專利名稱：：構(gòu)建基因重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌應(yīng)用于乙醇發(fā)酵的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及纖維素類物質(zhì)向燃料和化學(xué)物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化，特別涉及提高運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對多種逆境的抗性、提高其發(fā)酵溫度、降低其生長的營養(yǎng)需求，同時(shí)還涉及運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌利用戊糖生產(chǎn)乙醇。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及對運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌進(jìn)行基因工程改造的方法，用于增加其對多種逆境的抗性、提高其發(fā)酵溫度、降低其生長的營養(yǎng)需求，同時(shí)還使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能利用戊糖生產(chǎn)乙醇。在高溫條件下，細(xì)胞的分解代謝能力增強(qiáng)，發(fā)酵時(shí)間縮短，生產(chǎn)能力提髙；氧溶解度降低；發(fā)酵液的粘度降低，攪拌所需動(dòng)力減少；發(fā)酵料液在滅菌后冷至適當(dāng)發(fā)酵溫度所需的時(shí)間減少。高溫發(fā)酵可以利用發(fā)酵反應(yīng)所產(chǎn)生的熱量，省去傳統(tǒng)發(fā)酵所需要的大量冷卻水；高溫發(fā)酵有利于提高發(fā)酵效率和乙醇的分離。每一種生物有一個(gè)耐熱極限溫度域值一超過這一溫度，生物就將死亡。生物的耐熱溫度域值可能由一系列的條件所決定例如細(xì)胞膜的組成和參與生命基本活動(dòng)的酶系的穩(wěn)定性。將生物置于亞致死熱狀態(tài)，可以使其獲得額外的穩(wěn)定的熱耐受力。這種"熱耐受"被認(rèn)為來源于亞致死高溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的熱休克蛋白(HSP)。針對提髙的溫度，所有的生物均能特異性地誘導(dǎo)表達(dá)一系列新的熱休克蛋白HSPS。HSPS的功能特點(diǎn)來源于其分子伴侶樣作用一促進(jìn)蛋白的折疊、預(yù)防性地抑制其它蛋白的變性、介導(dǎo)蛋白的降解。除了用熱壓力以外，許多HSP能用其它方式進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)生，包括用亞砷酸鹽、乙醇、重金屬、氨基酸類似物fL的，ete/.,WanfW，ysto力0:240"48,W96〗。正常細(xì)胞也可以在無壓力(而不是因?yàn)闊釅毫?狀態(tài)下，產(chǎn)生與HSP保守序列相關(guān)的同類物。HSPJI供逆境抗性的機(jī)制，是基于HSP具有促進(jìn)蛋白形成髙級結(jié)構(gòu)(蛋白折疊)的功能。也就是說，HSP能夠與因逆境而變性而變得無法形成正確高級結(jié)構(gòu)的蛋白結(jié)合，將其折疊成正確的高級結(jié)構(gòu)，恢復(fù)該蛋白的正常功能。大量的研究結(jié)果表明，多種熱休克蛋白，通過預(yù)防蛋白聚集，賦予細(xì)菌在其極限生存溫度以上繼續(xù)生存的能力。因此，熱休克蛋白應(yīng)該有可能用于提高細(xì)菌的培養(yǎng)溫度、發(fā)酵產(chǎn)量、以及應(yīng)用于其它多種多樣的生物處理過程。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌最早是Linder于1924年從龍舌蘭酒中分離得到的。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌為革蘭氏陰性、厭氧細(xì)菌，能夠耐一定的氧氣。與其他微生物相比.該菌代謝途徑相對簡單，沒有多種可供選擇的代謝途徑。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌通過ED途徑專一代謝葡萄糖、果糖、蔗糖。利用葡萄糖和果糖時(shí)，能夠得到近似理論產(chǎn)量的乙醇，單糖的利用效率極高。該菌具有高耐糖能力(400g/L),髙耐乙醇能力(100g/L)、低生物量和高乙醇收率。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌乙醇發(fā)酵時(shí)，磷酸化的葡萄糖經(jīng)ED途徑產(chǎn)生丙酮酸，再脫羧還原為乙醛，繼而再還原形成乙醇；而酒精酵母發(fā)酵時(shí)，葡萄糖經(jīng)EMP途徑生成了丙酮酸。EMP與ED途徑相比，EMP途徑1M葡萄糖可生成2MATP,而ED途徑只生成1MATP。相同的菌體量所消耗的葡萄糖，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌比酵母少，因此運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌發(fā)酵的乙醇得率高。長期以來人們已經(jīng)知道，培養(yǎng)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌需要添加賴氨酸、甲硫氨酸和一些維生素。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌全基因組序列的測定結(jié)果，揭示了這些缺陷的具體原因。對于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，合成賴氨酸和合成甲硫氨酸唯一缺失的基因分別為yfdz和me氾，通過從另一個(gè)來源引入這些基因，用yft(z和meffl的基因序列重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，將可以使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌獲得自行合成賴氨酸和甲硫氨酸的能力，可以降低其生長過程的營養(yǎng)要求。原核生物大多數(shù)基因表達(dá)調(diào)控是通過操縱子機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。除個(gè)別基因外，原核生物絕大多數(shù)基因按功能相關(guān)性成簇地串聯(lián)、密集于染色體上，共同組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位一操縱子，如乳糖(lac)操縱子、阿拉伯糖(ara)操縱子及色氨酸(trp)操縱子等。操縱子機(jī)制在原核基因調(diào)控中具有較普遍的意義。一個(gè)操縱子經(jīng)常含數(shù)個(gè)可轉(zhuǎn)錄的編碼基因(通常為2~6個(gè)，有的多達(dá)20個(gè)以上)。在同一操縱子可轉(zhuǎn)錄出多順反子mRNA。轉(zhuǎn)座子是一段可以在轉(zhuǎn)座酶的催化下，在DNA分子上"跳躍"或者轉(zhuǎn)移位置的DNA序列。利用轉(zhuǎn)座子進(jìn)行轉(zhuǎn)座的技術(shù)已經(jīng)非常成熟，轉(zhuǎn)座的技術(shù)可以將目的片段隨機(jī)插入耙位點(diǎn)中，進(jìn)行測序、誘導(dǎo)突變和缺失、基因表達(dá)調(diào)控等等。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可以簡單快速而又可靠的在體內(nèi)外應(yīng)用，高效地產(chǎn)生大于10e的插入克隆。轉(zhuǎn)座的插入隨機(jī)，不受克隆DNA中預(yù)置的限制性酶切位點(diǎn)制約，3轉(zhuǎn)座子的獲得并不需要預(yù)先知道宿主細(xì)胞染色體的基因組和蛋白質(zhì)組的信息。本專利涉及構(gòu)建可以在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌內(nèi)表達(dá)的多順反子操縱子，用多順反子操縱子重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌基因。操縱子包含編碼至少一種熱休克蛋白的基因序列，用于增加運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對逆境的耐受性和提高發(fā)酵溫度；操縱子包含編碼至少一種微生物的賴氨酸合成代謝酶ywz的基因序列，包含編碼至少一種甲硫氨酸合成代謝酶me氾的基因序列，用于降低運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生長過程中對培養(yǎng)物的營養(yǎng)要求；多順反子操縱子包含編碼至少一組使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能利用戊糖生成乙醇的基因序列，使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能利用戊糖生產(chǎn)乙醇。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明包括，構(gòu)建可以在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的操縱子，采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、DNA轉(zhuǎn)座的技術(shù)，向運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌體內(nèi)導(dǎo)入以上操縱子，使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對逆境的耐受性增加、能在較高的溫度下發(fā)酵生成乙醇、對培養(yǎng)物的營養(yǎng)要求降低、同時(shí)還能利用戊糖生成乙醇、經(jīng)過200次傳代仍然穩(wěn)定保留上述遺傳特點(diǎn)。本發(fā)明涉及構(gòu)建在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)多順反子操縱子，至少包括一種下列的操縱子其一是包含編碼熱休克蛋白的操縱子，該操縱子能增加運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對多種逆境的抗性，提髙運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的發(fā)酵溫度；其二是包含編碼賴氨酸和甲硫氨酸合成代謝酶的多順反子操縱子，該操縱子能使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌獲得賴氨酸和甲硫氨酸的能力，降低其生長所需添加的營養(yǎng)成分。其三是包含編碼利用戊糖分解與代謝酶的多順反子操縱子，該操縱子能使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能利用戊糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明還提供了構(gòu)建轉(zhuǎn)座子的方法，使外源多順反子操縱子穩(wěn)定插入細(xì)菌的基因組。在一些實(shí)施例中，轉(zhuǎn)座子包括①至少一個(gè)可以在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中調(diào)控結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的啟動(dòng)子的編碼序列；②至少一個(gè)酶結(jié)構(gòu)基因的編碼序列，所述酶至少包含HSP、meffl、yfcfe、xy舊4、araEAD、man/LTAL/7K沖的一種；③一對反向插入序列。編碼序列①和編碼序列②位于插入序列之間。經(jīng)過轉(zhuǎn)座改進(jìn)的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株，在非選擇培養(yǎng)基中(即缺乏抗生素)，能夠穩(wěn)定的表達(dá)所編碼酶的結(jié)構(gòu)基因。本發(fā)明還提供一種構(gòu)建穿梭質(zhì)粒的方法，該穿梭質(zhì)粒攜帶目的多順反子操縱子經(jīng)過轉(zhuǎn)化，進(jìn)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌體內(nèi)。在一些實(shí)施例中，穿梭質(zhì)粒包含至少一個(gè)具有編碼酶結(jié)構(gòu)基因的操縱子，所述酶至少包含HSP、mefS、yf也、xy舊yA、araftA。、man/UTAi/TKT中的一種；具有至少一個(gè)可以在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中調(diào)控結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的啟動(dòng)子的編碼序列。經(jīng)過穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株，能穩(wěn)定的表達(dá)結(jié)構(gòu)基因，快速生成特定產(chǎn)物并具有較高的轉(zhuǎn)化效率。具體實(shí)施方法在構(gòu)建可在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中表達(dá)的操縱子的過程中，細(xì)菌培養(yǎng)、細(xì)菌染色體DNA的提取、DNA片段的回收純化、質(zhì)粒DNA的提取、PCR、DNA的酶切、連接、轉(zhuǎn)化等參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》(.J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾，著黃培堂等譯北京，科學(xué)出版社.)進(jìn)行。具體實(shí)施方法一啟動(dòng)子基因的克隆(構(gòu)建過程示意圖，見圖1)1、可被運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌識別的啟動(dòng)子的克隆(以啟動(dòng)子g鄰為例)①運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在含有1"i4的酵母提取物、0.2%的磷酸二氫鉀、5。/4的葡萄糖、30'C、C02環(huán)境中，緩慢搖動(dòng)混勻。培養(yǎng)5ml的細(xì)菌培養(yǎng)物至飽和狀態(tài)。取1.5mL的培養(yǎng)物離心2分鐘。沉淀物加入500ijL的TE緩沖液，用吸管反復(fù)吹打使之重懸。加入3(HiL10W的SDS和3ijL20mg/mL的蛋白酶K,混勻，37'C溫育1小時(shí)。加入100jjL5mol/LNaCI,充分混勻，再加入80(jLCTAB/NaCI溶液，混勻，于65'C溫育10分鐘。加入等體積的氯仿/異戊醇混勻。離心45分鐘。將上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新管中，如果難以移出上清.先用牙簽除去界面物質(zhì)。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，離心，將上清液轉(zhuǎn)入一只新管中。加入O.6體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，離心5分鐘后棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。離心5分鐘，棄上清，用凍干機(jī)稍加干燥，重溶于10(HjL的te緩沖液，在紫外檢測儀上，檢查染色體dna的純度，00欲/00280大于1.8。②以第1步獲得的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌染色體DNA為模板，加入g鄰啟動(dòng)子上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增使用lnvitrog胡公司的高保真KODDNA聚合酶，反應(yīng)條件為預(yù)變性94'C，5分鐘；變性溫度94'C，45秒，復(fù)性溫度45。C,30秒，延伸溫度為72'C，45秒，循環(huán)30次，最后72'C延伸10分鐘。獲得長度為310bp的g鄰啟動(dòng)子基因片段。其中，上游引物的5'端加上BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物的5'端加上EcoRI、Pacl、Hindll鵬切位點(diǎn)。上游引物5'GGTGG4rCCAGATCTGTTCGATCAACMCCCGAATC3'下游引物5'A/WWGC7T7TA47T/WGGAG/W7TCCTMCTTATTAAGTAGCTATTATATTC③將PCR擴(kuò)增獲得的310bp的g鄰啟動(dòng)子基因和載體pUC19質(zhì)粒均用BamHI和EcoRI酶切后連接，克隆gap啟動(dòng)子至!jpUC19的BamHI和EcoR鵬切位點(diǎn)間，獲得質(zhì)粒pUC"pra。在具體實(shí)施結(jié)構(gòu)基因的克隆過程中，pUC-pra作為載體被反復(fù)使用。