其特征在于，所述二對(duì)引物對(duì)分別用于檢測(cè)PRKCZ基因的rs427811位點(diǎn)，及CAPN10基因的rs3792267位點(diǎn)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2型糖尿病相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)方法，其特征在于，其中一對(duì)所述引物對(duì)是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2型糖尿病相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)方法，其特征在于，其中一對(duì)所述引物對(duì)是SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。全文摘要本發(fā)明涉及一種2型糖尿病相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)方法，包括步驟提取來(lái)自人的樣本的基因組DNA；根據(jù)兩個(gè)2型糖尿病相關(guān)基因的序列設(shè)計(jì)二對(duì)引物對(duì)，對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并分析測(cè)序結(jié)果來(lái)判斷兩個(gè)2型糖尿病相關(guān)基因是否發(fā)生突變，較佳的，所述兩個(gè)2型糖尿病相關(guān)基因是PRKCZ基因和CAPN10基因，二對(duì)引物對(duì)分別用于檢測(cè)PRKCZ基因的rs427811位點(diǎn)，及CAPN10基因的rs3792267位點(diǎn)，本發(fā)明的2型糖尿病相關(guān)位點(diǎn)檢測(cè)方法設(shè)計(jì)巧妙、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為是否進(jìn)一步采取有針對(duì)性的健康管理以及后續(xù)的檢測(cè)手段提供參考依據(jù)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101748190SQ20081004416公開日2010年6月23日申請(qǐng)日期2008年12月22日優(yōu)先權(quán)日2008年12月22日發(fā)明者趙翊均,陳奕雄申請(qǐng)人:上?；瞪锛夹g(shù)有限公司