專利名稱：：大熊貓西氏蛔蟲抗原的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬蛔蟲的防治及其檢測領(lǐng)域，尤其涉及到大熊貓西氏蛔蟲的制備及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：大熊貓蛔蟲病的病原為西氏蛔蟲(Ascar/s■scZ/roeofen')?；紫x通常寄生于小腸.但在口腔、喉頭、氣管及胃內(nèi)亦曾有發(fā)現(xiàn)，也可鉆進與腸管相通的管道如胰管、膽管內(nèi)，引起阻塞及炎癥.甚至導致死亡.學者馮文和解剖33具野外大熊貓尸體，對其死亡原因作了分析野生大熊貓感染蛔蟲為100%，大熊貓感染蛔蟲的直接、間接死亡率為66.67%，嚴重危及大熊貓物種的生存。由于蛔蟲病癥狀表現(xiàn)不一，蛔蟲對大熊貓的危害根據(jù)其產(chǎn)生數(shù)量可分為三類第一為感染蟲體數(shù)較少，約100條以下，表現(xiàn)為大熊貓營養(yǎng)不良，尤其是表現(xiàn)為生長發(fā)育遲緩。第二為中度感染蟲數(shù)，約100300條，大熊貓表現(xiàn)為營養(yǎng)不良性消瘦、貧血、厭食、腹瀉、腹痛或腸道功能紊亂等癥狀。第三為重度感染，蟲數(shù)在300條以上。蛔蟲寄生后引起并發(fā)癥，如腸炎、腸梗阻、腸穿孔、異位寄生可致肝壞死、胰腺出血性壞死、肺炎等，直接威脅大熊貓的生命(張華，張再歷.大熊貓蛔蟲病的診治，甘肅畜牧獸醫(yī)，2002(6):25-26.)。感染大熊貓蛔蟲的診斷常用糞便直接涂片法或飽和鹽水漂浮法等方法。但由于蛔蟲的特殊生活史，其通過糞便檢査檢出蟲卵時，往往宿主已經(jīng)被幼蟲在體內(nèi)的移行而危害了大熊貓的機體。相對其它蟲種來說，蛔蟲的免疫診斷技術(shù)研究較少。因此蛔蟲的早期診斷顯得尤為重要。由于對宿主感染蛔蟲后引起的免疫研究，有學者提出了大熊貓蛔蟲感染的早期診斷、流行病學調(diào)查以及血清學方法考核防治效果的問題，蛔蟲感染的免疫診斷應(yīng)該受到重視(馮漢利.博士論文.蘇云金桿菌晶體蛋白對豬蛔蟲的作用及豬蛔蟲重組As37蛋白的免疫保護研究)?，F(xiàn)代分子生物學技術(shù)的發(fā)展為蛔蟲疫苗的研制展示了廣闊的前景。因此如何利用分子生物學與免疫學的方法對大熊貓西氏蛔蟲進行防疫或篩選出抗原疫苗在野外快速檢測寄生蟲等引起的疾病，也是大熊貓疾病防治的重要課題之一。本發(fā)明的目的是公開一種大熊貓西氏蛔蟲抗原的制備及其應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是這樣的一種大熊貓西氏蛔蟲抗原的制備及其應(yīng)用，其特征在于大熊貓西氏蛔蟲抗原按照下述步驟制備(1)以大熊貓蛔蟲成蟲或二期幼蟲為模板，用RNA試劑盒法提取大熊貓蛔蟲總RNA。(2)根據(jù)豬蛔蟲的抗原基因序列設(shè)計大熊貓蛔蟲Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3基因引物，所述引物對的序列(以BS-Agl基因為例)上游5，-CGCGGATCCCAAGGACCTCAAGGACCACCAC—3，(含"a/zz/Wll切位點)；下游引物5，-CCCMGCTTCTAGCCTTGCATCTCTTTTTG—3，(含幼V^/J7酶切位點)，(3)采用RT-PCR法將大熊貓總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，擴增出目的產(chǎn)物Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3基因。(4)將回收純化的目的產(chǎn)物直接與pMD18-T載體連接后，轉(zhuǎn)化至受體細胞大腸桿菌K-12的衍生菌DH5a。感受態(tài)細菌，經(jīng)含有氨芐青霉素的平板篩選培養(yǎng)，培養(yǎng)于3mlLB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)14一16h后，取2u1培養(yǎng)的重組克隆菌液為模板，經(jīng)過菌落PCR鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。選取陽性重組克隆，小規(guī)模擴大培養(yǎng)后，進行測序。