專利名稱：用微生物混合菌株制備紅景天液態(tài)轉(zhuǎn)化發(fā)酵物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于從紅景天藏中藥材中提取有效活性成分的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用 微生物混合菌株制備紅景天液態(tài)轉(zhuǎn)化發(fā)酵物的方法，該方法使發(fā)酵物中所含的有效活, 性成分大大提高。
背景技術(shù)：
紅景天是指景天科紅景天屬植物，在世界上有卯余種，多分布在北半球的高寒地 帶，大多數(shù)都生長在海拔3500-5000米左右的高山流石或灌木叢林下。我國現(xiàn)發(fā)現(xiàn)有 73種，主要分布在我國西藏的高山高寒地帶，另外東北、西北、華北的一些地區(qū)也有 紅景天資源分布。
紅景天的主要藥用部位是根莖，其中所含的主要有效成份紅景天甙和酪醇(甙元)， 具有抗疲勞、抗缺氧、抗誘變和抑制腫瘤等功效，且無副作用(宋月英等，紅景天屬植 物化學(xué)成分及藥連作用的研究進(jìn)展中草藥.2004， 35(2),235-236;李剛等藏藥紅景天 的藥理學(xué)研究進(jìn)展中國民族醫(yī)藥雜志.2004， 10(3).-38-40;王家明閆繼平王盛虔 紅景天的藥理作用研究進(jìn)展中醫(yī)藥學(xué)報.2003，31(4),57-59)，因此，在藥品和保健食 品的開發(fā)中得到了廣泛的應(yīng)用。
由于對紅景天的大量開發(fā)利用，使這種高原藏區(qū)野生藥材資源已面臨枯竭的危機(jī)。 而目前采用的紅景天活性成分制備工藝大多是用醇類(乙醇等)直接浸泡紅景天原料 .進(jìn)行提取。這種方法只能提取其中存在的有效活性成分，而其中的有效活性成分含量 又很低，如紅景天苷的含量約為0.6~0.7%。面對大量的社會需求，如何在當(dāng)前提取法 的基礎(chǔ)上開發(fā)新的制備方法，以提高紅景天原藥材的利用率，已成為當(dāng)前本領(lǐng)域急需 解決的問題。己報道的新工藝方法有化學(xué)合成法，植物細(xì)胞組織培養(yǎng)法以及用單一菌 株的微生物轉(zhuǎn)化法。這些方法均是在醇類提取工藝之前，欲通過不同來源獲得或增加 有效成分，期望減少野生資源的用量。其中微生物轉(zhuǎn)化法從提高紅景天本身的有效成 分來說是最具應(yīng)用前景的方法，如專利申請"一種微生物轉(zhuǎn)化制備紅景天提取物的方 法"(申請?zhí)?00610146107.2 )公開的技術(shù)就是采用單一微生物菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化發(fā)酵的 方法。雖然該方法能提高紅景天本身的有效成分，但因其最高只能提高有效活性成分
含量約30%，故提高有限，還不夠理想，尤其是作為增加了微生物菌株轉(zhuǎn)化發(fā)酵工序 所帶來的成本，與所提高的有效活性成分含量的價值相比，只能處于盈虧平衡點(diǎn)附近， 使其生產(chǎn)應(yīng)用價值不大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對已有的采用單一微生物菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化發(fā)酵提高紅景天有效成 分方法存在的缺陷，提供一種用微生物混合菌株制備紅景天液態(tài)轉(zhuǎn)化發(fā)酵物的方法， 該方法能大幅提高紅景天原藥材中有效活性成分，在利用同等量原藥材的條件下，能 獲得更多的提取產(chǎn)物，使野生藏中藥材得到充分利用。
本發(fā)明提供的用微生物混合菌株制備紅景天液態(tài)轉(zhuǎn)化發(fā)酵物的方法，該方法的工藝 步驟和條件為