g鄰啟動(dòng)子基因的基因序列為1GTTCGATCMCAACCCGAATCCTATCGTAATGATGTTTTGCCCGATCAGC51CTCAATCGACMTTTTACGCGTTTCGATCGMGCAGGGACGACAATTGGC101TGGGAACGGTATACrGGAATAAATGGTCTTCGTTATGGTATTGATGmT151TGGTGCATCGGCCCCGGCGAATGATCTATATGCTCATTTCGGCTTGACCG201CAGTCGGCATCACGAACMGGTGTTGGCCGCGATCGCCGGTAAGTCGGCA251CGTTAAAAAATAGCTATGGMTATAATAGCTACTTAATAAGTTAG④在不影響本發(fā)明結(jié)果的條件下，操縱子啟動(dòng)子基因至少包含下列13種啟動(dòng)子中的一種。13種啟動(dòng)子均以同樣的方法，首先用PCR擴(kuò)增獲得啟動(dòng)子基因，用BamHI和EcoRI酶切后，克隆啟動(dòng)子到pUC19的BamHI和EcoR,切位點(diǎn)間。表一,克隆于pUC19的B抓HI和EcoRI之間的啟動(dòng)子<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>具體實(shí)施方法二結(jié)構(gòu)基因的克隆1、結(jié)構(gòu)基因--熱休克蛋白基因的克隆(構(gòu)建過程示意圖，見圖2)能在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中表達(dá)、結(jié)構(gòu)基因?yàn)闊嵝菘说鞍椎牟倏v子，導(dǎo)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌內(nèi)可以增加運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對多種逆境的抗性和乙醇的產(chǎn)量。具體實(shí)施時(shí)，在不影響本發(fā)明結(jié)果的條件下，操縱子結(jié)構(gòu)基因HSP包含至少一種下列熱休克蛋白HSP,用于增加運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的逆境耐受性YP_446459;P_446432;ABC46256;ABC44504;AF256212;AAV48030;AAZ73229;NP_962635;AAS06251;YP—195752;AAW02711;NP—839948;AAB28591;AAB28590;NP—853922;CAD93121;NP—214765;CAA17343;YP_976387;CAL70273;YP—001281539;YP—001126179;YP—336589;YP_905227;NP_049441;ABQ71977;AB067434;ABL03756;YP—567053;BAE93221;ABA51979;ABX60218;ABD92701;ABD59337;ABD59336;ABD59335;AAK06409;AAK06407;AAB07020;YP_467916;YP—332976:YP_764249;YP_446459;YP_446432;YP—083624;YP—083635;YP—036374;YPJ36363;ED091691;EDO84610;CAD97602;AB舊3612;CAJ71923;CAJ71313;CAJ71312;CAJ72872;&AJ73635;ABC89189;ABC46256;ABC44504;NP—919293;NP—051028;NP—051024;ABA49980;AAU18224;MU18212;AAT62212;AAT59777;AAQ75170;AAL32036:AAF04361:AAF04359:AAF04352;AAD39038;NP—057878;NP—001036984;CAC30748;CAM63543;ZP—02551251;ZPJ)2249597;NP_302218;XP—952848;YP—0012861的；P42930;ABR04597;EBA44254;ABC46712;EAY61697;CAA27525;BAD74195;CAI76223;CM61675;CAA27527:BAB09509;CM25731;AAN87003;P0A5B7:P19036;P04792;P14602;Q03928;P12809;P13853;P19037;Q3T149;Q5S1U1;013224;P42929;Q00649;P15991;Q08275;P0A5B8;P12810;Q05832;P19243:P05478:P04795;P04794;P04793;P02519;Q53595;P42931;P02513;P34696;NP—001532;NP—569115;035878:AAZ42349:AAB82758;M朋2757:NPJ14176;NP—038588;NP一001069495;NPJ)01105583;NP—855707;NP一2化547;2BYU—L;2BYU—K;2BYUJ:2BYUJ;2BYU—H;2BYU_G;2BYU—F;2BYU一E;2BYU一D;2BYU—C.2BYU—B;2BYU—A:RNPJ)01007519:BAF79634;ZP—01502473;EAU97838;CM17245;ABK34454;AAB29536;AAB29956;CAD96910;AAK54445;CM92771;CM92770;P06581;P06582:YP—951151;Q96331;YP—092046;YP—637434;ABW89472;ABW89471;ABW89470;ABW89469;ABW89468;ABW89467;P34328;ABM11145;ABG06378;ABV68944;ABV68943;030851;P04120;ABC68342;NP—200780;NPJ90209;NP—175759:ABC41131;ABA29610;cm25732:abf01017;bae94664;aas68347;caa72613:5aA67022;caa67206;caa65020;aar01534;MR01533;AAR01532;AAR01531;AARO纖AAR01529;AAR01528;AAR01527;MR01526;MR01525;AAR01524;AAR01523;AAR01522;AAR01521:AARO跳AAR01519;AAR01518;AAR01517;AAR01516;MR01515;AAR01514;AAR01513;AAR01512;AAR01511:AAR01510;AAR01509;MR01508;AAR01507;AAR01506;MR01505:AAR01504;AAR01503;AAR01502;AAR01501;AAR01500;CAB55634;AAU41353;CM26348;CAA26347:AAM90297;AM33477:AAG00233:AAC36312:AAB38795;CM45902;AAA34294;Q16082;NP—179521:AAC49861;MC79726:YP—008803;ABV48740;AB032163;CAF24528;BAB40930;NP—010456;NP—009628;MQ19681;AAQ19680;NPJ)01876;NP—000385;YP—109512;NP—394323;ABJ55914;NP—190209;ABO60880;ABJ55915;AAS82861:BAD91165;BAD91164;AAY78951;CAH36928;CAC11993;CAC69546:CAC33095:CAA12389;CAE48491。以AF256212為例進(jìn)行熱休克蛋白結(jié)構(gòu)基因的克隆，AF256212編碼fyococcusfurfosus的小分子熱休克蛋白。具體步驟如下①從ATCC購買/yococcusft/riiwusDSM3638,按照(AppliedandEnvironmentalMicrobiotogy,Aug.1989，p.2086-2088)的方法，在人工海水中加入0.1%的酵母提取物和0.5°/4胰蛋白胨。98'C環(huán)境中，培養(yǎng)50mL的細(xì)菌培養(yǎng)物至飽和狀態(tài)。取10mL的培養(yǎng)物離心2分鐘。沉淀物加入500(JL的TE緩沖液，用吸管反復(fù)吹打使之重懸。加入30pL10X的SDS和3yL20mg/mL的蛋白酶K,混習(xí)，37'C溫育1小時(shí)。加入100(JL5mol/LNaCI,充分混勻，再加入80pLCTAB/NaCI溶液，混勻，于65'C溫育10分鐘。加入等體積的氯仿/異戊醇.混勻。離心45分鐘。將上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新管中，如果難以移出上清.先用牙簽除去界面物質(zhì)。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，離心，將上清液轉(zhuǎn)入一只新管中。加入O.6體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，離心5分鐘后棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。離心5分鐘，棄上清，用凍干機(jī)稍加干燥，重溶于100(JL的TE緩沖液，在紫外檢測儀上，檢査染色體DNA的純度。OD26o/OD加大于1.8。②以第1步獲得的Pjwcoccusfiiribsus染色體DNA為模板，加入編碼Pyrococcusfuriosus的小分子熱休克蛋白AF256212的上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增使用lnvitrogen公司的高保真KODDNA聚合酶，反應(yīng)條件為預(yù)變性94'C，5分鐘；變性溫度94'C，45秒，復(fù)性溫度45'C，45秒，延伸溫度為72'C，90秒，循環(huán)30次，最后72'C延伸10分鐘。獲得長度為0.5kb的pfu-sHSP基因片段。其中，上游引物的5'端加上EcoRI酶切位點(diǎn)以及SD序列(SD序列為在起始密碼子ATG上游9"13個(gè)核苷酸處，可與核糖體16SrRNA配對結(jié)合的、富含嘌呤的3-9個(gè)核苷酸的一段共同序列，一般為AGGA。)下游引物的5'端加上Pacl酶切位點(diǎn)。上游引物5'GGTGAA7TCGAGGMGAAATGGTGAGGAGAATAAGAAG3'上游弓l物5'GGTGG4rCCG/iGGMGAAATGGTGAGGAGMTAAGAAG3'下游引物5'AAATnVW77VWTTMGATCTGAGTTCAACTTTAACTTCG3'將PCR擴(kuò)增獲得的長度為0.5kb的pfu-sHSP基因片段和載體pUC19"pro質(zhì)粒用EcoRI和Pac膀切后，克隆到pUC-pro的EcoRI和Pac嗨切位點(diǎn)間；或克隆到pUOpra的BamH兩Pac瞎切位點(diǎn)間。對于結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)部有EcoRI、BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基因，采用德國默克公司QuikChang幼系列定點(diǎn)突變試劑盒進(jìn)行PCR定點(diǎn)誘變(Dpn瞎)，定點(diǎn)誘變?nèi)サ艚Y(jié)構(gòu)基因上所有的EcoRI、BamH和Pacl酶切位點(diǎn)而不改變結(jié)構(gòu)基因編碼的原有氨基酸序列。經(jīng)過DNA測序，克隆pfu-sHSP編碼的蛋白序列為MVRRIRRWDIM3PFDI<IREIQEEIDAMFDEFFSRPRLWTYRRWSEPAMYE50ERVGEVWREPFVDIFDNO)EFV1TAEIiPGVRKEDIKVRVTEDTVYIEATV100KREKELEREGAVRIERYFTGYSRAIRLPEEVIPEKAKAKYNMGVLEIRVP150KKHPTKKESEGFEVKVELEIL2、結(jié)構(gòu)基因--yfdz基因的克隆(構(gòu)建過程示意圖，見圖3)能在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中表達(dá)、結(jié)構(gòu)基因?yàn)閥fdz的操縱子，導(dǎo)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌內(nèi)使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌可以自行合成賴氨酸，用于降低運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生長過程中對培養(yǎng)物的營養(yǎng)要求。具體實(shí)施時(shí)，在不影響本發(fā)明結(jié)果的條件下，操縱子結(jié)構(gòu)基因包含至少一種下列轉(zhuǎn)羥乙醛酶賴氨酸合成代謝酶yfdz(EC2,6.1,):A3YKL6—CAMJE;A5舊V0—LEGPC:A6TC30—KLEP7:A9(QS1—9B0RD;Q0TF81—ECOL5;Q57LV1一SALCH;Q5PNF6_SALPA;Q5ZVI1—LEGPH;FE4—ECOL6。以i.coliK12的yfdz為^，進(jìn)行yfdz結(jié)構(gòu)基因的克隆&具體步驟如下0^.0)111<12在含有1%的酵母提取物，0.5%胰蛋白胨，1。/。氯化鈉中，37'C環(huán)境中，200rpm搖動(dòng)，過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)5ml的細(xì)菌培養(yǎng)物至飽和狀態(tài)。取1.5mL的培養(yǎng)物離心2分鐘。沉淀物加入50(HiL的TE緩沖液，用吸管反復(fù)吹打使之重懸。加入30pL10X的SDS和3jjL20mg/mL的蛋白酶K,混習(xí)，37'C溫育1小時(shí)。加入100pL5mol/LNaa充分混勻，再加入80pLCTAB/NaCI溶液，混勻，于65'C溫育10分鐘。加入等體積的氯仿/異戊醇.混勻。離心45分鐘。將上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新管中，如果難以移出上清.先用牙簽除去界面物質(zhì)。加入等體積的鼢/氯仿/異戊醇，混勻，離心，將上清液轉(zhuǎn)入一只新管中。加入O.6體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，離心棄上清。用70%乙醇洗漆沉淀。離心5分鐘，棄上清，用凍干機(jī)稍加干燥，重溶于100pL的TE緩沖液，8)在紫外檢測儀上，檢查染色體DNA的純度，OD26o/OD加大于1.8。②以第1步獲得的E.coli染色體DNA為模板，加入yftte上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增使用lnvitrogen公司的高保真KODDNA聚合酶，反應(yīng)條件為預(yù)變性94'C,5分鐘；變性溫度94'C,45秒，復(fù)性溫度45'C,45秒，延伸溫度為72'C,90秒，循環(huán)30次，最后72'C延伸10分鐘。獲得長度為1.2kb的yfdz基因片段。其中，上游引物的5'端加上EcoRI酶切位點(diǎn)以及SD序列(在起始密碼子ATG上游9-13個(gè)核苷酸處，一段可與核糖體16SrRNA配對結(jié)合的、富含嘌呤的3-9個(gè)核苷酸的共同序列，一般為AGGA，此序列稱SD序列。)下游引物的5'端加上Pacl酶切位點(diǎn)。上游引物5'GGTGAATTCGAGGMGAAATGGCTGACACTCGCCCTG3'上游引物5'GGTGGATCCGAGGMGAAATGGCTGACACTCGCCCTG3'下游引物5'AAAT7TAA7TM/lGArcrcCGCGTnTCGTGAATATGTTTG3'將PCR擴(kuò)增獲得的長度為1.2kb的yfdz基因片段和載體pUC19-pro質(zhì)粒用EcoRI和Pac瞎切后，克隆yfdz基因到pUC"pro的EcoR和Pac瞎切位點(diǎn)間；或克隆yfdz基因到pUOpro的BamH兩Pac瞎切位點(diǎn)間。對于結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)部有EcoRI、BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基因，采用德國默克公司QuikChang總系列定點(diǎn)突變試劑盒進(jìn)行PCR定點(diǎn)誘變(Dpnl法)，定點(diǎn)誘變?nèi)サ艚Y(jié)構(gòu)基因上所有的EcoRI、BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)而不改變結(jié)構(gòu)基因編碼的原有氨基酸序列。經(jīng)過DNA測序，克隆yfdz編碼的蛋白序列為MADTRPERRFTRIDRLPPYVFNITAELKMAARRRGEDIIDFSM6NPDGAT50PPHZVEKLCTVAQRPDTHGYSTSRGIPRLRRAISRWYQDRYDVEIDPESE100AIVTIGSKEGLAHUlLATLDHGDTVLVFNPSypiHIYGAVIAGAQVRSVP150LVE6VDFFNELERAIRESYPKFKMMILGFPSNPTAQCVELEFF&KVVALA200KRYDVLWHDLAYADIVYDGWKAPSIMQVPGARDVAVEFFTLSKSYNMAG250冊IGFMVGNKTLVSALARIKSYHDYGTFTPLQVAAIAALEGDQQCVRDIA200EQYKRRRDVLVKGLHKAGWMVEMPI0VSMXWAKIPEPYAAM8SLEFAKKL350LNEAKVCVSPGIGFCTnfGDTHVRFALIENRDRIRQAIRGIKAMFRADGLL400PASSKHIHENAE3、結(jié)構(gòu)基因一me舊基因的克隆(構(gòu)建過程示意圖，見圖4)能在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中表達(dá)、結(jié)構(gòu)基因?yàn)閙e氾的操縱子，導(dǎo)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌內(nèi)使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌可以自行合成賴氨酸。