所述的大熊貓西氏蛔蟲抗原的制備及其應(yīng)用，其特征在于大熊貓西氏蛔蟲抗原經(jīng)測序結(jié)果其抗原基因為Bs-Agl基因、Bs-Ag2基因、Bs-Ag3基因三個基因(基因序列見基因序列表圖1)。所述的大熊貓西氏蛔蟲抗原的制備及其應(yīng)用，其特征在于構(gòu)建大熊貓西氏蛔蟲抗原重組蛋白的原核表達載體，進行重組質(zhì)粒PET28a(+)-Bs-Agl、PET28a(+)-Bs-Ag2和PET32a(+)-Bs-Ag3的構(gòu)建，包括如下步驟(以PET28a(+)-Bs-Agl為例)(1)將測序正確的陽性菌經(jīng)培養(yǎng)后，離心去沉淀抽提PET28a(+)質(zhì)粒，用5^22/7/和歷/^////在37'C酶切2h，回收大片段與純化后的Bs-Agl基因；用fe/zz^/和歷V7c/i7/進行雙酶切后，回收酶切產(chǎn)物中Bs-Agl基因進行連接反應(yīng)。(2)誘導表達和重組蛋白的純化，將測序正確的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，根據(jù)表達的觀察結(jié)果，進行蛋白的大量表達，收集誘導表達菌。收集表達菌離心，用緩沖液(0.5mmol/LNaCl，20mmol/LTris-HClpH8.0)進行懸浮，加入溶菌酶至100wg/ml，細胞懸液放在一20。C冰箱20min后，取出溶解經(jīng)超聲裂解后，依次用含O、2、4mol/L尿素的lX結(jié)合蛋白緩沖液(5腿ol/L咪唑，0.5腿ol/LNaCl，20面ol/LTris-HC1pH8.O)洗滌沉淀；隨后用含8mol/L尿素的1X結(jié)合蛋白緩沖液重懸沉淀，冰上放置lh，使包涵體蛋白完全溶解；16000Xg離心30min去除不可溶物，以孔徑O.45wm的NC膜過濾收集上清液。經(jīng)His結(jié)合樹脂純化，以緩沖液(6mol/L尿素，60mmol/L咪唑，0.5mol/LNaCl，20mmol/LTris-HC1pH8.0)洗去雜蛋白，以洗脫液(6mol/L尿素，lmol/L咪唑，0.5mol/LNaCl，20mmol/LTris-HClpH8.0)洗脫目的蛋白。將純化的重組蛋白于4。C分別在含4mol/L、2mol/L尿素的PBS及PBS溶液中依次進行透析，將溶液置于-2(TC保存。所述的大熊貓西氏蛔蟲抗原的制備及其應(yīng)用，其特征還在于分別將純化的重組蛋白Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3與弗氏完全佐劑l:l混和皮下接種免疫小白鼠，基礎(chǔ)免疫后進行兩次加強免疫，并在最后一次免疫后一周對小白鼠攻蟲，7天后殺小白鼠取其肝、肺臟，經(jīng)貝爾曼法收集幼蟲，記錄結(jié)果并對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，證明pet28(a)-Bs-Agl、PET28a(+)-Bs-Ag2和PET32a(+)-Bs-Ag3蛋白具有較高的免疫保護力，對宿主保護力分別達到60.7%、56.7%和61.2%，與其它組差異極顯著；Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3基因可作為蛔蟲制備基因工程疫苗的侯選基因。所述的大熊貓西氏蛔蟲抗原的制備及其應(yīng)用，其特征還在于用大熊貓蛔蟲重組蛋白Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3作為抗原進行ELISA方法試驗，對免疫后的鼠血清進行ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)保護力高的rBs-Agl、rBs-Ag2和rBs-Ag3-FCA組其血清中抗體水平檢出時間早，而且抗體滴度高，證實重組蛋白Bs-Agl、Bs-Ag2和其產(chǎn)物經(jīng)過檢測并進行免疫保護試驗以及對試驗動物抗體IgG的ELISA檢測分析結(jié)果表明Bs-Ag3具有良好的反應(yīng)原性，可以用來構(gòu)建ELISA方法來檢測感染大熊貓蛔蟲。按照本發(fā)明所說的技術(shù)方案實施后，取得如下的積極效果和作用(BS-Agl為例)。