1) 將紅景天根莖粉碎至60 120目，優(yōu)選80 120目，更優(yōu)選80目；
2) 在每100份的紅景天粉中加入800 1000份水，優(yōu)選800 900份，0.5~2份酵 母膏，優(yōu)選1 2份，0.5 2份磷酸二氫鉀，優(yōu)選1 2份，和0.2 0.5份硫酸鎂，優(yōu) 選0.2份，攪拌混合均勻，使之成為紅景天液態(tài)水懸液，并滅菌；
3) 在含紅景天粉的液體種子培養(yǎng)基中分別制備曲霉屬中的黑曲霉^^^^//^"/^" 和米曲霉(Ape^7/Mj 077加e)的菌絲培養(yǎng)物；
4) 將制備的兩種霉菌的菌絲培養(yǎng)物按重量比2 8 : 8 2混合后，將混合菌絲培養(yǎng) 物接種于紅景天液態(tài)水懸液中，接種量按濕重計為每100份水接種5 20份；
5) 將接種后的制備物在溫度28 32'C下保溫培養(yǎng)發(fā)酵48 60小時，優(yōu)選溫度30 'C，培養(yǎng)時間50小時即可，
以上所用物料份數(shù)均為重量份。
以上接種的菌絲培養(yǎng)物的濕重是指將培養(yǎng)出來的菌絲培養(yǎng)物離心除去水分后的重量。
該方法中對紅景天液態(tài)水懸液滅菌可在常規(guī)條件下進(jìn)行，如在溫度121'C滅菌30 分鐘。
該方法中所用的菌絲培養(yǎng)物是這樣培養(yǎng)的先將粒徑為80目的紅景天粉和水按 1 : IO重量份混合，再按水的重量份計分別加入0.2%的酵母膏、0.1%的磷酸二氫鉀和 0.05%的硫酸鎂，配成液體種子培養(yǎng)基，然后在液體種子培養(yǎng)基中分別接入曲霉屬 (Aspergillus)中的黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)孢子，在溫度 3(TC下?lián)u床培養(yǎng)2天，離心后棄去上清液，收集菌絲沉淀。
其中所用的兩種霉菌既可采用已有的曲霉屬(^ pe/"gi'"w)中的黑曲霉 04wwgWw m'ger)和米曲霉04印erg///^ 0A7加e),也可采用本發(fā)明人從野生紅景天藥材 中分離純化和篩選后得到的，優(yōu)選后一種。本發(fā)明人從野生紅景天藥材中分離純化和 篩選后得到的黑曲霉04^erg/〃"sw扭r)和米曲霉(^y;^gz7/M;y or;;z加)的具體方法是將 天然野生紅景天藥材搗碎，取lg，加入5ml無菌水，震蕩搖勻，再用無菌水分別稀釋 10、 100、 1000和10000倍。將以上各稀釋液分別取0.1ml，涂布于分離培養(yǎng)基中，經(jīng) 3(TC培養(yǎng)3天，挑取單菌落，選擇在紅景天培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化發(fā)酵后，用高效液相色譜 (HPLC)檢測，紅景天苷含量提高的菌株。分離培養(yǎng)基配方是葡萄糖10g、蛋白胨 5g、酵母膏5g、磷酸二氫鉀lg、硫酸銨0.5g、瓊脂20g和水lOOOml。所分離出的兩種 霉菌根據(jù)常規(guī)方法鑒定為曲霉屬(A，W/to)中的黑曲霉(Asperg說^w/ger)和米曲霉
對于紅景天植物中的主要有效活性成分紅景天苷的含量，中國藥典2005年版一部 規(guī)定藥材中紅景天苷的含量應(yīng)>0.5%，而經(jīng)實(shí)測天然紅景天原藥材中紅景天苷的含量 約為0.6~0.7%。現(xiàn)有的紅景天苷提取物的制備工藝是采用醇類(乙醇等)直接浸泡提 取，故只能提取已經(jīng)存在的紅景天苷。由于紅景天的主要有效活性成分紅景天甙及酪 醇(甙元)的合成屬于次級代謝，即酪醇及紅景天甙是在酚性結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上分別加上乙 醇基和葡萄糖基所形成。本發(fā)明人在研究時發(fā)現(xiàn)紅景天植物中存在著一定的可轉(zhuǎn)化的 前體，因而根據(jù)微生物具有豐富的的代謝多樣性和很強(qiáng)的代謝能力，并具有在高等植 物體內(nèi)存在的代謝途徑，曾提出了用微生物的酶系來催化紅景天原料中無活性的前體， 使之與葡萄糖基及乙醇基等成分合成酪醇及紅景天甙，以提高紅景天甙及酪醇(甙元) 含量的技術(shù)方案(專利申請?zhí)?00610146107.2)。該技術(shù)方案的原理如下圖所示