具體實(shí)施時(shí)，在不影響本發(fā)明結(jié)果的條件下，操縱子結(jié)構(gòu)基因包含至少一種下列轉(zhuǎn)羥乙醛酶甲硫氨酸合成代謝酶me氾[EC42的g使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能夠自行合成甲硫氨酸，用于降低運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生長過程中對培養(yǎng)物的營養(yǎng)要求P38675,M￡T7_NEUCR;0743",MET7—SCHPO;P47164,MET7—YEAST;P55217,METB_ARATH;P00935,METB一ECOLI:P44502,METB一HAEIN;09ZMW7.METB_HELPJ;P56069,METB_HELPY;P24601,METB—HERAU;P66876,METB—MYCBO;P46807,METB_MYCLE;P66875,METB_MYCTU;Q12198,METW_YEAST;Q04533,METX一YEAST參照結(jié)構(gòu)^因yfdz基因的克隆的方法，具體實(shí)施時(shí)，合成me氾上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增獲得的me氾基因片段和載體pUC19-pro質(zhì)粒用EcoRI和Pac瞎切后，克隆yfdz基因到pUC-pro的EcoRI和Pac鵬切位點(diǎn)間；或克隆基因到pUC-pro的BamHI和Pad酶切位點(diǎn)間。對于結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)部有EcoRI、BamH湘Pac鸝切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基因，采用德國默克公司QuikChang勸系列定點(diǎn)突變試劑盒進(jìn)行PCR定點(diǎn)誘變(Dpnl法)，定點(diǎn)誘變?nèi)サ艚Y(jié)構(gòu)基因上所有的EcoRI、BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)而不改變結(jié)構(gòu)基因編碼的原有氨基酸序列。以E.coliK12的me舊為例，進(jìn)行me舊結(jié)構(gòu)基因的克隆上游引物5'GGTGM7TCGAGGMGAMTGACGCGTAAACAGGCCACC3'上游引物5'GGTGG4rCCG/AGGMGAAATGACGCGTAMCAGGCCACC3'下游引物5'AAAT77VW7T/UWG/irc7TrACCCCTTGTTTGCAGCCCGGMG3'將PCR擴(kuò)增獲得的長度為1.2kb的me舊基因片段和載體pUC19-pra質(zhì)粒用EcoRI和Pacl酶切后，克隆metB基因到pUC-pro的EcoR兩Pac瞎切位點(diǎn)間或克隆me氾基因到pUC"pro的BamH和Pac鵬切位點(diǎn)間。對于結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)部有EcoRI、BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基因，采用德國默克公司QuikChangeS系列定點(diǎn)突變試劑盒進(jìn)行PCR定點(diǎn)誘變(Dpnl法)，定點(diǎn)誘變?nèi)サ艚Y(jié)構(gòu)基因上所有的EcoRI、BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)而不改變結(jié)構(gòu)基因編碼的原有氨基酸序列。經(jīng)過DNA測序，克隆metB編碼的蛋白序列為MTRKQATIAVRSGLNDDEQY6CWPPIHLSSTYNFTGFNEPRAHDYSRRG50仰TRDWQRALAELEGGAGAVLTNTGMSAIHLVTTVFLKP6DLLVAPHDC100Y6GSYRLFDSLAKRGCYKVLFVDQ(a3EQALRAALAEKPKLVLVESPS仰L150LRWDIAKICHLAREVGAVSWDNTFLSPALQNPLALGADLVLHSCTKYL200NGHSDWAGWIAKDPDWTELA柳AMMIGVTGGAFDSYLLLRGLRTLVP250BMELAQBNAiQAIVICrLQTQPLVKKLYHPSIiPENQG腿IAARQQKGFGAML200SFELD③EQTLRRFLGGLSLETLAESLG6VESLISHAATMTHAGMAPEAR350AAAGISETLLRISTGIEDGEDLIADLENGFRAANKG4、結(jié)構(gòu)基因一-五碳糖代謝相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的克隆(構(gòu)建過程示意圖，見圖5)可以在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中表達(dá)，由8個(gè)結(jié)構(gòu)基因xylA、xy舊、araA、araB、araD、manA、TAL、TKT共同構(gòu)成的操縱子，賦予運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌同時(shí)利用木糖、阿拉伯糖和甘露糖產(chǎn)生乙醇的能力。編碼戊糖利用和代謝酶的基因序列，包括有關(guān)木糖分解的2個(gè)基因、有關(guān)阿拉伯糖分解的3個(gè)基因、有關(guān)甘露糖分解的l個(gè)基因、有關(guān)戊糖磷酸化途徑的2個(gè)基因。有關(guān)木糖分解的2個(gè)基因?yàn)閤ylA(xyloseisomerase,木糖異構(gòu)酶，E.C.5.3.1.5)和Xyffi(xylulosekinase,木酮糖激酶，EC2.7丄17):有關(guān)阿拉伯糖分解的3個(gè)基因?yàn)閍raA(L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，EC5,3丄4)、araB(L-核酮糖激酶，EC3丄U5)、araD(L-核酮糖-5-磷酸斗差向異構(gòu)酶，EC4.2.1.43);有關(guān)甘露糖分解的基因?yàn)閙anA(甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶，EC5.3.1.8);有關(guān)戊糖磷酸化的2個(gè)基因?yàn)門AL(transaldolase,轉(zhuǎn)二羥丙酮基酶，￡02.2.1.2)和710\&加3&改01肪6,轉(zhuǎn)羥乙醛酶，EC2.2.1.1)}。①具體實(shí)施時(shí)，如圖5所示，構(gòu)建利用戊糖生成乙醇的操縱子時(shí)，在不影響本發(fā)明結(jié)果的條件下，操縱子結(jié)構(gòu)基因包含至少一種下列木糖異構(gòu)酶XYLA(Xyloseisomerase,E.C.5.3.1.5):Q8PLL9,XYLA1—XANAC;Q4UTU6,XYLA1_XANC8;Q8P9T9,XYLA1—XANCP;Q5GYQ7，XYLA1_XANOR;Q8PEW5,XYLA2_XANAC;Q4UNZ4，XYLA2一XANC8;Q8P3H1,XYLA2_XANCP;Q5GUF2，XYLA2一XANOR;P12851,XYLA—ACTMI;A3N3K2，XYLA—ACTP2;A6VLM8,XYLA_ACTSZ;Q8U7G6，XYLA_AGRT5;P10654,XYLA—AMPSP;Q9FKK7,XYLA—ARATH;A0JXN9，XYlJ—ARTS2;P12070,XYLA—ARTS7;A7Z522,XYLA—BACA2;Q739D2,XYLA一BACC1;Q5LCV9,XYLA—BACFN;Q64U20,XYLA一BACFR;Q9K993,XYLA_BACHD;P77832,XYLA—BACLD;008325，XYLA_BACME;A8FE33,XYLA_BACP2;Q5WKJ3,XYLA—BACSK;P54273,XYLA_BACST;P04788,XYLA—BACSU;P54272,XYLA_BACSW;08A9M2,XYLA—BACTN;A6L792,XYLA—BACV8;A1A關(guān)，XYLA—BIFAA;Q8G3Q1,XYLA_BIFLO;Q89VC7,XYLA—BRAJA:Q2YMQ2,XYLA—BRUA2:Q57EI4,XYLA_BRUAB;08YFX5,XYLA_BRUME;A5VPA1,XYLA_BRU02;Q8G204,XYLA_BRUSU;Q1BG90,XYLA—BURCA;A0KE56,XYLA_BURCH;Q0B1U7,XYLA—BURCM;Q2SW40,XYLA一BURTA;A4JSU5,XYLA—BURVG;Q13RB8,XYLA_BURXL;8A5CPC1,XYLA_CLAM3;P29441,XYLA—CLOTS;A7ZTB2,XYLA一EC024;Q7A9X4,XYLA—EC057;A8A623,XYLA_ECOHS;Q0TBN7,XYLA一ECOL5:Q8FCE3，XYLA—ECOL6;TO0944,XYLA_ECOLI:A4W5明，XYLA—ENT38;Q7C3R3,XYLA—ENTFA;A7MNI5,XYLA—ENTS8;Q6DB05.XYLA_ERWCT;Q6T6K9,XYLA—FERGO:Q5KYS6,XYLA—GEOKA;A4IP67,XYLA—GEOTN;Q4QLI2,XYLA一圖8;A5UCZ3，XYLA—HAEIE;A5匿，XYLA—HAEIG;P44398,XYLA_HAEIN;Q40082,XYLA_HORVU;P29442,XYLA—KLEPN;Q03TX3,XYLA—LACBA;P29443,XYLA—LACBR;Q9CFG7,XYLA—LACLA;P21938,XYLA_LACPE;A0AF79,XYLA—LISW6;Q65PY0,XYLA一國SM;Q11EH9.XYLA一MESSB;Q2GAB9,XYLA—NOVAD;Q8ELU7,XYLA_OCEIH;A6X4G3,XYLAJXHA4;Q03HN1,XYLA—PEDPA;Q7N4P7,XYLA—PHOLL;06,,XYLA_PHOPR;Q48J73,XYLA_PSE14;Q15PG0,XYLA—PSEA6;Q3KDW0,XYLA—PSEPF;Q880Z4,XYLA—PSESM;Q4ZSF5,XYLA—PSEU2;Q2K433.XYLA_RHIEC;Q1MBL8,XYLA—RHIL3;Q98CR8,XYLA—RHILO;Q92LW9.XYLA—RHIME;Q7UVG2,XYLA—RHOBA;A3PNM4,XYLA—RHOS1;Q3瞧，XYLA—RHOS4;A4WVT8,XYLA—RHOS5;Q162B6,XYLA—ROSDO;Q9S306,XYLA_RUMFL;Q57IG0,XYLA—SALCH;Q5PLM6,XYLA—SALPA;Q7C637,XYLA_SALTI;Q8ZL90,XYLA—SALTY;A8G7W8,XYLA_SERP5:Q31V53,XYLA—SH舊S:Q3YW0,XYLA一SHISS;Q5LV46,XYLA—SILPO;01GKQ4,XYLA—SILST;A6UD89,XYLA_SINMW;Q022S9,XYLA_SOLUE;P27157,XYLA_STAXY;P24299,XYLA—STRAL;Q93HF3.XYLA—STRAW;Q9S3Z4.XYLA—STRCK;Q9L0B8,XYLA—STRCO;P50910.XYLA—STRDhQ9RFM4,XYLA_STRLI;P37031,XYLA_STRMR;Q93RJ9,XYLA—STROI;P15587,XYLA_STROL;P22857,XYLA—STRRO;P24200,XYLA—STRRU;P19149,XYLA—STRS8;Q9L558,XYLA—STRTM;P14405,XYLA—STRVN;TO9033,XYLA—STRVO;082845，XYLA—TETHA;P56681,XYLA—THECA:P22842,XYLAJ"HEET;Q9X1Z5,XYLAJ"HEMA;P45687,XYLA—THENE:A5ILR5,XYLA—THEP1;P30435,XYLA—THESA:P26997,XYLA—THET8;P19148,XYLAJ"HETU;Q9KGU2,XYLA—THEYO;Q3BMF2,XYLA_XANC5;Q2NXR2，XYLA一XA,;A1JT10,XYLA—YERE8;A7FP68,XYLA—YERP3;Q1C0D3,XYLA—YERPA;Q8Z9Z1,XYLA—YERPE;Q1CDB8,XYLA—YERPN;A4TS63,XYLA—YERPP;Q663Y3,XYLA—YERPS。參照結(jié)構(gòu)基因yfdz基因^克隆的方法，具體實(shí)施W,合成XYLA上下游弓I物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增獲得的XYLA基因片段和載體pUC19-pro質(zhì)粒用Ecom和Pacl酶切后，克隆XYLA基因到pUC-pro的EcoRI和Pac瞎切位點(diǎn)間；或克隆基因到pUC-pra的BamHI和Pad酶切位點(diǎn)間。對于結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)部有EcoRI、BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基因，采用德國默克公司QuikChange⑧系列定點(diǎn)突變試劑盒進(jìn)行PCR定點(diǎn)誘變(Dpnl法)，定點(diǎn)誘變?nèi)サ艚Y(jié)構(gòu)基因上所有的EcoRI、BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)而不改變結(jié)構(gòu)基因編碼的原有氨基酸序列。以E.coliK12的xylA為例，進(jìn)行xylA結(jié)構(gòu)基因的克隆上游引物5'GGTG/W7TCG>AGG>AAGAAATGCAAGCCTATnTGAC3'上游引物5'GGTGGATCCGAGG/\AGAAATGCAAGCCTATTTTGAC3'下游引物5'AAAT7TA47TyAA4G/47"CrrTATTTGTCGAACAGATAAT3'將PCR擴(kuò)增獲得的長度為1.3kb的xylA基因片段和載體pUC19-pro質(zhì)粒用EcoRI和Pacl酶切后，克隆XYLA基因到pUC-pro的EcoRI和Pacl酶切位點(diǎn)間；或克隆xylA基因到pUC-pra的BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)間。對于結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)部有EcoRI、BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基因，采用德國默克公司QuikChang^系列定點(diǎn)突變試劑盒進(jìn)行PCR定點(diǎn)誘變(Dpnl法)，定點(diǎn)誘變?nèi)サ艚Y(jié)構(gòu)基因上所有的EcoRI、BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)而不改變結(jié)構(gòu)基因編碼的原有氨基酸序列。經(jīng)過DNA測序，克隆xylA編碼的蛋白序列為.-MQAYFDQLDKVRYEGSKSSNPLAFRHYN咖LVLGKSMEEHLRFAACYWH50TFCWMGADMFGVGAFNRFWQQP6EALALAKRKADVAFEFFHKLHVPFYCF100HDVDVSPEGASLKEYINHFA^IVDVLAGKQEES6VKLLWGTANCFTNPRY1506AGAATNPDPEVFSWAATQWTAMEATHKL6GENYVLWG6RE6YETLLNT20CDLRQEREQLGRFMQHWEHKHKIGFQGTIiIEPKPQEPTKHQyDYDAATV250YGFLKQFGLEKEIKLNIEANHATLA6HSFH腿IATAIALGLFGSVDANRG200DAQL6HDTDQFPNSVEEHALVMYEILKAGGFTT66U4FDAKVRRQSTDiar350DLFYGHI6AMDTMALALKIAARMIEDGELDKRIAQRYS6WNSELGQQILK400G^tSLADLAKYAQE冊LSFVHQSGRQEQLENLVNHYLFDK②具體實(shí)施時(shí)，如圖5所示，如圖5所示，構(gòu)建利用戊糖生成乙醇的操縱子時(shí)，在不影響本發(fā)明結(jié)果的條件下，操縱子結(jié)構(gòu)基因包含至少一種下列木酮糖激酶XYLB(Xylulosekinase,EC2.7.1.17):P12867,XYLB—ACTMI:P54271,XYLB—AMPSP:P26909,XYLB_ARTS7:P392",XYLB_BACSU;Q3SYZ6,XYLB_BOVIN;P09099,XYLB_ECOLI;P44401,XYLB_HAEIN;075191,XYLB—HUMAN;P29444,XYLB一KLEPN;P35850,XYLB_LACBR;Q9CFG8,XYLB—LACLA;P21939,XYLB_LACPE;Q3TNA1,XYLB_MOUSE;Q5R830,XYLB—PONPY;Q3MIF4,XYLB_RAT;P27155,XYLB—STAXY;Q9RK00,XYLB_STRCO;P27156,XYLB—STRRU。^E.COlik12的XYLB為;iJ,進(jìn)行XYLB結(jié)構(gòu)基因的克隆上游引物5'TGAATTCGAGGAAGAAATGTATATCGGGATAGAT3'上游引物5'TGGATCCGAGGMGAAATGTATATCGGGATAGAT3'下游引物5'AAATTTAATTAAAGATCTnTACGCCATTAATGGCAGAAG3'將PCR擴(kuò)增獲得的長度為1.4kb的XYLB基因片段和載體pUC19-pra質(zhì)粒用EcoRI和Pacl酶切后，克隆XYLB基因到pUC-pro的EcoRI和Pacl酶切位點(diǎn)間；或克隆XYLB基因到pUC-pra的BamHI和Pac瞎切位點(diǎn)間。