純化回收后的PCR產(chǎn)物直接與PMD18-T載體相連，轉(zhuǎn)化Aco7iDH5a感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆進行測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST搜索發(fā)現(xiàn)與豬蛔蟲L2R59抗原基因(GenBankaccessionno:AB057441)同源性為90%。本發(fā)明選用Pet28a(+)原核表達系統(tǒng)，此系統(tǒng)含有kan抗性基因，其誘導物為IPTG(異丙基-e-D-硫代半乳糖苷)。通過利用DNAmari軟件對大熊貓蛔蟲Bs-Agl基因的酶切位點進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因ORF去掉編碼信號肽序列后的堿基序列中不含歷V^/JT和fe/^/酶切位點，而表達載體PET28a(+)中含有歷/^/J7和)fe^/酶切位點，所以在設(shè)計上游和下游基因引物中分別引入了歷/7o77/和"rf/酶切位點，以便定向克隆至PET28a(+)表達載體。用歷/7rf/7/及5a/z^/消化陽性克隆質(zhì)粒，將其目的片段與相同酶消化的PET28a(+)表達載體連接，得到了表達Bs-Agl的原核表達rBs-Agl。大熊貓蛔蟲Bs-Agl通過軟件預(yù)測，閱讀框能編碼146個氨基酸，分子量15.857，pI9.61;去掉16個氨基酸信號肽后，能編碼132個氨基酸的分子量分子量14.127，p19.49,130個氨基酸。通過BLAST搜索結(jié)果發(fā)現(xiàn)大熊貓蛔蟲的Bs-Agl和豬蛔蟲L2R59抗原基因編碼的氨基酸(BAB67769.1)同源性高達90%;可以看出Bs-Agl閱讀框編碼氨基酸的同源性較高都是線蟲抗原和線蟲的基因產(chǎn)物。說明Bs-Agl是線蟲特有基因的產(chǎn)物。因此,Bs-Agl基因可作為蛔蟲制備基因工程疫苗的侯選基因。用大熊貓蛔蟲重組表達蛋白作為抗原進行了ELISA方法的初步探討。對免疫后的鼠血清進行ELISA檢測，結(jié)果證實，所說的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可以用來建立ELISA方法以提高檢測感染大熊貓蛔蟲的診斷手段。圖1為本發(fā)明所說的大熊貓蛔蟲Bs-Agl基因、Bs-Ag2基因、Bs-Ag3基因三個基因序列表。圖2為本發(fā)明所說的大熊貓蛔蟲Bs-Agl和豬蛔蟲L2R59去掉信號肽的堿基序列同源性比較圖。圖3為本發(fā)明所說的重組質(zhì)粒PET28a(+)—BS-Agl用fe^/酶切和歷/^J//雙酶切后構(gòu)建成的片段圖。圖4為本發(fā)明所說的重組質(zhì)粒表達蛋白SDS-PAGE圖。圖5為本發(fā)明所說的重組質(zhì)粒表達蛋白Western-blot圖。注釋說明1、本發(fā)明所涉及的菌株和質(zhì)?；蚩寺【闑.coh'DH5ct、表達菌株BL21(DE3)購于成都博瑞克生物公司；克隆載體PMD18-T購自天泰生物公司，表達載體Pet28a(+)由四川農(nóng)業(yè)大學寄生蟲免疫研究室保存。2、酶、主要試劑歷朋/、jWMi77P艮制性內(nèi)切酶、RT試劑盒、TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶和DNAMarker均為TakaRa公司產(chǎn)品、考馬斯亮藍、溶菌酶、DTT(大連寶生物)公司產(chǎn)品；RNA基因組抽提、質(zhì)粒抽提、膠回收、PCR產(chǎn)物純化等試劑盒購于上海華舜公司。IPTG、SDS購于上海生工公司；兔抗大熊貓蛔蟲IgG由四川農(nóng)業(yè)大學寄生蟲免疫研究室自己制備;2XTaqPCRMasterMix、山羊抗鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP:購于成都博瑞克生物公司。具體實施例方式結(jié)合附圖給出實施例并做出進一步的說明。首先利用大熊貓糞便沉淀法收集蛔蟲卵，用含2%福爾馬林的生理鹽水培養(yǎng)皿內(nèi)，加蓋，置25-28'C溫箱內(nèi)培養(yǎng)，3-4周就能獲得大量的感染性蟲卵，將其大熊貓蛔蟲感染性蟲卵人工感染白兔，每只灌胃3,500個，每間隔一周重復(fù)一次。