加上乙醇基 加上葡萄糖基
無活性的前體
微生物酶
酪醇(苷元)
微生物酶
紅景天苷
但由于該方法采用的是單一菌株，雖然能提高有效活性成分的含量，但其提高量 較為有限。本發(fā)明人在進(jìn)一步研究中，大膽打破"使用混合酶發(fā)酵比單一酶效果更差" 的慣性思維，進(jìn)行了創(chuàng)造性的探索，提供了上述用曲霉屬中的黑曲霉(^pe/"g!7^m'g^ 和米曲霉(^y; ergf//^ 0^加e)兩種微生物混合菌株制備紅景天液態(tài)轉(zhuǎn)化發(fā)酵物的方法。 該方法能大幅提高紅景天原藥材中有效活性成分，使紅景天苷的含量最高可比原藥材 提高100%以上，因而在利用同等量原藥材的條件下，能獲得更多的提取產(chǎn)物，使野生
藏中藥材得到充分利用。
由于經(jīng)本發(fā)明方法發(fā)酵處理后所得的轉(zhuǎn)化發(fā)酵物中紅景天苷的含量最高可比原藥 材提高100%以上，因而在獲得同等量產(chǎn)物時，可減少原藥材消耗。且還可通過以下經(jīng) 濟(jì)效益的分析計算中看出，單菌株轉(zhuǎn)化法增效處于盈虧平衡點(diǎn)附近；而本方法增效是 單菌株轉(zhuǎn)化法的8倍，具有很強(qiáng)的應(yīng)用前景
按獲得紅景天苷同等含量計算，直接用乙醇浸泡的原工藝需消耗原藥材1噸，單 菌株轉(zhuǎn)化法需原藥材770kg (按可提高30%來計算的)，本發(fā)明方法只需原藥材500kg (按可提高100%來計算的)。又因單菌株轉(zhuǎn)化法與本發(fā)明方法增加的生產(chǎn)成本相同，約 4000元/噸原藥材。按購買每噸原藥材需2萬元計， 單菌株轉(zhuǎn)化法
降低原料成本20000元/噸X230k^ 4600元， 增加的生產(chǎn)成本4000元/噸X770kgz 3080元
增加盈利4600元一3080元=1520元/770kg，相當(dāng)于1974元/噸原藥材。 本發(fā)明方法
降低原料成本20000元/噸乂5001^= 10000元。 增加的生產(chǎn)成本4000元/噸X500kg-2000元
增加盈利10000元一2000元=8000元/500kg，相當(dāng)于16000元/噸原藥材。 同時使野生資源的利用率提高1倍，從而可實(shí)現(xiàn)野生藏中藥材的保護(hù)性開發(fā)，并 減少藥渣等污染物的排量。
具體實(shí)施例方式
下面給出實(shí)施例以對本發(fā)明作出進(jìn)一步說明，但所給出的實(shí)施例不能理解為對本 發(fā)明保護(hù)范圍的限制，因而本專業(yè)的技術(shù)人員根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容和設(shè)計思想所作 出的非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
另外，值得說明的是以下實(shí)施例所用物料份數(shù)均為重量份。 實(shí)施例1