對于結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)部有EcoRI、BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基因，采用德國默克公司QuikChang沸系列定點(diǎn)突變試劑盒進(jìn)行PCR定點(diǎn)誘變(DpnI法)，定點(diǎn)誘變?nèi)サ艚Y(jié)構(gòu)基因上所有的EcoRI、BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)而不改變結(jié)構(gòu)基因編碼的原有氨基酸序列。經(jīng)過DNA測序，克隆XYLA編碼的蛋白序列為鄉(xiāng)IGIDLGTS6VKVILLNEQ6EWASQTEKLTVSRPHPLWSEQDPEQWWQ50ATDRAMKALO)(2HSLQDVKAL6IAGK94H6ATLLDAQQRVLRPAILWNDGR100CAQECALLEARVPLSRVIT6NLMMPGFTAPKLLWQRHEPEIFRQIDKVL150LPKDYLRLBMTGEFASDMSDAAGIMHLDVAKRDWSDVMLQACDLS幼^4P200ALYEGSEIT6ALLPEVAKAWGM^TVFWAGG6DNAAGAVGVGMVDANQAM250IiSL6TS6VYFAVSEGFLSKPESAVHSFCHALPQR冊UISVMLSAASCLDW200AAKLTGLSNVPALIAAAQQADESAEFVWFLPYIiSGERTPHNNPQAK6VFF350GLTHQHGPNEIARAVLEGVGYALADGMDWHACGIKPQSVTLIGGGARSE400YWRQMLADISGQQLDYRTGGDVGPALGAABLAQIAANPEKSLIELLPQLP450LEQSHLPDAQRYAAYQPRRETFRRLYQQLLPLM^③具體實(shí)施時(shí)，如圖5所示，構(gòu)建利用戊糖生成乙醇的操縱子時(shí)，在不影響本發(fā)明結(jié)果的條件下，操縱子結(jié)構(gòu)基因包含至少一種下列轉(zhuǎn)二羥丙酮基酶TAL(Transaldolase，EC:2.2.1.2):Q簡3，TAL1—BACAN;Q81HW6,TAL1—BACCR;Q6D8W0，TAL1—ERWCT;P34214,TAL1_KLMLA;Q927A3,TAL1—USIN;Q7糊,TAL1JJSMF;Q8Y3T8,TAL1JJSm5;P17440,TAL1—PICJA;Q5丌P8,TAL1—SALCH;Q5PDM6,TAL1—SALPA;042700,TAL1_SCHP0;Q3Z606,TAL1_SHISS;Q82M93,TAL1—STRAW;O88018,TAL1—STRCO;P15019,TAL1_YEAST;P48993,TAL2—ANASP;081MY9,TAL2一BACAN;Q濯1，TAL2一BACCR;Q6D0B2,TAli_ERWCT;P66958,TAL2JJSIN;Q723W2,TAL2JJSMF;P66957,TAL2JJSM0;P48983,TAL2—NOSPU;Q57LN7，TAL2—SALCH;Q5PCU4,TAL2—SALPA;Q3YZ89,TAL[SHISS;Q829U5,TAL2—STRAW:Q9XAC0，TAL2—STRCO;P53228,TAL2_YEAST:P17441,TAL3—PICJA;P0A卿，TALA—EC057;P0A868,TALA_ECOL6:P0A867,TALA_ECOLI;Q9畫,TALA_PASMU;Q8Z4T0，TALA—SALTI;Q8ZN83,TALA—SALTY;Q83QM8,TALA_SHIFL;P0A871,TALB—EC057;Q8FLD1.TALB—ECOL6;P0A870,TALB_ECOLI;Q9CKH9,TALB_PASMU;P鵬56，TALB—SALTI;P66955,TALB_SALTY;P0A872,TALBJHIFL;Q2TBL6,TALDO_BOVIN;P80427,TALDO—CARMA;08VI73.TALl5o—CRIGR;Q9W1G0,TALDO—DROME;P37837,TALDO_HUMAN;Q93092,taldo—mouse:q29593,taldo—PIG;q9eqs0,taldo—rat;a1tkq3,tal—aciac:A(JtY8，tal—acic1;A1W3W5,TAL_ACISJ;A3MYD4,TAL_ACTP2;A6VLW0,TAL_ACTSZ;A4^K74,TAL—AERS4;Q8U7I5,TAL—AGRT5;A6TK31,TAL—ALKMQ;A8MJZ5,TAL—ALKOO;P58561,TAL_ANASP;P51778,TAL_ANAVT;Q66;20，TAL一AQUAE;A0JWQ6，TAL_ARTS2;Q73DH4,TAL_BACC1;Q63FX6,TAL_BACCZ;Q9K6E4,TAL—BACHD;Q6小時(shí)NE4，TAL_BACHK;Q5WB47,TAL—BACSK;P19669,TAL_BACSU;Q8A767,TALBACTN:Q謂O，TALBAUCH:Q7VRT4,TAL—BLOFL;Q2KVT3,TAL—BORA1;Q7WME6,TAL—BORBR;Q7WAY2,TAL—BORPA;07VY99,TAL—BORPE;02YLI1,TAL_BRUA2;Q57B82,TAL一BRUAB;Q8YJ42,TAL_BRUME;A5VSE7,TAL—BRU02;Q8FYQ9,TAL—BRUSU;P57194,TAL—BUCAI:Q8&27，TAL—BUCAP;■Y3，TAL—BUCBP;Q058B4，TAL—BUCCC;01BUS8,TAL—BURCA;A0K9A9,TAL—BURCH;Q0BD43,TAL_BURCM;A3MHY5.TALBURM7:Q62ID7,TAL_BURMA;A1V2A0,TAL_BURMS;A3NSY2,TAL—BURPO;Q3JML7，TAL—BURP1:A3N794,TAL—BURP6;Q63W00,TAL—BURPS;Q39E45,TAL_BURS3;Q2SZY3,10TAL_BURTA;A4JGM1，TAL_BURVG;Q142S4,TAL—BURXL;A4XL36,TAL_CALS8;A8FK69,TAL_CAMJ8;A7H591,TAL_CAMJD;Q9PIL5,TAL—CAMJE;A1畫,TAL_CAMJJ;0;圓6，TAL_CAMJR:Q9A2F1，TAL—CAUCR;Q5L5I5,TAL_CHLAB:Q822J3,TAL_CHLCV;Q255E4，TAL—CHLFF;Q9P咖,TAL_CHLMU;Q9Z998,TAL—CHLPN;Q3KM49,TAL_CHLTA;Q8KGF8,TAL—CHLTE;084315,TAL_CHLTR;Q1QZV1,TAL—CHRSD;Q97JD9,TAL_CLOAB;Q185K3,TAL—CL0D6;Q8XMJ6,TAL—CLOPE;Q899F3,TAL—CLOTE;Q47網(wǎng),TAL—COLP3:Q9RUP6,TAL—DEIRA;A4J9C4,TAL—DESRM;A7HME3.TAL一FERNB;Q0RH18,TAL_FRAAA;Q2JCG8,TAL—FRASC;Q39YD4,TAL_GEOMG;Q748M4,TAL_GEOSL;A4ITL5，TAL一GEOTN;Q7NK81,TAL—GLOVI;Q7VP02,TAL—HAE叫；Q4QLG9,TAL—HAE舊；A5UCY0.TAL—HAEIE;A5UIP9,TAL_HAEIG;P45055,TAL—圖N;Q0I1U0,TAL—HAES1;Q1CRD7,TAL一HELPH:Q9ZJC5，TAL一HELPJ;P56108,TAL—HELPY;Q88S98,TAL_LACPL;Q6AF36,TAL—LEIXX;Q72RT8.TAL_LEPIC;Q8F3W3,TALLEPIN-Q65PZ8,TAL_MANSM;A1U1Y1,TAL—MARAV;Q0AQJ7,TAL—MARMM;Q11DE1,TAL_MESSB;A6UTP5,TAL_META3;Q^S0X4，TAL—METAM;Q602L8,TAL_METCA;Q1H0R4.TAL_METFK;058370,TALMETJA-A4FWM6,TAL_METM5;A6VGP5,TALMETM7:Q6LXP1,TALMETMP:A2SKF9，TAL_METPP;A6UPV2,TAL—MEWS:P59955,TAL—MYCBO;A1KIN7,TAL—MYCBP:P55193.TAL—MYCLE;A5U2F1,TAL_MYCTA;O06812,TAL—MYCTU;A0PPP5,TAL_MYCUA;Q5F6E9,TALNEIG1:Q9JSU1,TAL_NEIMA;Q9K139,TAL—NEIMB:A1固，TAL_NEIMF;Q86(76,TAL—OCEIH;A6\^XW5,TALJXHA4;Q6MAI4,TAL_PARUW;A1AKQ8,TAL—PELPD;Q7N8Z1,TAL_PHOLL;Q6LLF0,TAL—PHOPR;Q6L178,TAL—PICTO;A1VJZ5,TAL-POLNA;Q12R4,TAL_POLSJ;Q7MXG0,TAL_PORGI;A3PBP3.TAL_PROM0;A2C0X8,TAL—PROM1;A2BVM,TALPROM5:Q31C15，TAL—PROM9;Q7VD64,TAL—PROMA;Q7V;B8，TAL—PROMM;Q7V2G1,TAL_PROMP;Q46GQ7,TAL_PROMT:Q48KH5,TAL—PSE14;015PR4.TAL_PSEA6;A6V3U3,TAL_PSEA7;Q02NV3,TAL—PSEAB;Q9I047,TAL_PSEAE;Q1I7G7,TAL_PSEE4;Q4KF恥,TAL_PSEF5;A4XTM7,TAL—PSEMY;Q3&9H0'TAL_PSEPF;Q88KX1,TAL—PSEPK;Q884H4.TAL—PSESM;Q4ZV64,TAL—PSEU2;A4VK43,TAL—PSEU5;Q^K979,TAL—RALEH;Q46ZK0.TAL—RALEJ;Q窗8，TAL—RALME;Q8Y014,TAL-RALSO;Q2K414,TAL_RHIEC;Q98EV0,TAL_RHILO;Q92LK3,TAL一RHIME;021ZD6,TAL—RHOFD;Q2隨7，TAL—RHORT;A1S414,TAL—SHEAM;A3D1F5,TAL—SHEB5;A6WKC4,TAL—SHEB8;Q12J<L3,TAL—SHEDO;Q07—Z25,TAL—SHEFN:A3QBW2,TAL—SHELP:Q8EBH2.TAL—SHEON;A4Y494,TAL_SHEPC;AOL啦,TAL—SHESA;Q0HFX9,TAL—SHESM:Q0HS72,TAL_SHESR;A1RI^N6，TAL_SHESW;Q32;L3，TALSH舊S;Q32KB0,TAL一SHIDS;A6UDM7,TAL_SINMW;Q2NS86,TAL_SODGM;08E3B1,TAL_STRA3;Q8DXP1,TAL—STRA5;P明鄉(xiāng),TAL—STRP1;P66960,TAL—STRP3;Q5XAK4,TAL—STRP6;P66961,TAL—STRP8;Q1J;F7，TAL_STRPB;Qj"扁,TAL一STRPC;Q1JFK0,TAL_STRPD;01J5E9,TAL—STRPF;A2RD32,TAL—STRPG;Q48RY1,TAL—STRPM;。k)LL7,TAL—SYNEL;05卩127,TAL—SYNP6;Q7U一5E8，TAL一SYNPX;P72797,TAL_SYNY3;09—HKI3,TAL—THEAC;Q47ND3,TALJ"HEFY;A6LNG2,TAL—THEM4;Q9WYD1,TALJ"HEMA;A5IKB4,TAL—THEP1;Q8R8S6，TAL—THETN;Q97AZ4,TAL—THEVO;Q3SL03,TALJ"HIDA;Q118F4,TAL_TREI;A1WIS6,TAL_VEREI:A5F咖,TAL—V舊C3;Q9KLW8，TAL—V舊CH;Q5DZP1,TAL—V舊F1;A7N1Z7，TALJ/舊HB;Q87GY5,TAL—V舊PA;Q8D6;時(shí)9，TAL—V舊VU;Q7"DD5，TAL—V舊VY;Q85lX3,TAL_WIGBR;Q8PNY6,TAL—XANAC;Q3BX43.TAL_XANC5;Q4UR79,TAL—XANC8;Q8PCA4,TALXANCP:Q2NZS1，TALXANOM:05GWL8.TAL—XANOR;A1JJD0,TAL_YERE8;A7FME9,TAL—YERP3;Q8ZIN2,TAL_YERPE:Q66ET5,TAL_YERPS。以E.coliK12的TAL為例，進(jìn)行;AL結(jié)構(gòu)基因的克隆上游引物5'TGAATTCGAGGAAGAAATGTATATCGGGATAGAT3'上游引物5'TGGATCCGAGGAAGAAATGTATATCGGGATAGAT3'下游引物5'AAATTTAATTAMGATCTTTTACGCCATTAATGGCAGAAG3'將PCR擴(kuò)增獲得的長度為1.4kb的TAL基因片段和載體pUC19-pra質(zhì)粒用EcoRI和Pac鵬切后，克隆XYLA基因至iJpUC-pro的EcoRI和Pacl酶切位點(diǎn)間或克隆TAL基因到pUC-pro的BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)間。對于結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)部有EcoRI、BamH間Pacl酶切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基因，采用德國默克公司QuikChang沸系列定點(diǎn)突變試劑盒進(jìn)行PCR定點(diǎn)誘變(DpnI法)，定點(diǎn)誘變?nèi)サ艚Y(jié)構(gòu)基因上所有的EcoRI、BamHI和Pacl嗨切位點(diǎn)而不改變結(jié)構(gòu)基因編碼的原有氨基酸序列。經(jīng)過DNA測序，克隆TAL編碼的蛋白序列為MTDKIjTSLRQYTTWADTGDIAAMKIiYQPQDATTNPSIjILNAAQIPEYRK50LIDDAVAWAKQQSNDRAQQIVDATDKLAWIGLEILKLVPGRISTEVDAR100LSYDTEASIAKAKRLIKLYNDAGISNDRILIKLASTWQGIRAAEQLEKEG150INCNLTLLFSFAQARACAEAGVFLISPFVGRILDWYKANTDKKEYAPAED200PGWSVSEIYQYYKEHGYETWMGASFRNIGEIIiEIjAGCDRLTIAPAIiLK250ELAESEGAIERKLSYTGEVKARPARITESEFLWQHNQDPMAVDKLAEGIR200KFAIDQEKLEKMIGDLL④具體實(shí)施時(shí)，如圖5所示，構(gòu)建利用戊糖生成乙醇的操縱子時(shí)，在不影響本發(fā)明結(jié)果的條件下，操縱子結(jié)構(gòu)基因包含至少一種下列轉(zhuǎn)羥乙醛酶TKT(Transketolase,EC:2.2.1.1):094039，TKT1—CANAL;P27302,TKT1_EC0LI:012630，TKT1—KLMLA;P57927,TKT1_PASMU;Q9KUP2，TKT1—V舊CH;Q5E7R1,TKT1J/舊F1;Q87LK8,TKT1_WBPA;Q8DCA2，TKT1—V舊VU;Q7MHK7，TKT1J/舊VY;P23254,TKT1—YEAST;P33570,TKT2—ECOU;P57958,TKT2—PASMU;Q9KLW7,TKT2—V舊CH;O5DZP0,TKT2—V舊F1;Q87GY4,TKT2—V舊PA;Q8D6小時(shí)8，TKT2—V舊VU:Q7MDD4,TKT2—V舊VY;P33315.TKT2—YEAST;042677,TKT7—CRAPL;Q42675,TKTA—CRAPL;042676,TKTC—CRAPL;q7sic9,TKTC_MAIZE;q58092,TKt61mETJA;p21725,TKTC—RALEH;043848，TKTC—SOLTU:020250,TKTC—SPIOL;Q2NL26,TKTL1_B0VIN;P51854,TKTL1—HUMAN;Q4R6M8,TKTL1_MACFA;Q99MX0,TKTL1_M0USE;Q2NIKZ4，TKTL2_B0VIN;Q9H0I9,TKTL2_HUMAN;Q9D4D4，TKTL2—MOUSE;Q58094,TKTN—METJA;P21726,TKTP—RALEH;067642，TKT—AQUAE;Q9KAD7,TKT—BACHD:P45694,TKT—BACSU;Q6B855,TKT—BOVIN;P57195,TKT_BUCAI:08KA26,TKT—BUCAP;Q89AY2,TKT—BUCBP;P43757,TKT_HAEIN;P29401,TKT一國AN;Q60HC7,TKT—MACFA;P40142,TKT—MOUSE;P59956.TKT—MYCBO;P47312,TKT_MYCGE:P46708,TKT—MYCLE;P75611,TKT_MYCPN;006811,TKT—MYCTU:Q5R1W6,TKT—PANTR;P34736,TKT—PICST;Q5R4C1,TKT_PONPY;P84540,TKT—POPEU;P50137,TKT—RAT;P58333,TKT—RHIME;Q52723,TKT—RHOCA;P29277.TKT—RHOSH;Q9URM2,TKT—SCHPO;P56900,TKT—S國W;Q5HG77,TKT_STAAC;P66962,TKT_STAAM:P99161,TKT一ST纖Q6GH64,TKT—STAAR;Q6G9L6,TKT_STAAS;P66963,TKT—STAAW;Q5HPJ9,TKT—STAEChQ8CPC7,TKT—STAES;Q5^AK5，TKT—STRP6;Q8NZX4,TKT_STRP8;P22976,TKT—STRPN;083571，TKT—TREPA;P51010,TKT_XANFL。