每次免疫前對試驗動物耳靜脈采血，免疫四次后經(jīng)瓊擴法測定其效價待血清效價達到1:8時心臟采血，收集分離血清，分裝小管，一2(TC保存?zhèn)溆?，以此獲得兔抗大熊貓蛔蟲陽性血清供下一步試驗時用。將收集的大熊貓蛔蟲成蟲從-7(TC冰箱取出，經(jīng)凍過低溫的研缽中磨成粉末，然后參照總RNA提取試劑盒使用說明書，提取大熊貓蛔蟲總RNA，一70'C保存?zhèn)溆?也可以選用蛔蟲的二期幼蟲獲得大熊貓蛔蟲總RNA的提取。以大熊貓蛔蟲BS-Agl基因為例，根據(jù)豬蛔蟲的抗原基因序列，結(jié)合本發(fā)明需用表達載體的特點，利用引物設(shè)計軟件Primer5.0設(shè)計合成如下一對引物上游引物5'-CGCGGATCCCAAGGACCTCAAGGACCACCAC—3，(含Aaffl^/酶切位點)；下游引物5，-CCCAAGCTTCTAGCCTTGCATCTCTTTTTG—3，(含歷/^/77酶切位點)，引物委托寶生物工程(大連)有限公司合成實施。參照TaKaRa公司RT試劑盒的使用說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增.PCR反應(yīng)體系為2XTaqPCRMasterMix25uL;cDNA產(chǎn)物3UL;無菌水22uL;上下游引物各1.5uL。反應(yīng)混合物進行PCR，反應(yīng)程序為；95。C預(yù)變性5min;95。C變性30s，55。C退火30s，72。C延伸45s,循環(huán)擴增30次，最后72'C延伸10min.擴增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用膠回收純化試劑盒回收PCR擴增出的目的產(chǎn)物(400-500bp左右)，將回收純化的目的產(chǎn)物直接與pMD18-T載體連接后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化￡coh'DH5a感受態(tài)細胞，經(jīng)含有氨芐青霉素的平板篩選培養(yǎng)，挑取菌落培養(yǎng)于3mlLB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)14-16h后，取10u1培養(yǎng)的重組克隆菌液為模板，用引物做菌落PCR鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.選取3個陽性重組克隆，小規(guī)模擴大培養(yǎng)后，進行測序。測得基因序列見圖1(基因序列正在提交)。圖2是大熊貓蛔蟲Bs-Agl基因和豬蛔蟲L2R59去掉信號肽的堿基序列同源性比較圖。大熊貓蛔蟲Bs-Agl基因與豬蛔蟲L2R59抗原基因去掉編碼信號肽后的堿基的序列同源性為90%。閱讀框有450個堿基。大熊貓蛔蟲Bs-Agl基因開放閱讀框共450bp，能編碼146個氨基酸，分子量15.857,pI9.61;信號肽共48個堿基能編碼16個氨基酸信號肽，去掉信號肽后能編碼132個氨基酸的分子量14.127，p19.49,130個氨基酸。并通過BLAST搜索同源性高的線蟲抗原基因編碼氨基酸，大熊貓蛔蟲Bs-Agl基因閱讀框編碼的氨基酸和豬蛔蟲L2R59抗原基因閱讀框編碼的氨基酸(BAB67769.1)同源性高達90%。為了構(gòu)建大熊貓西氏蛔蟲抗原重組蛋白的原核表達載體，需要進行重組質(zhì)粒PET28a(+)-Bs-Agl、PET28a(+)-Bs-Ag2和PET32a(+)-Bs-Ag3的構(gòu)建，包括如下步驟本實施例僅以PET28a(+)-Bs-Agl為例說明。(1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建歷'/^///及^/^/消化陽性克隆質(zhì)粒，將其目的片段與相同酶消化的PET28a(+)表達載體連接。連接反應(yīng)體系為Bs-Agl基因片段6ul，PET28a(+)質(zhì)粒lul，5xLigase:41，T4D亂igase:8ti1，Autoclaned:1，混合后置16。