本實(shí)施例為黑曲霉04^erg///^ w/ger)和米曲霉(^5;^^7/1 oo;zfle)菌絲的制取。 1)將天然野生紅景天藥材搗碎，取lg，加入5ml無菌水，震蕩搖勻，再用無菌水 分別稀釋IO、 100、 1000和10000倍。將以上各稀釋液分別取0.1ml，涂布于由葡萄糖 10g、蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氫鉀lg、硫酸銨0.5g、瓊脂20g和水1000ml組成 的分離培養(yǎng)基中，經(jīng)30'C培養(yǎng)3天，挑取單菌落，選擇在紅景天培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化發(fā)酵后，
用高效液相色譜(HPLC)檢測，紅景天苷含量提高的菌株。
2)先將粒徑為80目的紅景天粉和水按i: io重量份混合，再按水的重量份計分
別加入0.2%的酵母膏、0.1%的磷酸二氫鉀和0.05%的硫酸鎂，配成液體種子培養(yǎng)基， 然后在液體種子培養(yǎng)基中分別接入第一步方法所獲取的曲霉屬(J^erg///^)中的黑曲 霉(^/^( ///^ "/ger)和米曲霉(A;^gz7/^ 0A7加e)孢子，然后在溫度30'C下?lián)u床培養(yǎng)2 天，離心后棄去上清液，分別收集菌絲沉淀，用離心機(jī)甩干備用。 實(shí)施例2
將100g紅景天根莖原料粉碎至60目，然后加入0.5g酵母膏、0.5g磷酸二氫鉀、 0.2g硫酸鎂和800mL水，攪拌混合均勻，使之成為紅景天液態(tài)水懸液，并用蒸汽在121°C 下滅菌30分鐘；冷卻后接種按實(shí)施例1方法制備的80g (濕重)的混合霉菌菌絲體， 其中黑曲霉^4印￡^///^ /^^和米曲霉(^pe/^〃MJOo;加e)的重量配比為8 : 2，然后在 30'C保溫培養(yǎng)發(fā)酵50小時即可。
將獲得的液態(tài)轉(zhuǎn)化發(fā)酵物用高效液相色譜(HPLC)檢測，紅景天苷含量為1.3586%, 與同樣條件檢測的原始藥材的紅景天苷含量為0.7306%相比，經(jīng)轉(zhuǎn)化后發(fā)酵物中的紅 景天苷含量可提高85.96%。
實(shí)施例3
將100g紅景天根莖原料粉碎至80目，然后加入lg酵母膏、lg磷酸二氫鉀、0.3g 硫酸鎂和900mL升的水，攪拌混合均勻，使之成為紅景天液態(tài)水懸液,并用蒸汽在121 °C 下滅菌30分鐘；冷卻后接種按實(shí)施例1方法制備的90g (濕重)的混合霉菌菌絲體， 其中黑曲霉^印e^7/t^"/g^)和米曲霉(^y，/^7/wwy加e)的重量配比為6 : 4，然后在 3(TC保溫培養(yǎng)發(fā)酵50小時即可。
將獲得的液態(tài)轉(zhuǎn)化發(fā)酵物用高效液相色譜(HPLC)檢測，紅景天苷含量為1.4125%, 與同樣條件檢測的原始藥材的紅景天苷含量為0.7306%相比，經(jīng)轉(zhuǎn)化后發(fā)酵物中的紅 景天苷含量可提高93.33%。
實(shí)施例4
將100g紅景天根莖原料粉碎至80目，然后加入2g酵母膏、2g磷酸二氫鉀、0.5g 硫酸鎂和1000mL升的水，攪拌混合均勻，使之成為紅景天液態(tài)水懸液，并用蒸汽在 121'C下滅菌30分鐘；冷卻后接種按實(shí)施例1方法制備的100g (濕重)的混合霉菌菌 絲體，其中黑曲霉^j^^7/附"/g勿和米曲霉(^ /^/^///^^^加)的重量配比為4 : 6, 然后在30'C保溫培養(yǎng)發(fā)酵50小時即可。
將獲得的液態(tài)轉(zhuǎn)化發(fā)酵物用高效液相色譜(HPLC)檢測，紅景天苷含量為1.3639%， 與同樣條件檢測的原始藥材的紅景天苷含量為0.7306%相比，經(jīng)轉(zhuǎn)化后發(fā)酵物中的紅 景天苷含量可提高86.68%。
實(shí)施例5