以E.coliK12的TKT為例，進(jìn)行TKT結(jié)構(gòu)基因的克隆上游引物5'TGAATTCGAGGAAGAAATGTCCTCACGTAAAGAG3'上游弓l物5'TGGATCCGAGGAAGAAATGTCCTCACGTAAAGAG3'下游引物5'AAATTTAATTAAAGATCTTTACAGCAGTTCTnTGC3'將PCR擴(kuò)增獲得的長度為0.9kb的TKT基因片段和載體pUC19-pro質(zhì)粒用EcoRI和Pacl酶切后，克隆TKT基因到pUC-pro的EcoRI和Pacl酶切位點(diǎn)間或克隆TKT基因到pUC-pro的BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)間。對于結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)部有EcoRI、BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基因，采用德國默克公司QuikChange⑧系列定點(diǎn)突變試劑盒進(jìn)行PCR定點(diǎn)誘變(Dpnl法)，定點(diǎn)誘變?nèi)サ艚Y(jié)構(gòu)基因上所有的EcoRI、BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)而不改變結(jié)構(gòu)基因編碼的原有氨基酸序列。經(jīng)過DNA測序，克隆TKT編碼的蛋白序列為MSSRKELANAIRALSMDAVQKAKSGHPGAPMGMADIAEVLWRDFLKHNPQ50NPSWADRDRFVLSNGHGSMLIYSIiLHIiTGYDLPMEELKNFRQLHSKTPGH100PEVGYTAGVETTTGPLGQGIANAVGMAIAEKTLAAQFNRPGHDIVDHYTY150AFMGDGCMMEGISHEVCSIiAGTIiKLGKLIAFYDDNGISIDGHVEGWFTDD200TAMRFEAYGWHVIRDIDGHDAASIKRAVEEARAVTDKPSLLMCKTIIGFG250SPNKAGTHDSHGAPLGDAEIALTREQLGWKYAPFEIPSEIYAQWDAKEAG200QAKESAWNEKFAAYAKAYPQEAAEFTRRMKGEMPSDFDAKAKEFIAKLQA350NPAKIASRKASQNAIEAFGPLLPEFLGGSADLAPSNLTLWSGSKAINEDA400AGNYIHYGVREFGMTAIANGISLHGGFLPYTSTFIiMFVEYARNAVRMAAL450MKQRQVMVYTHDSIGIjGEDGPTHQPVEQVASIjRVTPNMSTWRPCDQVESA500VAWKYGVERQDGPTALILSRQNLAQQERTEEQIANIARGGYVLKDCAGQP550ELIFIATGSEVELAVAAYEKLTAEGVKARWSMPSTDAFDKQDAAYRESV600LPKAVTARVAVEAGIADYWYKYVGLNGAIVGMTTFGESAPAELLFEEFGF650TVDNWAKAKELL(D具體實(shí)施時(shí)，如圖5所示，構(gòu)建利用戊糖生成乙醇的操縱子時(shí)，在不影響本發(fā)明結(jié)果的條件下，操縱子結(jié)構(gòu)基因包含至少一種下列轉(zhuǎn)羥乙醛酶L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(araA,EC5.3.1.4)中的一種12Q65GC0,ARM1_BACLD;Q97JE4.ARAA1—CLOAB;Q65J10,ARAA2—BACLD;Q97JE0，ARAA2_CLOAB;Q1IUW9,ARAA一AC舊L;A0LT86,ARAA一ACIC1;A6VLM2，ARAA一ACTSZ;AOKJIO,ARM—AERHH;A4SNH3,ARAA一AER沐A1RAY5，ARAA_ARTAT:A0JRF5，ARAA一ARTS2;Q9KBQ2,ARAA—BACHD;Q訓(xùn)L05,ARAA-BACSK;Q9S467.ARM—BACST:P94523,ARM_BACSU;Q8AAW1，ARAA_BACTN;A6L2R5,ARM—BACV8;A1A3A8，ARAA_BIFAA;Q8G7J3，ARM—BIFLO;A8ALP0,ARAA一C眺A5CPB7,ARM—CLAM3;A7ZHF3,ARM—EC024;P58538,ARAA_EC057;A7ZW12,ARAA_ECOHS;A1A7A9，ARAA_ECOK1;Q0TLS8，ARM—ECOL5;Q8FL89,ARM—ECOL6;P08202,ARAA_ECOLI;01RGD7,ARAA_ECOUT;A4W6G6,ARM_ENT38;Q6D4W5,ARAA_ERWCT:05KYP7,ARM—GEOKA;A4IPA1,ARAA_GEOTN;A0LZ81,ARM—GRAFK;A6T4K0,ARAA_KLEP7:Q48433,ARAA_KLEPN;Q03PR5,ARAAJACBA;Q88S84,ARAA—U\CPL;038UH2,ARM—LACSS;Q03XW2，ARAA一LE圓；Q65WJ5,ARAA—MANSM;A0QT53,ARM—MYCS2;Q9RHG2，ARAA_MYCSM;A1SDP0,ARAA一NOCSJ;Q8EMP4,ARAA—OC曰H;Q03HQ0,ARAA_PEDPA;Q21MP3,ARM—SACD2;Q5丌F9，ARM_SALCH;Q5PDF2,ARAA—SALPA;P58539,ARAA—SALTI;P06189,ARM_SALTY;A8GE04,ARAA_SERP5;A0KWX7,ARAA—SHESA;Q0HIR5,ARAA_SHESM;Q0HV71,ARAA—SHESR;A1RJD6,ARAA_SHESW;Q326小時(shí)3,ARAA—SH舊S:Q32K31,ARM—SHIDS;Q0T8D5,ARAA_SHIF8;Q7UDT4,ARAA_SHIFL;Q3Z5U9,ARAA—SHISS;Q9WYB3，ARAA—THEMA;A5IKE5,ARAA—THEP1;Q87FK3,ARAAJ/舊PA;A1JMB6,ARAA—YERE8;A7F眺ARAA—YERP3;Q1C7J3,ARAA—YERPA;P58540,ARAA—YERPE;Q1CIX9,ARAA_YERPN:A4TJ19,ARM一YERPP-,Q66AF8,ARAA_YERPS。&E.coliK12的araA為例，進(jìn)行araA結(jié)構(gòu)基因的i隆上游引物5'TGAATTCGAGGAAGAAATGACGATTTTTGATAATTAT3'上游引物5'TGGATCCGAGGAAGAAATGACGATTTTTGATAATTAT3'下游引物5'AAATTTAATTAAAGATCTCTTAGCGACGAAACCCGTAA3'將PCR擴(kuò)增獲得的長度為1.5kb的araA基因片段和載體pUC19-pra質(zhì)粒用EcoRI和Pad酶切后，克隆araA基因到pUC-pra的EcoRI和Pacl酶切位點(diǎn)間；或克隆araA基因到pUC-pro的BamHI和Pac鵬切位點(diǎn)間。對于結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)部有Ecom、BamHI和Pac聰切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基因，采用德國默克公司QuikChange⑧系列定點(diǎn)突變試劑盒進(jìn)行PCR定點(diǎn)誘變(Dpnl法)，定點(diǎn)誘變?nèi)サ艚Y(jié)構(gòu)基因上所有的EcoRI、BamHI和Pad酶切位點(diǎn)而不改變結(jié)構(gòu)基因編碼的原有氨基酸序列。經(jīng)過DNA測序，克隆araA編碼的蛋白序列為MTIFDNYEVWFVIGSQHLYGPETLRQVTQHAEHWNALNTEAKLPCKLVL50KPLGTTPDEITAICRDANYDDRCAGLWWIiHTFSPAKMWINGLTMIjNKPL100LQFHTQFNAAIiPWDSIDMDFMNLNQTAHGGREFGFIGARMRQQHAWTGH150WQD罪HERIGSWMRQAVSKQDTRHLKVCRFGDNMREVAVTDGDKVAAQI200KFGFSVNTWAVGDLVQWNSISDGDVNAIjVDEYESCYTMTPATQIHGKKR250QNVLEAARIELGMKRFLEQGGFHAFTTTFEDLHGLKQLPGLAVQRLMQQG200YGFAGEGDWKTAAIiLRIMKVMSTGLQGGTSFMEDYTYHFEKGNDLVLGSH350MLEVCPSIAAEEKPILDVQHLGIGGKDDPARLIFNTQTGPAIVASLIDLG400DRYRLLVNCIDTVKTPHSLPKLPVANALWKAQPDLPTASEAWILAGGAHH450TVFSHALNliNDMRQFAEMHDIEITVIDNDTRLPAFKDALRWNEVYYGFRR500⑥具體實(shí)施時(shí)，如圖5所示，構(gòu)建利用戊糖生成乙醇的操縱子時(shí)，在不影響本發(fā)明結(jié)果的條件下，操縱子包含至少一種下列轉(zhuǎn)羥乙醛酶L-核酮糖激酶(araB,EC3.1.1.15)中的一種ARAB2—STAS1(Q49V87);ARAB—BACHD(Q9KBQ3);ARAB—BACLD(Q65GC1);ARAB—BACSK(Q5WL06);ARAB_BACST(Q9S468);ARAB一BACSU(P94524);ARAB—CITK8(A8ALN9):ARAB_EC024(A7ZHF4);ARAB_EC057(P58541);ARAB_ECOHS(A7ZW13);ARAB—ECOK1(A1A7B0);RAB_ECOL5(Q0TLS7);ARAB-ECOL6(Q8FL88);ARAB_ECOLI(P08204);ARAB_Eb0UT(Q1RGD6):ARAB_ENT38(A4W6G7);ARAB—ERWCT(Q6D4W6);ARAB—GEOKA(Q5KYP6);ARAB_GEOTN(A4IPA2);ARAB_KLEP7(A6T4K1);ARAB—MYCSM(Q9LBQ3):ARAB—SALPA(Q5PDF1)ARAB_SALTI(P58542);ARAB—SALTY(P06188);ARAB一SERP5(A8GE05);ARAB—SH舊S(Q326h2);ARAB—SHIDS(Q32K30);ARAB一SHIF8(Q0T8D4);ARAB_SHFL(Q83MG5);ARAB:SHISS(Q3Z5U8);ARAB_STAA1(A7WYY2);ARAB—STAA3(Q2FJ88);ARAB_STM8(Q2G0M6);ARAB—STAAB(Q2YSA9);ARAB_STAAC(Q5HIC3);ARAB_STAAE(A6QEK4);ARAB_STAAM(P63549);ARAB一STAAN(P63550);ARAB_STAAR(Q6GJB6);ARAB_STAAS(Q6GBT5);ARAB—STAAW(Q8NXY1);ARAB—STAEQ(Q5HLQ6);ARAB—STAES(Q8CRC6);ARAB一STRAT(P52659);ARABJ/舊PA(Q87FK5);ARAB—YERPA(Q1C7J2);ARAB—YERPE(P58543);ARAB_YERPN(Q1CIX8);ARAB—YERPS(Q66AF7)&E.coliK12的araB為例，進(jìn)行araB結(jié)構(gòu)基因的克隆上游弓l物5'TGAATTCGAGGAAGAAATGGCGATTGCAATTGG3'上游弓l物5'TGGATCCGAGGAAGAAATGGCGATTGCAATTGG3'下游引物5'AAATTTAATTAAAGATCTCTTATAGAGTCGCAACGG3'將PCR擴(kuò)增獲得的長度為1.4kb的araB基因片段和載體pUC19-pro質(zhì)粒用EcoRI和Pacl酶切后，克隆araB基因到pUC-pro的EcoR間Pacl酶切位點(diǎn)間；或克隆araB基因到pUC-pro的BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)間。對于結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)部有EcoRI、BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基因，采用德國默克公司QuikChange⑧系列定點(diǎn)突變試劑盒進(jìn)行PCR定點(diǎn)誘變(Dpnl法)，定點(diǎn)誘變?nèi)サ艚Y(jié)構(gòu)基因上所有的EcoRI、BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)而不改變結(jié)構(gòu)基因編碼的原有氨基酸序列。經(jīng)過DNA測序，克隆araB編碼的蛋白序列為MAIAIGLDFGSDSVRALAVDCATGEEIATSVEWYPRWQKGQFCDAPNNQF50RHHPRDYIESMEAALKTVLAE1jSVEQRAAWGIGVDSTGSTPAPIDADGN100VLALRPEFAENPNAMFVLWKDHTAVEEAEEITRLCHAPGNVDYSRYIGGI150YSSEWFWAKILHVTRQDSAVAQSAASWIELCDWVPALLSGTTRPQDIRRG200RCSAGHKSLWHESWGGLPPASFFDELDPILNRHLPSPLFTDTWTADIPVG250TLCPEWAQRLGIiPESWISGGAFDCHMGAVGAGAQPNALVKVIGTSTCDI200LIADKQSVGERAVKGICGQVDGSWPGFIGLEAGQSAFGDIYAWFGRVLG350WPLEQLAAQHPELKTQINASQKQIiljPAIjTEAWAKNPSIjDHIiPVVIjDWFNG400RRTPNANQRIjKGVITDIiNLATDAPIjIiFGGLIAATAFGARAIMECFTDQGI450AVNNVMAIjGGIARKNQVIMQACCDVLNRPLQIVASDQCCALGAAIFAAVA500AKVHADIPSAQQKMASAVEKTLQPCSEQAQRFEQLYRRYQQWAMSAEQHY550IjPTSAPAQAAQAVATIj⑦具體實(shí)施時(shí)，如圖5所示，構(gòu)建利用戊糖生成乙醇的操縱子時(shí)，在不影響本發(fā)明結(jié)果的條件下，操縱子結(jié)構(gòu)基因包含至少一種下列轉(zhuǎn)羥乙醛酶L-核酮糖-5-磷酸4-差向異構(gòu)酶(araD,EC4.2.1.43)中的一種ARAD_BACHD(Q9KBQ4);ARAD一BACST(Q9S469);ARAD_BACSU(P94525);ARAD_ECOLI(P08203);ARAD_SALT^(P06190)以"kcoliK12的araD為例，i^行araD結(jié)構(gòu)基因的克隆上游引物5'TGAA丌CGAGGAAGAAATGTTAGAGGATCTCAAAC3'上游引物5'TGGATCCGAGGAAGAAATGTTAGAGGATCTCAAAC3'下游引物5'AAATTTAATTAAAGATCTTTACTGCCCGTAATATGCC3'將PCR擴(kuò)增獲得的長度為o.7kb的araD基因片段和載體pUC19-pro質(zhì)粒用EcoRI和Pacl酶切后，克隆araD基因到pUC-pro的EcoRI和Pacl酶切位點(diǎn)間；或克隆araD基因至iJpUC-pro的BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)間。對于結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)部有EcoRI、BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基因，采用德國默克公司QuikChang^系列定點(diǎn)突變試劑盒進(jìn)行PCR定點(diǎn)誘變(Dpnl法)，定點(diǎn)誘變?nèi)サ艚Y(jié)構(gòu)基因上所有的EcoRI、BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)而不改變結(jié)構(gòu)基因編碼的原有氨基酸序列。經(jīng)過DNA測序，克隆araD編碼的蛋白序列為MLEDLKRQVLEANLALPKHNLVTLTWOilVSAVDRER6VFVIKPS6VDYSV50MTADDMWVSIETGEWEGTKKPSSDTPTHRLLYQAFPSIG6IVHTHSRH100ATIWAQAGQSIPATGTTHAOYFYGTIPCTRKMTDAEINGEYEWETGNVIV150ETFEKQGIDAA^IP6VLVHSHGPFAW6KNAEDAVHHAIVLEEVAYMGIFC200RQLAPQLPD^QTLLDKHYLRKHGAKAYY6Q⑧具體實(shí)施時(shí)，如圖5所示，構(gòu)建利用戊糖生成乙醇的操縱子時(shí)，在不影響本發(fā)明結(jié)果的條件下，操縱子結(jié)構(gòu)基因包含至少一種下列甘露糖利用酶mannose-6-phosphateisomerase[manA,EC5.3.1.8中的一種P07874,ALGA—PSEAE;P59785,ALGA—PSEFL;Q88ND5,ALGA—PSEPK;Q887Q9,ALGA—PSESM;Q75AB5,MANA—ASHGO;Q66WM4,MANA—ASPFU;P39841,MANA_BACSU;Q3SZI0,MANA—BOVIN;P34650,MANA_CAEEL;P34948,MANA_CANAL;Q76IQ2，MANA_CANGA:Q9HFU4,MANA—CRYNE;Q9GP38,MANA_ECHMU;P00946,MANA_ECOLI;P29951,MANA—EMENI;P34949,MANA—HUMAN;Q8HXX2,MANA_MACFA;Q924M7,MANA_MOUSE;Q870Y1，MANA—NEUCR;A5A6K3,MANA—PANTR;14Q8J093,MANA_PICAN;Q68FX1,MANA_RAT;P29954,MANA_RHIME;P25081,MANA_SALTY;043014,MANA_SCHPO;Q83KZ1,MANA_SHIFL;Q59935,MANA_STRMU:P29952,MANA—YEAST;Q9YE01,PGMI—AERPE;Q44407,PGMI_ANATH;066954,PGMI_AQUAE;Q8ZWV0,PGMI—PYRAE;Q4JCA7,PGMLSMLAC:Q97WE5,PGMI—SMLSO;Q96YC2,PGMI—SMLTO;Q9HIC2，PGMI—THEAC;Q978F3，PGMI—THEVO;P29956,XANB—XANCP。