C連接5h，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞混勻后冰浴30min—lh，然后42'C水浴90sec，取出冰浴3-5min,加預(yù)熱的適量LB培養(yǎng)基在37'C低轉(zhuǎn)速搖床培養(yǎng)在含A即的LB瓊脂平皿上進行篩選，用接種環(huán)挑取菌落，在含Kan(100.0ug/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，250-300r/min37'C恒溫搖床過夜。在這一過程中需要對重組PET28a(+)/Bs-Agl質(zhì)粒的鑒定。酶切鑒定用5a^飾歷V^/i7^重組質(zhì)粒在37'C進行雙酶切2h，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物。圖3是本發(fā)明所說的重組質(zhì)?！?28&(+)用飽/^7酶切和歷/^//7雙酶切后構(gòu)建成的片段圖。可以看出將重組質(zhì)粒PET28a(+)-Bs-Agl用fe/z^7f卩歷V707J7雙酶切后電泳，可見兩條大小分別約為大片段6kb和小片段400500kb的片段，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。(2)SDS-PAGE將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)化￡coh'DH5a感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆進行測序，測序結(jié)果正確的克隆菌抽提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到ABI21中進行表達，收集菌液離心，分別取上清和沉淀經(jīng)超聲波破碎后離心，SDS-PAGE分析顯示表達蛋白主要以包涵體形式存在。當0D600-0.8，lmMIPTG時，分別取誘導表達O、1、2、3、4、5h的菌液進行SDS-PAGE,在蛋白分子量18.OOKD以下出現(xiàn)蛋白條帶，與預(yù)期蛋白的分子量14.127KD相符。圖4為本發(fā)明所說的重組質(zhì)粒表達蛋白SDS-PAGE分析圖。(3)重組蛋白的純化收集表達菌離心，用緩沖液(0.5mmol/LNaCl，20mmol/LTris_HClpH8.0)進行懸浮，加入溶菌酶至IOOug/ml，細胞懸液放在—2(TC冰箱20min后，取出溶解經(jīng)超聲裂解后，依次用含0、2、4mol/L尿素的lX結(jié)合蛋白緩沖液(5mmol/L咪唑，0.5隱ol/LNaCl，20mmol/LTris-HC1pH8.0)洗滌沉淀；隨后用含8mol/L尿素的lX結(jié)合蛋白緩沖液重懸沉淀，冰上放置lh，使包涵體蛋白完全溶解；16000Xg離心30min去除不可溶物，以孔徑O.45um的NC膜過濾收集上清液。經(jīng)His結(jié)合樹脂純化，以緩沖液(6mol/L尿素，60mmol/L咪唑，0.5mol/LNaCl，20mmol/LTris-HC1pH8.0)洗去雜蛋白，以洗脫液(6mol/L尿素，lmol/L咪唑，0.5mol/LNaCl，20醒ol/LTris-HClpH8.0)洗脫目的蛋白。將純化的重組蛋白于4'C分別在含4mol/L、2mol/L尿素的PBS及PBS溶液中依次進行透析，將溶液置于-2(TC保存。(4)Westernblot將純化后的表達產(chǎn)物進行Westernblot分析，同時用空表達載體Pet28a(+)(不含目標片段)的表達產(chǎn)物做空白對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白載體不能與第一步所做的兔抗大熊貓蛔蟲陽性血清發(fā)生反應(yīng)，而含有目標片段的重組載體菌表達產(chǎn)物則可與兔抗大熊貓蛔蟲陽性血清發(fā)生反應(yīng)，出現(xiàn)顯色帶。圖5為本發(fā)明所說的重組質(zhì)粒表達蛋白Western-blot分析圖。(5)免疫保護試驗分別將純化的重組蛋白Bs-Agl與弗氏完全佐劑l:l混和皮下接種免疫小白鼠，基礎(chǔ)免疫后進行兩次加強免疫，并在最后一次免疫后一周對小白鼠攻蟲，7d后殺小白鼠取其肝、肺臟經(jīng)貝爾曼法收集幼蟲，記錄結(jié)果見表1。