將100g紅景天根莖原料粉碎至80目，然后加入l,2g酵母膏、1.2g磷酸二氫鉀、 0.3g硫酸鎂和800mL升的水，攪拌混合均勻，使之成為紅景天液態(tài)水懸液，并用蒸汽 在121'C下滅菌30分鐘；冷卻后接種按實(shí)施例1方法制備的40g (濕重)的混合霉菌 菌絲體，其中黑曲霉f^pergz7/wsm'g勿和米曲霉04^ergi//^ 07加e)的重量配比為2 : 8， 然后在28'C保溫培養(yǎng)發(fā)酵55小時即可。
將獲得的液態(tài)轉(zhuǎn)化發(fā)酵物用高效液相色譜(HPLC)檢測，紅景天苷含量為1.3255%， 與同樣條件檢測的原始藥材的紅景天苷含量為0.7306%相比，經(jīng)轉(zhuǎn)化后發(fā)酵物中的紅 景天苷含量可提高81.43%。
實(shí)施例6
將100g紅景天根莖原料粉碎至80目，然后加入1.5g酵母膏、1.5g磷酸二氫鉀、 0.3g硫酸鎂和800mL升的水，攪拌混合均勻，使之成為紅景天液態(tài)水懸液，并用蒸汽 在121'C下滅菌30分鐘；冷卻后接種按實(shí)施例1方法制備的60g (濕重)的混合霉菌 菌絲體，其中黑曲霉(^^^7/1^"&^和米曲霉(^^ergz7tooo^ae)的重量配比為5 : 5， 然后在32'C保溫培養(yǎng)發(fā)酵60小時即可。
將獲得的液態(tài)轉(zhuǎn)化發(fā)酵物用高效液相色譜(HPLC)檢測，紅景天苷含量為1.3910%， 與同樣條件檢測的原始藥材的紅景天苷含量為0.7306%相比，經(jīng)轉(zhuǎn)化后發(fā)酵物中的紅 景天苷含量可提高90.39%。
實(shí)施例7
將100g紅景天根莖原料粉碎至100目，然后加入2g酵母膏、2g磷酸二氫鉀、0.4g 硫酸鎂和800mL升的水，攪拌混合均勻，使之成為紅景天液態(tài)水懸液，并用蒸汽在121°C 下滅菌30分鐘；冷卻后接種按實(shí)施例1方法制備的120g (濕重)的混合霉菌菌絲體， 其中黑曲霉^^e^7/^^g勿和米曲霉(A蘆rgz7/woo^fle)的重量配比為3 : 7，然后在 3(TC保溫培養(yǎng)發(fā)酵60小時即可。
將獲得的液態(tài)轉(zhuǎn)化發(fā)酵物用高效液相色譜(HPLC)檢測，紅景天苷含量為1.5738%， 與同樣條件檢測的原始藥材的紅景天苷含量為0.7306%相比，經(jīng)轉(zhuǎn)化后發(fā)酵物中的紅 景天苷含量可提高115.41%。
實(shí)施例8
將100g紅景天根莖原料粉碎至120目，然后加入1.5g酵母膏、1.75g磷酸二氫鉀、 0.25g硫酸鎂和800mL升的水，攪拌混合均勻，使之成為紅景天液態(tài)水懸液，并用蒸 汽在121'C下滅菌30分鐘；冷卻后接種按實(shí)施例1方法制備的160g (濕重)的混合霉 菌菌絲體，其中黑曲霉(S4^wgz7/^ w/g勿和米曲霉(^perg///^ 00^e)的重量配比為7 : 3，然后在3(TC保溫培養(yǎng)發(fā)酵48小時即可。
將獲得的液態(tài)轉(zhuǎn)化發(fā)酵物用高效液相色譜(HPLC)檢測，紅景天苷含量為1.8194%， 與同樣條件檢測的原始藥材的紅景天苷含量為0.7306%相比，經(jīng)轉(zhuǎn)化后發(fā)酵物中的紅 景天苷含量可提高149.03%。
權(quán)利要求
1、一種用微生物混合菌株制備紅景天液態(tài)轉(zhuǎn)化發(fā)酵物的方法，該方法的工藝步驟和條件為1)將紅景天根莖粉碎至60～120目；2)在每100份的紅景天粉中加入800～1000份水，0.5～2份酵母膏、0.5～2份磷酸二氫鉀和0.2～0.5份硫酸鎂，攪拌混合均勻，使之成為紅景天液態(tài)水懸液，并滅菌；3)在含紅景天粉的液體種子培養(yǎng)基中分別制備曲霉屬中的的黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)的菌絲培養(yǎng)物；4)將制備的兩種霉菌的菌絲培養(yǎng)物按重量比2～8∶8～2混合后，將混合菌絲培養(yǎng)物接種于紅景天液態(tài)水懸液中，接種量按濕重計為每100份水接種5～20份；5)將接種后的制備物在溫度28～32℃下保溫培養(yǎng)發(fā)酵48～60小時即可，以上所用物料份數(shù)均為重量份。