^lE.coliK12的manA為例，進(jìn)行manA結(jié)構(gòu)基因的克隆上游引物5'TGAATTCGAGGAAGAAATGCAAAMCTCATT3'上游引物5'TGGATCCGAGGAAGAAATGCAAAAACTCATT3'下游引物5'AAATTTAAnAAAGATCTTTACAGCTTGTTGTA3'將PCR擴(kuò)增獲得的長度為1.2kb的manA基因片段和載體pUC19-pro質(zhì)粒用EcoRI和Pac嘴切后，克隆manA基因到pUC-pra的EcoRI和Pacl酶切位點(diǎn)間；或克隆manA基因到pUC-pro的BamHI和Pac嘴切位點(diǎn)間。對于結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)部有EcoRI、BamHI和Pac瞎切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基因，采用德國默克公司QuikChange⑧系列定點(diǎn)突變試劑盒進(jìn)行PCR定點(diǎn)誘變(Dpnl法)，定點(diǎn)誘變?nèi)サ艚Y(jié)構(gòu)基因上所有的EcoRI、BamHI和Pacl酶切位點(diǎn)而不改變結(jié)構(gòu)基因編碼的原有氨基酸序列。經(jīng)過DNA測序，克隆manA^碼的蛋白序列為MQKLINSVQNYAWGSKTALTELYGMENPSSQEMAELWMGAHPKSSSRVQN50AAGDIVSLRDVIESDKSTLL6EAVAKRF6ELPFLFKVLCAAQPLSIQVHP100NKHNSEIGFAKEHAAGIFMDAAERNYKDFNHKPELVFALTPFIAMNAFRE150FSEIVSLLQFVAGAHPAIAHFLQQPDAERLSELFASLIiNMQGEEKSRALA200ILKSALDSQQGEFWQTIRLISEFYPEDSGLFSPLLLNWKLNPGEAMFLF250AETPHAYLQGVALEVMANSDNVLRAGLTPKYIDIPELVANVKFEAKPANQ200LLTQFVKQ6AELDFPIPVDDFAFSLHDLSDKETTISQQSAAILFCVE6DA350TLWKGSQQLQLKPGESAFIAANESFVTVKGHGRLARVYNKL具體實(shí)施方法三操縱子的構(gòu)建1、單順反子操縱子的構(gòu)建(構(gòu)建過程示意圖，見圖6)以啟動(dòng)子gap調(diào)控結(jié)構(gòu)基因yfdz為例,見圖6，構(gòu)建可被運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌識別的操縱子。pUOgap啟動(dòng)子經(jīng)EcoRI和Pacl酶切后作為載體，與結(jié)構(gòu)基因的EcoRI和Pacl片斷進(jìn)行連接，獲得可被運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌識別的操縱子gap-yfdz。其它啟動(dòng)子與結(jié)構(gòu)基因均以相同的方式進(jìn)行重組。用BamHI和Pac鵬切，可以將該操縱子完整的分離出來。2、雙順反子操縱子的構(gòu)建(構(gòu)建過程示意圖，見圖7)①1個(gè)啟動(dòng)子控制1個(gè)結(jié)構(gòu)基因的雙順反子操縱子的構(gòu)建BamHI和Bglll酶切后能產(chǎn)生相互匹配的粘性末端而可以相互連接.連接后BamHI和Bglll酶切位點(diǎn)均消失。在此，我們對含有一個(gè)結(jié)構(gòu)基因的操縱子用Bglll和Pacl進(jìn)行酶切后作為載體；對另一個(gè)操縱子用BamHI和Pacl進(jìn)行酶切后作為插入片段，連接后獲得含雙結(jié)構(gòu)基因的雙順反子操縱子。圖7,為結(jié)構(gòu)基因metB和結(jié)構(gòu)基因yfdz雙順反子操縱子構(gòu)建的過程。該雙順反子操縱子進(jìn)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌細(xì)胞內(nèi)，可使其能夠自行合成賴氨酸和甲硫氨酸，可以降低運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生長過程中對培養(yǎng)物的營養(yǎng)要求。②1個(gè)啟動(dòng)子控制2個(gè)結(jié)構(gòu)基因的雙順反子操縱子的構(gòu)建(構(gòu)建過程示意圖，見圖8):對含有一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)結(jié)構(gòu)基因的操縱子用Bglll和Pacl進(jìn)行酶切后作為載體；對無啟動(dòng)子序列的結(jié)構(gòu)基因用BamHI和Pacl進(jìn)行酶切，連接后獲得一個(gè)啟動(dòng)子控制2個(gè)結(jié)構(gòu)基因的雙順反子操縱子，各個(gè)結(jié)構(gòu)基因有自己獨(dú)立的SD序列。圖8，為1個(gè)neo啟動(dòng)子控制2個(gè)結(jié)構(gòu)基因me氾和yfdz的雙順反子操縱子的構(gòu)建過程。該雙順反子進(jìn)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌細(xì)胞內(nèi)，可使其能夠自行合成賴氨酸和甲硫氨酸，可以降低運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生長過程中對培養(yǎng)物的營養(yǎng)要求。3、三順反子操縱子的構(gòu)建(構(gòu)建過程示意圖，見圖9)將上述2順反子Bglll和Pacl進(jìn)行酶切后作為載體，將其它含有結(jié)構(gòu)基因的操縱子用BamHI和Pacl進(jìn)行酶切后回收，與上述載體連接后可以獲得含3個(gè)結(jié)構(gòu)基因的操縱子。如此循環(huán)操作，可以逐漸將一個(gè)個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)到已有的操縱子上。圖9,為用g鄰啟動(dòng)子調(diào)控HSP、yfdz和me舊的操縱子的構(gòu)建過程。該3順反子操縱子重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，能增加其對逆境的耐受性，能夠使其自行合成賴氨酸和甲硫氨酸而降低運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對培養(yǎng)物的營養(yǎng)要求。4、多種啟動(dòng)子控制多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的復(fù)合多順反子操縱子的構(gòu)建(構(gòu)建過程示意圖，見圖10)將含有一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)結(jié)構(gòu)基因的操縱子用Bglll和Pacl進(jìn)行酶切后作為載體；將無啟動(dòng)子15序列的單個(gè)結(jié)構(gòu)基因用BamHI和Pacl進(jìn)行酶切，連接后獲得一個(gè)啟動(dòng)子控制2個(gè)結(jié)構(gòu)基因的2順反子操縱子。將2順反子操縱子用Bglll和Pacl進(jìn)行酶切后作為載體；將無啟動(dòng)子序列的單個(gè)結(jié)構(gòu)基因用BamHI和Pacl進(jìn)行酶切，連接后獲得3順反子操縱子。將3順反子操縱子用Bglll和Pacl進(jìn)行酶切后作為載體；將無啟動(dòng)子序列的單個(gè)結(jié)構(gòu)基因用BamHI和Pacl進(jìn)行酶切，連接后獲得4順反子操縱子。如此循環(huán)操作，可以逐漸將一個(gè)個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)到已有的操縱子上，操縱子中的順反子數(shù)也不斷增加。圖10圖解了由1個(gè)neo啟動(dòng)子(或gap啟動(dòng)子)調(diào)控1個(gè)結(jié)構(gòu)基因T7RNAPolymerase,由T7啟動(dòng)子調(diào)控3個(gè)結(jié)構(gòu)基因me舊、yfdz、HSP的多順反子操縱子的構(gòu)建過程。這種由1個(gè)n的啟動(dòng)子、2個(gè)T7啟動(dòng)子、4個(gè)結(jié)構(gòu)基因組成的多順反子操縱子，進(jìn)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌細(xì)胞內(nèi)使其能夠增加其對逆境的耐受性，降低運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生長過程中對培養(yǎng)物的營養(yǎng)要求。具體實(shí)施方法四操縱子導(dǎo)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌1、操縱子轉(zhuǎn)座Tn5、Tn10和Mu是本領(lǐng)域所熟知的轉(zhuǎn)座子，廣泛用于誘變和將DNA隨機(jī)插入到多種細(xì)菌的染色體中。本發(fā)明采用Tn5、Tn10和Mu轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，來完成操縱子導(dǎo)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌過程。以Tn5為例，轉(zhuǎn)座的具體過程包括以下步驟①轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建(構(gòu)建過程示意圖，見圖11):如圖11所示，兩個(gè)反相的Tn5轉(zhuǎn)座IS之間有一段DNA具有多克隆位點(diǎn)，多克隆位點(diǎn)便于今后的克隆。(IS:是轉(zhuǎn)座子插入序列的縮寫。)②構(gòu)建含有目的基因片段的轉(zhuǎn)座基因片段(構(gòu)建過程示意圖，見圖12):將目的基因插入到轉(zhuǎn)座載體中，目的基因位于BamHI、Pacl位點(diǎn)之間。Pacl、Notl切點(diǎn)間為一個(gè)抗性基因(例如CAT基因，CAT編碼氯霉素抗性蛋白)，抗性基因的表達(dá)，能方便我們篩選出目的基因轉(zhuǎn)座陽性的細(xì)菌。通過酶切或PCR，可以獲得目的基因轉(zhuǎn)座子基因片段。③通過轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的介導(dǎo)，將目的基因隨機(jī)插入到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的染色體上在OD600-0.4-0.6時(shí)收集運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌細(xì)胞，用冰預(yù)冷的無菌水清洗細(xì)胞一次隨即用10%甘油處理，并濃縮至約1000倍；將細(xì)胞等分并保存于-80'C下，從而制備好了運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的感受態(tài)細(xì)胞。在試管中將Tn5轉(zhuǎn)座酵、含有目的基因片段的轉(zhuǎn)座DNA混合，37'C10分鐘反應(yīng)后、隨即進(jìn)行電穿孔(BioRad基因脈沖發(fā)生器，0.1cm間隙容器，1.6kV,200ohms,25pFD),電轉(zhuǎn)化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。在氯霉素平板上篩選出的陽性菌落，進(jìn)行生物表型的分析或進(jìn)行染色體的DNA測序。(構(gòu)建過程示意圖，見圖13)④篩選目的基因轉(zhuǎn)座陽性的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對氯霉素抗性的菌種，選用耐高溫、耐強(qiáng)酸、耐高鹽等多項(xiàng)指標(biāo)，進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。2、操縱子質(zhì)粒轉(zhuǎn)化穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建將多順反子操縱子的DNA片段克隆至穿梭載體pZB188中(MetabolicEngineeringofaPentoseMetabolismPathwayinEthanologenicZymom.Zh油getal.Science13January1995:240-243),來構(gòu)建權(quán)力要求l所述的多順反子操縱子的穿梭質(zhì)粒。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌感受態(tài)細(xì)胞的制備1)、接種單菌落于5mLLB培養(yǎng)基，37'C溫和振搖培養(yǎng)5h或過夜。2)、將25mL培養(yǎng)物加入到盛有500mL,LB培養(yǎng)液的2L燒瓶中，37'C，振搖(200rpm)培養(yǎng)至OD600=0.5~O.6。3)、細(xì)菌在冰水浴冷卻15分鐘.然后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1升離心瓶中。于4'C,7000rpm離心20分鐘.沉淀用5mL預(yù)冷的水溶解。4)、加入500mL冰冷的水，混勻，于4'C,5000rpm重復(fù)離心1次，立即將上清倒掉.用殘余的液體重懸細(xì)胞。5)、a)新鮮制備的細(xì)菌:將懸浮液加入到預(yù)冷的50mL聚丙烯管中，4'C5000g離心10分鐘。估計(jì)細(xì)胞沉淀的體積(約500卩L/500mL培養(yǎng)液)，沉淀用等體積的冰冷水重懸(2x10"細(xì)胞/mL,)，并按50-200pL分裝于預(yù)冷的微量離心管中。b)凍存細(xì)菌，加入40mL冰冷的10X(v/v)甘油，混合，然后按照步驟5a離心.估計(jì)沉淀的體積.然后加入等體積的冰冷的10%甘油，重懸菌體。按50-20(HjL分裝于預(yù)冷的微量離心管中。于干冰上冷凍并貯存于8(TC。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化將電轉(zhuǎn)化儀調(diào)到2.5kV、25uF.脈沖控制器調(diào)至IJ200-400D。7)、將1[jL質(zhì)粒DNA(5pg0.5ug)加入到盛有新鮮制備的細(xì)菌或融化的凍存細(xì)菌的小管中，混勻。8)、將轉(zhuǎn)化混合物轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化池中，吸干池的外表面.然后放入樣品槽中。9)、進(jìn)行脈沖電轉(zhuǎn)化，然后取出電轉(zhuǎn)化池.馬上加入1mLS0C培養(yǎng)液，并且用巴斯德吸管轉(zhuǎn)移到無菌的培養(yǎng)管中，于37'C,中速振蕩培養(yǎng)30-60分鐘。10)、分小份涂布于含有抗生素的LB平板上。篩選目的轉(zhuǎn)化陽性的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，選用耐高溫、耐強(qiáng)酸、耐高鹽等多項(xiàng)指標(biāo)，進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。具體實(shí)施方法五熱休克蛋白操縱子，增加運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對多種逆境的抗性，提高發(fā)酵溫度。本發(fā)明利用熱休克蛋白操縱子，增加運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對多種逆境的抗性，增加乙醇的;^酵溫度。以Pyrococcusft;riosus的sH鄰基因?yàn)槔?，將neo/g鄰雙啟動(dòng)子調(diào)控的pfu-sHSP引入產(chǎn)乙醇運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中，可以增加運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對多種逆境的抗性，增加乙醇的發(fā)酵溫度。1材料與方法1.1熱休克蛋白操縱子的構(gòu)建(構(gòu)建過程示意圖，見圖14)以Pyrococcusft;riosus染色體為模板，擴(kuò)增熱休克蛋白基因pfu-sHSP，與neo/gap雙啟動(dòng)子串聯(lián)構(gòu)建質(zhì)粒ngHSP，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌；然后構(gòu)建ngHSP轉(zhuǎn)座載體后以轉(zhuǎn)座方式整合入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的基因組內(nèi)獲得重組體。以pUC18為模板，通過PCR擴(kuò)增，獲得其中的polylinker,并與neo/g鄰啟動(dòng)子相連，構(gòu)建ngLinker作為ngHSP的對照。1.2發(fā)酵試驗(yàn)細(xì)菌接種于含有葡萄糖的LB培養(yǎng)基中，分別對細(xì)菌生長速率、乙醇產(chǎn)量、耐滲透壓、耐酸度以及高溫高糖下的乙醇產(chǎn)量進(jìn)行了發(fā)酵試驗(yàn)比較。1.3乙醇的檢測乙醇含量的測定由氣相色譜測試完成。