表l各組小鼠攻蟲后肝臟和肺臟幼蟲數(shù)統(tǒng)計結(jié)果larvae_lii動物數(shù)平均檢蟲數(shù)減蟲率<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，免疫組與對照組相比蟲體明顯減少了67.77%，免疫組蟲與佐劑組和對照組差異極顯著(尸<0.01)，F(xiàn)CA組與對照組相比，兩者差異不顯著(p〉0.05)。(6)對試驗動物抗體IgG的ELISA檢測分析鼠血清樣本IgG的ELISA檢測0D630，各組動物免疫前后血清樣品用ELISA檢測IgG，統(tǒng)計結(jié)果表明(表2)。在免疫后第14d、第28d、第42d免疫組鼠血清中均能檢測到特異性IgG抗體，并且抗體水平逐漸上升免疫組與對照組、FCA組差異極顯著0X0.01)，F(xiàn)CA組與對照組差異不顯著(P〉0.05)。表2免疫前后血清IgGELISA檢測統(tǒng)計結(jié)果(0D630)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注同列肩標不同字母表示差異極顯著(P<0.01),相同字母表示差異不顯著(p>0.05)。本發(fā)明所說的其產(chǎn)物經(jīng)過檢測并進行免疫保護試驗以及對試驗動物抗體IgG的ELISA檢測分析結(jié)果再次證實了所說的大熊貓西氏蛔蟲抗原Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3基因可以作為蛔蟲制備基因工程疫苗的侯選基因。大熊貓蛔蟲重組蛋白Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3具有良好的反應(yīng)原性，可以用來構(gòu)建以ELISA方法檢測感染大熊貓蛔蟲。權(quán)利要求1、大熊貓西氏蛔蟲抗原的制備及其應(yīng)用，其特征在于大熊貓西氏蛔蟲抗原按照下述步驟制備(1)以大熊貓蛔蟲成蟲或二期幼蟲為模板，用RNA試劑盒法提取大熊貓蛔蟲總RNA。(2)根據(jù)豬蛔蟲的抗原基因序列設(shè)計大熊貓蛔蟲Bs-Ag1、Bs-Ag2和Bs-Ag3基因引物，所述引物對的序列為上游CGCGGATCCcaaggacctcaaggaccaccac(含BAMHI酶切位點)；下游5-CCCAAGCTTCTAgccttgcatctctttttg-3(含HINDIII酶切位點)。(3)采用RT-PCR法將大熊貓總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，擴增出目的產(chǎn)物Bs-Ag1、Bs-Ag2和Bs-Ag3基因。(4)將回收純化的目的產(chǎn)物直接與pMD18-T載體連接后，轉(zhuǎn)化至受體細胞大腸桿菌K-12的衍生菌DH5α。感受態(tài)細菌，經(jīng)含有氨芐青霉素的平板篩選培養(yǎng)，培養(yǎng)于3mlLB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)14--16h后，取2μl培養(yǎng)的重組克隆菌液為模板，經(jīng)過菌落PCR鑒定，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。選取陽性重組克隆，小規(guī)模擴大培養(yǎng)后，進行測序。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的大熊貓西氏蛔蟲抗原的制備及其應(yīng)用，其特征在于大熊貓西氏蛔蟲抗原經(jīng)測序結(jié)果其抗原基因為Bs-Agl基因、Bs-Ag2基因、Bs-Ag3基因三個基因(基因序列見序列表l、2、3)。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的大熊貓西氏蛔蟲抗原的制備及其應(yīng)用，其特征在于構(gòu)建大熊貓西氏蛔蟲抗原重組蛋白的原核表達載體，進行重組質(zhì)粒PET28a(+)-Bs-Agl、PET28a(+)-Bs-Ag2和PET32a(+)-Bs-Ag3的構(gòu)建，包括如下步驟(以PET28a(+)-Bs-Agl為例)(1)將測序正確的陽性菌經(jīng)培養(yǎng)后，離心去沉淀抽提PET28a(+)質(zhì)粒，用BamHI和HindIII在37'C下，進行水浴酶切2h，回收大片段與純化后的Bs-Agl基因；用BamHI和HindIII進行雙酶切后，回收酶切產(chǎn)物中Bs-Agl基因進行連接反應(yīng)。