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用微生物混合菌株制備紅景天液態(tài)轉(zhuǎn)化發(fā)酵物的方法， 該方法是將紅景天根莖粉碎至80 120目。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用微生物混合菌株制備紅景天液態(tài)轉(zhuǎn)化發(fā)酵物的方法，該方法是在每100份的紅景天粉中加入800 900份水，1 2份酵母膏、1 2份 磷酸二氫鉀和0.2 0.3份硫酸鎂，攪拌混合均勻，使之成為紅景天液態(tài)水懸液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用微生物混合菌株制備紅景天液態(tài)轉(zhuǎn)化發(fā)酵物的方法，該方法所用的菌絲培養(yǎng)物是先將粒徑為80目的紅景天粉和水按l : 10 重量份混合， 再按水的重量份計分別加入0.2%的酵母膏、0.1%的磷酸二氫鉀和0.05%的硫酸鎂，配成液體種子培養(yǎng)基，然后在液體種子培養(yǎng)基中分別接入曲霉屬(Aspergillus)中的黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)的孢子，在30℃溫度下?lián)u床培養(yǎng)2天，離心后棄去上清液，收集菌絲沉淀。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用微生物混合菌株制備紅景天液態(tài)轉(zhuǎn)化發(fā)酵物的方法， 該方法所用的菌絲培養(yǎng)物是先將粒徑為80目的紅景天粉和水按1 : IO重量份混合，再 按水的重量份計分別加入0.2%的酵母膏、0.1%的磷酸二氫鉀和0.05%的硫酸鎂，配成液體種子培養(yǎng)基，然后在液體種子培養(yǎng)基中分別接入曲霉屬(Aspergillus)中的黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)的孢子，在溫度30'C下?lián)u床培養(yǎng)2天， 離心后棄去上清液，收集菌絲沉淀。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在紅景天原藥材的液態(tài)水懸液中，用微生物混合菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化發(fā)酵以提高紅景天原藥材中活性成分的方法。該方法是將用紅景天根莖粉制成的紅景天液態(tài)水懸液，經(jīng)滅菌后接種微生物混合菌株進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)。通過本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)化發(fā)酵可使紅景天活性成分比原藥材中的活性成分大大提高，使其含量最高可比原藥材提高100％以上，因而能有效利用野生資源，同時還能減少藥渣等污染物的排量，實(shí)現(xiàn)藏中藥的保護(hù)性開發(fā)，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12P1/02GK101386870SQ200810046369
公開日2009年3月18日 申請日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者鄧小晨 申請人:四川大學(xué)