2結(jié)果2.1不同條件下兩細(xì)菌的發(fā)酵結(jié)果比較2丄lHsp對細(xì)菌生長速率的影響挑取細(xì)菌接種于RM培養(yǎng)基(2g/L的KH2P04、20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物)，37'C、200r/m過夜培養(yǎng)作為種子液，按5n/。(V/V)接種到18。/c葡萄糖RM發(fā)酵培養(yǎng)基中，37'C、200r/m培養(yǎng)至對數(shù)生長期；調(diào)整轉(zhuǎn)速60r/m繼續(xù)培養(yǎng)。分別在6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、72小時(shí)取樣測量吸光度(OD6oo)及乙醇產(chǎn)量。結(jié)果在18%高濃度的葡萄糖發(fā)酵液中，僅含有熱休克蛋白基因Hsp的細(xì)菌正常生長，而沒有導(dǎo)入Hsp基因的細(xì)菌則收到高濃度葡萄糖的影響，無法正常生長。證明Hsp基因在細(xì)胞受到壓力脅迫時(shí)，能起到保護(hù)作用。2丄2Hsp對細(xì)菌乙醇產(chǎn)量的影響細(xì)菌分別在含5%、18。/。葡萄糖的RM培養(yǎng)基中，37°C,80r/m，發(fā)酵72小時(shí)結(jié)果的比較。結(jié)果表明，在5%葡萄糖培養(yǎng)基中，含有Hsp基因的細(xì)菌乙醇產(chǎn)量，是不含有Hsp基因的細(xì)菌的1.20~5.00倍。在18%葡萄糖培養(yǎng)基中，含有Hsp基因的細(xì)菌乙醇產(chǎn)量，是不含有Hsp基因的細(xì)菌的1.305.00倍。證明Hsp基因能提高細(xì)胞發(fā)酵溫度以及乙醇產(chǎn)量。2丄3hsp對細(xì)菌耐滲透壓的影響細(xì)菌在37'CRM培養(yǎng)基(2g/L的KH2P04、20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物)，發(fā)酵24小時(shí)，對乙醇的生產(chǎn)率進(jìn)行比較。在0.4mol/LNaCl條件下，含有Hsp基因的細(xì)菌與不含有Hsp基因的細(xì)菌相比，乙醇生產(chǎn)率提高1.卜2.00倍；在0.17mol/LNaCl條件下，乙醇生產(chǎn)率提高1.卜2.00倍。因此證明熱休克蛋白對細(xì)胞的耐滲透壓有提高作用。2丄4Hsp對細(xì)菌耐酸度的影響細(xì)菌在RM培養(yǎng)基初始pH值4.5條件下(乙酸調(diào)節(jié))37'C發(fā)酵，對乙醇生產(chǎn)率進(jìn)行比較。當(dāng)在初始pH4.5時(shí)含有熱休克蛋白基因的細(xì)菌，其乙醇產(chǎn)量仍高于對照菌l.l2.00倍。在pH7.0條件下，含有熱休克蛋白基因的細(xì)菌，其乙醇產(chǎn)量為是對照細(xì)菌的1.2~2.00倍。2丄5Hsp對細(xì)菌同時(shí)存在高溫高糖條件下發(fā)酵乙醇的影響細(xì)菌分別在37'C和50'C,含18呢葡萄糖的RM培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)72小時(shí)。在37'C下含有H鄰基因的細(xì)菌，乙醇產(chǎn)量是對照細(xì)菌的1.1~9.25倍；在50'C下，含有Hsp基因細(xì)菌乙醇產(chǎn)量為不含有Hsp基因細(xì)菌的1."H8,7倍。由此可知，含有H鄰基因的細(xì)菌，即使在高溫高濃度的培養(yǎng)條件下，乙醇產(chǎn)量仍明顯高于不含有H鄰基因的細(xì)菌。因此，發(fā)現(xiàn)Hsp基因能提高的細(xì)菌在耐熱性。2.1.6經(jīng)過200次傳代，對基因重組細(xì)菌乙醇產(chǎn)量、耐酸度、耐熱的影響挑取細(xì)菌接種于RM培養(yǎng)基(2g/L的KH2P04、20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物)中，30'C、60rpm過夜培養(yǎng)作為種子液，按5義(V/V)接種到新鮮RM培養(yǎng)基中。如此反復(fù)200次后，按W。(V/V)接種到含有不同濃度乙酸培養(yǎng)基中(2g/L的KH2P04、20g/L葡萄糖、1%酵母提取物，0.1%~5%乙酸)，接種到含有不同濃度NaC賠養(yǎng)基中(2g/L的KH2P04、20g/L葡萄糖、1%酵母提取物，1%~10%NaCI)，分別在30-50'C培養(yǎng)，分別在6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、72小時(shí)取樣測量吸光度(OD咖)及乙醇產(chǎn)量。與不經(jīng)過傳代的對照菌相比，經(jīng)過200次傳代，乙醇的產(chǎn)量、耐酸度、耐熱、耐滲透壓的特點(diǎn)無明顯變化。具體實(shí)施方法五yWz、metB操縱子，降低運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生長過程中對培養(yǎng)物的營養(yǎng)要求天然運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的正常生長需要補(bǔ)充賴氨酸和甲硫氨酸。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌不能自行合成賴氨酸是由于缺乏yfdz基因，不能自行合成甲硫氨酸是由于缺乏me舊基因。在此，以E.coli為例，從E.coli染色體中克隆出yfdz基因和me舊基因，構(gòu)建其受neo或g鄰啟動(dòng)子調(diào)控的雙順反子操縱子，導(dǎo)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中，用于降低運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的營養(yǎng)需求。1.材料與方法1.1me氾、yfdz操縱子的構(gòu)建(構(gòu)建過程示意圖，見圖15)以￡.0)111<12染色體為模板，擴(kuò)增獲得基因me舊、yfdz，用neo/g鄰雙啟動(dòng)子串聯(lián)結(jié)構(gòu)基因yfdz、me舊構(gòu)建ngMY質(zhì)粒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌；然后構(gòu)建ngHSP轉(zhuǎn)座載體后以轉(zhuǎn)座方式整合入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的基因組內(nèi)獲得重組體。以pUC18為模板，通過PCR擴(kuò)增，獲得其中的polylinker,并與neo/g鄰啟動(dòng)子相連，構(gòu)建質(zhì)粒ngLinker作為ngMY的對照質(zhì)粒。示意圖見圖151.2發(fā)酵試驗(yàn)將重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌株接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(2g/L的KH2P04,20g/L葡萄糖)，往基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加酵母提取物可以獲得RM培養(yǎng)基(2g/L的KH2P04、20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物)。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度的酵母提取物，比較不同濃度酵母提取物對細(xì)菌生長速率、營養(yǎng)需求的差別。1.3乙醇的檢測乙醇含量的測定由氣相色譜測試完成。2結(jié)果2.1不同條件下細(xì)菌的發(fā)酵結(jié)果比較2丄1基因metB、yfdz對細(xì)菌生長速率和乙醇的產(chǎn)量的影響挑取細(xì)菌接種于RM培養(yǎng)基(2g/L的KH2P04、20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物)中，30'C、60rpm過夜培養(yǎng)作為種子液。按1W(V/V)接種到含有不同濃度酵母提取物的培養(yǎng)基中(2g/L的KH2P04、20g/L葡萄糖、0.1%~1%酵母提取物)，分別在6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、72小時(shí)取樣測量吸光度(OD6oo)及乙醇產(chǎn)量。與對照菌相比，基因metB、yfdz重組的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在各種濃度酵母提取物，細(xì)菌生長速度明顯加快，加快1.0510.0倍；乙醇的產(chǎn)量明顯增加，增加1.15~20.0倍。2.1.2經(jīng)過200次傳代，對基因重組細(xì)菌的影響挑取細(xì)菌接種于RM培養(yǎng)基(2g/L的KH2P04、20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物)中，30'C、60rpm過夜培養(yǎng)作為種子液，按5"54(V/V)接種到新鮮RM培養(yǎng)基中。如此反復(fù)200次后，按1M(V/V)接種到含有不同濃度酵母提取物的培養(yǎng)基中(2g/L的KH2P04、20g/L葡萄糖、0.1%-1%酵母提取物)，分別在30-50'C培養(yǎng)，分別在6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、72小時(shí)取樣測量吸光度(OD咖)及乙醇產(chǎn)量。^不經(jīng)過傳代的對照菌相比，經(jīng)過200次傳代，乙醇的產(chǎn)量、營養(yǎng)需求的特點(diǎn)無明顯變化。具體實(shí)施方法六營養(yǎng)需求降低、能利用五碳糖、能高溫發(fā)酵的轉(zhuǎn)座基因工程運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的構(gòu)建(構(gòu)建過程示意圖，見圖16)該實(shí)施例描述了構(gòu)建使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的營養(yǎng)需求降低、能利用五碳糖、能高溫發(fā)酵的多順反子操縱子的過程。該多順反子操縱子通過轉(zhuǎn)座方式(例如Tn5)整合到細(xì)菌染色體中，在缺乏抗生素選擇的情況下，基因的穩(wěn)定性仍然很高。在實(shí)施過程中，操縱子編碼的結(jié)構(gòu)基因序列，至少受一種可被運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌識別的啟動(dòng)子序列調(diào)控，本實(shí)施例所涉及的啟動(dòng)子包括Neo、Gap。操縱子編碼的結(jié)構(gòu)基因序列，至少包含下列三類基因中的一類基因1)操縱子包含編碼至少一種熱休克蛋白的基因序列，用于增加運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對逆境的耐受性和乙醇的產(chǎn)量；2)操縱子包含編碼至少一種微生物的賴氨酸合成代謝酶yfdz的基因序列，和包含編碼至少一種甲硫氨酸合成代謝酶metB的基因序列，用于降低運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在生長過程中對培養(yǎng)物的營養(yǎng)要求；3)操縱子包含編碼至'少一種戊糖利用和代謝酶的基因序列，這些基因包括分解木糖的2個(gè)基因、分解阿拉伯糖的3個(gè)基因、分解甘露糖的1個(gè)基因、戊糖磷酸化途徑的2個(gè)基因。分解木糖的2個(gè)基因?yàn)閤ylA(xyloseisomerase,木糖異構(gòu)酶，E.C.5.3.1.5)和XylB(xylulosekinase,木酮糖激酶，EC2.7.1.17);分解阿拉伯糖的3個(gè)基因?yàn)閍raA(L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，EC5.3.1.4)、araB(L-核酮糖激酶，EC3.1.1.15)、araD(L-核酮糖-5-磷酸斗差向異構(gòu)酶，EC4.2.1.43);分解甘露糖的基因?yàn)閙anA(甘露糖各磷酸異構(gòu)酶，EC5.3.1.8);戊糖磷酸化途徑的2個(gè)基因?yàn)門AL(transaldolase，轉(zhuǎn)二羥丙酮基酶，EC2.2.1.2)和TKT(transketolase,轉(zhuǎn)羥乙醛酶，EC2.2.1.1)}。由4個(gè)基因xylA、XylB、TAL、TKT構(gòu)成的操縱子，賦予運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌利用木糖產(chǎn)生乙醇的能力；由5個(gè)基因araA、araB、araD、TAL、TKT構(gòu)成的操縱子，賦予運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌利用阿拉伯糖產(chǎn)生乙醇的能力；由3個(gè)基因manA、TAL、TKT構(gòu)成的操縱子，賦予運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌利用甘露糖產(chǎn)生乙醇的能力；由7個(gè)基因xylA、Xy舊、araA、araB、araD、TAL、TKT構(gòu)成的操縱子，賦予運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌同時(shí)利用木糖和阿拉伯糖產(chǎn)生乙醇的能力由8個(gè)基因xylA、Xy舊、araA、araB、araD、manA、TAL、TKT構(gòu)成的操縱子，賦予運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌同時(shí)利用木糖、阿拉伯糖和甘露糖產(chǎn)生乙醇的能力。1材料與方法1.1重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的構(gòu)建步驟如下(示意圖見圖16。)①構(gòu)建包含編碼至少一種熱休克蛋白基因序列的操縱子，用于增加運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對逆境的耐受性和乙醇的產(chǎn)量；如圖所示，以PKracoccusfuriosus染色體為模板，擴(kuò)增熱休克蛋白基因pfu-sHSP,用neo/g鄰雙啟動(dòng)子串聯(lián)構(gòu)建ngHSP。②構(gòu)建包含編碼至少一種metB、yfdz操縱子的操縱子，用于降低運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生長過程中對培養(yǎng)物的營養(yǎng)要求。如圖16所示，以E.coliK12染色體為模板，擴(kuò)增獲得基因me氾、yfdz，用gap啟動(dòng)子串聯(lián)結(jié)構(gòu)基因yfdz、me舊構(gòu)建gMY。③構(gòu)建包含戊糖利用和代謝多順反子的操縱子，用于使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能利用木糖、阿拉伯糖和甘露糖產(chǎn)生乙醇。如圖16所示，以￡.001112染色體為模板，擴(kuò)增獲得基因xylA、XylB、araA、araB、araD、manA、TAL、TKT。構(gòu)建用gap調(diào)控結(jié)構(gòu)基因xylA/XylB(xylAB,為木糖利用基因)、araA/araB/araD(araBAD，為阿拉伯糖利用基因)、manA(為甘露糖利用基因)，用g鄰調(diào)控結(jié)構(gòu)基因TAL、TKT(戊糖磷酸化基因)的多順反子操縱子。由8個(gè)基因和2個(gè)啟動(dòng)子構(gòu)成的多順反子操縱子，賦予運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌同時(shí)利用木糖、阿拉伯糖和甘露糖產(chǎn)生乙醇的能力。④將上述①②③獲得的多順反子操縱子串聯(lián)后，插入到轉(zhuǎn)座載體(例如Tn5)的一對反向插入序列間。反向插入序列間還含有一個(gè)抗性基因(例如CAT基因，CAT編碼氯霉素抗性蛋白)，抗性基因便于我們將目的基因轉(zhuǎn)座陽性的細(xì)菌能篩選出來。(構(gòu)建過程示意圖，見圖17)⑤轉(zhuǎn)座系統(tǒng)介導(dǎo)目的基因向運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌染色體的隨機(jī)插入在0D60O0.4H).6時(shí)收集細(xì)胞，用冰預(yù)冷的無菌水清洗細(xì)胞一次隨即用10X甘油處理，并濃縮至約1000倍。將細(xì)胞等分并保存于"80'C下，從而制備電感受態(tài)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌細(xì)胞。⑥試管中將Tn5轉(zhuǎn)座酶、含有目的基因的轉(zhuǎn)座基因DNA混合，37'C10分鐘反應(yīng)后，隨即進(jìn)行電穿孔(BioRad基因脈沖發(fā)生器，0.1cm間隙容器，1.6kV,200ohms，25pFD),電轉(zhuǎn)化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。在氯霉素平板上篩選出的陽性菌落，進(jìn)行生物表型的分析或進(jìn)行染色體的DNA測序。(構(gòu)建過程示意圖，見圖13)⑦篩選目的基因轉(zhuǎn)座陽性的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對氯霉素抗性陽性的菌種，選用耐高溫、耐強(qiáng)酸、耐髙鹽等多項(xiàng)指標(biāo)，進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。