(2)誘導表達和重組蛋白的純化，將測序正確的重組質(zhì)粒，用上述方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，根據(jù)表達的觀察結(jié)果，進行蛋白的大量表達，收集誘導表達菌。將所得細菌沉淀經(jīng)反復(fù)凍融和超聲裂解后，依次用含0、2、4mol/L尿素的lx結(jié)合蛋白緩沖液洗滌沉淀；隨后用含8mol/L尿素的lx結(jié)合蛋白緩沖液重懸沉淀，冰上放置lh，使包涵體蛋白完全溶解。將重組蛋白Bs-Agl于4'C條件下分別在含8mol/L尿素的PBS溶解，將溶液于4'C保存。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的大熊貓西氏蛔蟲抗原的制備及其應(yīng)用，其特征在于分別將純化的重組蛋白Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3與弗氏完全佐劑hl混和皮下接種免疫小白鼠，基礎(chǔ)免疫后進行兩次加強免疫，并在最后一次免疫后一周對小白鼠攻蟲，7天后殺小白鼠取其肝、肺臟，經(jīng)貝爾曼法收集幼蟲，記錄結(jié)果并對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，證明PET28(a)-Bs-Agl、PET28a(+)-Bs-Ag2和PET32a(+)-Bs-Ag3蛋白具有較高的免疫保護力，對宿主保護力分別達到60.7%、56.7%和61.2%，與其它組差異極顯著；Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3基因可作為蛔蟲制備基因工程疫苗的侯選基因。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的大熊貓西氏蛔蟲抗原的制備及其應(yīng)用，其特征在于用大熊貓蛔蟲重組蛋白Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3作為抗原進行ELISA方法試驗，對免疫后的鼠血清進行ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)保護力高的Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3-FCA組其血清中抗體水平檢出時間早，而且抗體滴度高，證實重組蛋白Bs-Agl、Bs-Ag2和Bs-Ag3具有良好的反應(yīng)原性，可以用來構(gòu)建以ELISA方法檢測感染大熊貓蛔蟲。全文摘要本發(fā)明公開了大熊貓西氏蛔蟲抗原的制備及其應(yīng)用，屬大熊貓西氏蛔蟲的防治及檢測領(lǐng)域。包括設(shè)計出西氏蛔蟲抗原基因引物；采用RT-PCR法將蛔蟲總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板，PCR擴增出目的產(chǎn)物；將純化的目的產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)至DH5α，感受態(tài)細菌；經(jīng)平板篩選培養(yǎng)，選取陽性重組克隆，培養(yǎng)后測序出抗原基因為Bs-Ag1基因、Bs-Ag2基因、Bs-Ag3基因。再進行重組質(zhì)粒構(gòu)建、誘導表達和重組蛋白純化，將測序正確的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，進行蛋白的大量表達。其產(chǎn)物經(jīng)檢測、免疫試驗以及對試驗動物抗體IgG的ELISA檢測分析大熊貓西氏蛔蟲抗原Bs-Ag1、Bs-Ag2和Bs-Ag3基因可以作為蛔蟲制備基因工程疫苗的侯選基因，其重組蛋白Bs-Ag1、Bs-Ag2和Bs-Ag3具有良好的反應(yīng)原性，可以用來構(gòu)建以ELISA方法檢測感染大熊貓蛔蟲。文檔編號C12N15/70GK101348787SQ200810044409公開日2009年1月21日申請日期2008年5月19日優(yōu)先權(quán)日2008年5月19日發(fā)明者何光志,彭雪蓉,楊光友,濤汪申請人:四川農(nóng)業(yè)大學