1.2發(fā)酵試驗(yàn)將重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌株接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(2g/L的KH2P04,20g/L葡萄糖)，往基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加酵母提取物可以獲得RM培養(yǎng)基(2g/L的KH2P04、20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物)。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加酵母提取物，比較不同濃度酵母提取物對細(xì)菌生長速率、乙醇產(chǎn)量、耐滲透壓、耐酸度的差別。1.3乙醇的檢測乙醇含量的測定由氣相色譜測試完成。2.結(jié)果2.1不同條件下細(xì)菌的發(fā)酵結(jié)果比較2.1.1重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的生長速率和乙醇的產(chǎn)量變化挑取細(xì)菌接種于RM培養(yǎng)基(2g/L的KH2P04、20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物)中，30'C、60rpm過夜培養(yǎng)作為種子液，按iy。(WV)接種到含有不同濃度(0.1%~1%)酵母提取物的培養(yǎng)基中，分別在6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、72小時(shí)取樣測量吸光度(OD600)及乙醇產(chǎn)量。與對照菌(非重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌)相比，重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌在各種低濃度酵母提取物培養(yǎng)液中，細(xì)菌生長速度明顯加快，加快1.05~10.0倍；乙醇的產(chǎn)量明顯增加，增加1.15~20.0倍。2.1.2基因重組對細(xì)菌耐滲透壓的影響挑取細(xì)菌接種于RM培養(yǎng)基(2g/L的KH2P04、20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物)中，3(TC、60rpm過夜培養(yǎng)作為種子液，按5y。(V/V)接種到含有含2g/L的KH2P04、20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物和不同濃度NaCI的培養(yǎng)基中，對乙醇的生產(chǎn)率進(jìn)行比較。在0.4MNaCI條件下，重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌與對照菌相比，乙醇生產(chǎn)率提高1.1~20.00倍；在0.2MNaCI條件下，乙醇生產(chǎn)率提高1.1-15.00倍。2.1.3基因重組對細(xì)菌耐酸度的影響挑取細(xì)菌接種于RM培養(yǎng)基(2g/L的KH2P04、20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物)中，30'C、60rpm過夜培養(yǎng)作為種子液，按5。/。(V/V)接種到不同PH值(用乙酸調(diào)節(jié))的RM培養(yǎng)基培養(yǎng)基中，對乙醇的生產(chǎn)率進(jìn)行比較。當(dāng)在初始pH4.5(用乙酸調(diào)節(jié))時(shí)，重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌乙醇產(chǎn)量高于對照菌1.1~10.00倍。在pH7.0條件下，其乙醇產(chǎn)量為是對照細(xì)菌的1.2-10.00倍。2.1.4經(jīng)過200次傳代，基因重組細(xì)菌乙醇產(chǎn)量、耐酸度、耐熱的變化挑取細(xì)菌接種于RM培養(yǎng)基(2g/L的KH2P04、20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物)中，30'C、60rpm過夜培養(yǎng)作為種子液，按5n/4(V/V)接種到新鮮RM培養(yǎng)基中。如此反復(fù)200次后，按1呢(V/V)接種到含有不同濃度酵母提取物的培養(yǎng)基中(2g/L的KH2P04、20g/L葡萄糖、0.1%-1%酵母提取物)，接種到含有不同濃度乙酸培養(yǎng)基中(2g/L的KH2P04、20g/L葡萄糖、1%酵母提取物，0.1%-10%乙酸)，接種到含有不同濃度NaC瞎養(yǎng)基中(2g/L的KH2P04、20g/L葡萄糖、1%酵母提取物，1%-15%NaCI)，分別在30-50'C培養(yǎng)，分別在6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、72小時(shí)取樣測量吸光度(ODeoo)及乙與不經(jīng)過傳代的對照菌相比，經(jīng)過200次傳代，乙醇的產(chǎn)量、耐酸度、耐熱、耐滲透壓、利用戊糖生成乙醇的特點(diǎn)無明顯變化。權(quán)利要求1.一種通過導(dǎo)入操縱子來修飾運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的基因的方法。該操縱子可以在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中表達(dá)，使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對逆境的耐受性增加、能在較高的溫度下發(fā)酵生成乙醇、對培養(yǎng)物的營養(yǎng)要求降低、同時(shí)還能利用戊糖生成乙醇、經(jīng)過200次傳代仍然穩(wěn)定保留上述遺傳特點(diǎn)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的操縱子，含有編碼至少一種熱休克蛋白結(jié)構(gòu)基因序列，用于增加運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對逆境的耐受性和增加乙醇發(fā)酵溫度；3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的操縱子，含有編碼至少一種賴氨酸合成代謝酶yf也結(jié)構(gòu)基因的序列，使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能夠自行合成賴氨酸，用于降低運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生長過程對培養(yǎng)物的營養(yǎng)要求；含有編碼至少一種甲硫氨酸合成代謝酶me舊結(jié)構(gòu)基因的序列，使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能夠自行合成甲硫氨酸，用于降低運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生長過程中對培養(yǎng)物的營養(yǎng)要求。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的操縱子，包括編碼至少一種可以在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中表達(dá)的下列結(jié)構(gòu)基因序列編碼HSP的結(jié)構(gòu)基因序列、編碼yftfe的結(jié)構(gòu)基因序列、編碼me滔的結(jié)構(gòu)基因序列。其中由3個(gè)結(jié)構(gòu)基因HSP、yftfe、me舊構(gòu)成的多順反子操縱子，能同時(shí)使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對逆境的耐受性增加，對培養(yǎng)物的營養(yǎng)要求降低，能在較髙的溫度下發(fā)酵生成乙醇。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的操縱子，包含編碼使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌利用至少一種戊糖產(chǎn)生乙醇的結(jié)構(gòu)基因序列，并且包括編碼至少一種可以在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中表達(dá)的下列結(jié)構(gòu)基因序列編碼HSP的結(jié)構(gòu)基因序列，編碼yftfe的結(jié)構(gòu)基因序列、編碼me舊的結(jié)構(gòu)基因序列。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌利用戊糖(木糖、阿拉伯糖、甘露糖)生成乙醇的操縱子，有關(guān)的結(jié)構(gòu)基因有8個(gè)。有關(guān)利用木糖的2個(gè)基因，含有編碼至少一種(xy/ose/'somerase，木糖異構(gòu)酶，E.C.5.3.1.5)和含有編碼至少一種xy舊(xy/u/oseWnase,木酮糖激酶，EC2.7.1.17);有關(guān)利用阿拉伯糖的3個(gè)基因，含有編碼至少一種ara/A(L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，EC5.3.1.4)、含有編碼至少一禾中araS(L-核酮糖激酶，EC3.1.1.15)、含有編碼至少一種ara。(L-核酮糖-5-磷酸4-差向異構(gòu)酶，EC4.2.1.43);有關(guān)利用甘露糖的基因，含有編碼至少一種man>A(甘露糖"6-磷酸異構(gòu)酶，EC5.3.1.8);有關(guān)戊糖磷酸化的2個(gè)基因，含有編碼至少一種7>W_(fransa/cto/ase,轉(zhuǎn)二羥丙酮基酶，EC2.2.1.2)和含有編碼至少一種7XT(的ns紐to/ase，轉(zhuǎn)羥乙醛酶，EC2.2.1.1)}。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用戊糖生成乙醇的操縱子，可以在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中表達(dá)，包括編碼至少一種下列操縱子第一種操縱子是包含編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)基因xyM、xy舊、"ML、7XT的操縱子，使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能夠利用木糖產(chǎn)生乙醇；第二種操縱子是包含編碼5個(gè)結(jié)構(gòu)基因araA、araS、araD、TiAL、7XT的操縱子，使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能夠利用阿拉伯糖產(chǎn)生乙醇。第三種操縱子是包含編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)基因man/A、"ML、TK7"的操縱子，使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能夠利用甘露糖產(chǎn)生乙醇。第四種操縱子是包含編碼7個(gè)結(jié)構(gòu)基因xyA4、xy/S、a/a力、a/aS、araD、7XT的操縱子，使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能夠同時(shí)利用木糖和阿拉伯糖產(chǎn)生乙醇。第五種操縱子是包含編碼8個(gè)結(jié)構(gòu)基因xyW、xy舊、ara/Lara8、araD、man/A、7V\L、7X7"的操縱子，使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能夠同時(shí)利用木糖、阿拉伯糖和甘露糖產(chǎn)生乙醇。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述，操縱子包含編碼至少一種啟動(dòng)子的序列，序列可被運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌識別、調(diào)控至少一種結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。啟動(dòng)子包括tec、/ac、77、7"3、7"5、鄰6、pL、pR、"eM、araS4/、frc、frp、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的w的啟動(dòng)子、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的G鄰啟動(dòng)子。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，操縱子通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方式進(jìn)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌獲得基因工程菌，操縱子的眾多基因可以以串聯(lián)的方式同時(shí)存在于一個(gè)質(zhì)粒上，經(jīng)轉(zhuǎn)化一次性進(jìn)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌；或眾多基因分布于多個(gè)質(zhì)粒上，經(jīng)多次轉(zhuǎn)化進(jìn)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，操縱子通過轉(zhuǎn)座方式整合入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的基因組內(nèi)獲得基因工程整合體；操縱子的眾多基因可以以串聯(lián)的方式同時(shí)存在于一個(gè)轉(zhuǎn)座載體上，操縱子可以一次全部轉(zhuǎn)座整合入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的基因組內(nèi)；或眾多基因分布于多個(gè)轉(zhuǎn)座載體上，經(jīng)多次轉(zhuǎn)座整合入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的基因組內(nèi)。全文摘要一種構(gòu)建基因重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，應(yīng)用于乙醇發(fā)酵的方法。該微生物是通過導(dǎo)入可以在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中表達(dá)的操縱子而獲得的。操縱子主要由編碼啟動(dòng)子的序列和編碼結(jié)構(gòu)基因的序列組成。操縱子包含編碼至少一種啟動(dòng)子的序列，這個(gè)啟動(dòng)子的序列可被運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌識別、調(diào)控至少一種以上結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。操縱子包含編碼至少一種熱休克蛋白HSP的序列，用于增加運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對逆境的耐受性和提高乙醇發(fā)酵溫度；操縱子包含編碼至少一種賴氨酸合成代謝酶yfdz的序列，使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能夠自行合成賴氨酸，包含編碼至少一種甲硫氨酸合成代謝酶metB的序列，使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能夠自行合成甲硫氨酸，用于降低運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生長對培養(yǎng)物的營養(yǎng)要求；操縱子同時(shí)還包含編碼使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能利用至少一種戊糖產(chǎn)生乙醇的結(jié)構(gòu)基因序列，使運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能利用戊糖生成乙醇。操縱子通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方式進(jìn)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，或通過轉(zhuǎn)座方式整合入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的基因組內(nèi)獲得轉(zhuǎn)座重組體。該種基因工程運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌對逆境的耐受性增加、能在較高的溫度下發(fā)酵生成乙醇、對培養(yǎng)物的營養(yǎng)要求顯著降低、能夠利用戊糖生成乙醇，經(jīng)過200次傳代仍然穩(wěn)定保留上述特點(diǎn)。文檔編號C12P7/06GK101565706SQ20081004745公開日2009年10月28日申請日期2008年4月25日優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日發(fā)明者汪浩勇申請人:武漢市星站生物技術(shù)有限公司