專利名稱：：抗對蝦白斑綜合癥病毒工程蛋白vp28-cd及制備和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。更具體涉及一種重組融合蛋白VP28-CD亞單位疫苗，同時還涉及一種大腸桿菌基因工程菌株的制備方法，具體涉及構(gòu)建和高效表達(dá)可溶對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28和家蠶抗菌肽Cecrc^'"Z)成熟肽(CD)融合蛋白的基因工程菌株；涉及酸水解位點(diǎn)天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)的插入；還涉及上述菌株所表達(dá)的一種雙功能融合蛋白在對蝦抗WSSV及抑殺其它病原微生物中的用途。
背景技術(shù)：
：20世紀(jì)80年代以來，世界沿海各國的對蝦養(yǎng)殖業(yè)蓬勃發(fā)展，隨著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的企業(yè)化生產(chǎn)，其病害也日益突出，特別是對蝦病毒性傳染病己成了阻礙這一產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。我國是全球最大的對蝦生產(chǎn)國之一，1993-1994年我國對蝦病毒病暴發(fā)流行，年產(chǎn)量減少70%以上，給我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成數(shù)十億元的經(jīng)濟(jì)損失(陳憲春.世界性蝦病蔓延及我國蝦病防治進(jìn)展[J].中國飼料，1995,11:10-11.)。近年來的對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)、黃頭癥病毒(YHV)和桃拉綜合征病毒(TSV)等病毒性傳染病在世界各地廣泛流行，除給對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失之外，還對海洋資源的可持續(xù)發(fā)展造成巨大威脅。其中WSSV是迄今為止對對蝦養(yǎng)殖業(yè)危害性最為嚴(yán)重的病原體之一。WSSV于20世紀(jì)90年代初首發(fā)于臺灣，至今已席巻世界各國的對蝦養(yǎng)殖地區(qū)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。1993年58月WSSV在我國大陸沿海從南到北的養(yǎng)殖場暴發(fā)，日本等亞洲國家的對蝦養(yǎng)殖場也相繼暴發(fā)了此病。目前，在亞洲已報道的該病毒的流行國家和地區(qū)包括朝鮮、泰國、韓國、印度尼西亞、越南、馬來西亞、印度、斯里蘭卡、孟加拉國、中國大陸沿海及臺灣省等。1995年，美國德克薩斯州對蝦養(yǎng)殖場出現(xiàn)白斑綜合征病毒，并在西半球的其它地區(qū)相繼暴發(fā)。至此，WSSV在世界范圍內(nèi)傳播開來，每年給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成幾百億元的經(jīng)濟(jì)損失，成為威脅對蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要疾病。1995年，國際獸疫局(OIE)、聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)以及亞太地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展網(wǎng)絡(luò)中心(NACA)將其列為需要報告的水生動物病毒性疫病之一。WSSV是一種有囊膜的環(huán)狀雙鏈DNA病毒，呈螺旋狀，屬于Nimaviridae科，Whispovirus屬，是已知最大的動物DNA病毒。其病毒粒子直徑約65~70nm，長約300ran，呈現(xiàn)卵圓形至短桿狀，無包涵體，在末端有一尾狀延伸，囊膜內(nèi)包裹桿狀的呈垂直螺旋帶條紋的核衣殼。目前，普遍認(rèn)為WSSV存在水平傳播(經(jīng)口感染或接觸感染)及垂直傳播(經(jīng)卵傳遞給子代)兩種傳播途徑。近年來，國內(nèi)外一些學(xué)者大量投入WSSV分子水平的研究，鑒于其基因組序列與基因庫中已知基因的同源性很低，國際病毒分類委員會己將WSSV確定為一種新的無脊椎動物病毒。Van等報道WSSV基因組為292967bp(AF36卯29)，其大部分基因功能都未知，目前被鑒定的結(jié)構(gòu)蛋白基因至少有18個，其中已確定的囊膜蛋白有5個(VP28,VP26/P22,VP19,VP466及VP281),而VP28是其主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，由ORFl所編碼，其N端有一高度疏水的oc螺旋跨膜區(qū)域，是位于病毒囊膜的主要抗原蛋白。已有研究證據(jù)表明，對蝦免疫系統(tǒng)不僅存在非特異性免疫，而且對WSSV也存在一定的特異性免疫應(yīng)答。盡管對WSSV感染引起的免疫反應(yīng)分子機(jī)制研究甚少，但目前已有報道WSSV主要抗原蛋白可能在感染過程中的作用。Van等通過用WSSVVP28抗血清對斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)的體內(nèi)中和試驗(yàn)表明，囊膜蛋白VP28對機(jī)體具有免疫保護(hù)性，推測可能是由于VP28阻斷了病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合，從而抑制病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合；而Witteveldt等(WitteveldtJ,CifiientesCC,VlakJM，etal.ProtectionofPenaeusmonodonagainstWhiteSpotSyndromeVirusbyoralvaccination[J].JVirol,2004,78(4):2057-2061.)實(shí)驗(yàn)顯示VP28的免疫保護(hù)力可達(dá)3周，提示VP28可能在WSSV感染后還誘導(dǎo)產(chǎn)生類血清中和因子。龍燕等(龍燕，等。對蟲下白斑綜合征病毒囊膜蛋白VP28的表達(dá)及其抗病毒感染作用[J]。中國病毒學(xué)，2006,21(2):178-180.)將純化的VP28注射和投喂螯蝦均明顯提高了螯蝦的抗WSSV感染力的能力，這進(jìn)一步證實(shí)了WSSV的結(jié)構(gòu)蛋白可以被螯蝦的免疫系統(tǒng)所識別。WSSV的宿主非常廣泛，已發(fā)現(xiàn)和確定的有近40種。世界上所有的人工養(yǎng)殖對蝦種類、大部分野生蝦蟹類等都是WSSV的宿主。根據(jù)蝦蟹感染W(wǎng)SSV后的表現(xiàn)，這些宿主可分為兩類敏感載體(acutecarriers)和可能載體(potentialcarriers)。主要養(yǎng)殖對蟲下斑節(jié)對蟲下(Penaeusmonodon)、曰本囊對蟲下(Marsupenaeusaponicus)、中國明對蟲下(Fenneropenaeuschinensis)、長毛明對蟲下(F.penicillatus)、凡納濱對蟲下(Litopenaeusvannatnei)、刀額新對蟲下(Metapenaeusensis)及野生短鉤對蟲下P.semisuleatus、脊尾白蝦(Exoplaemoncarinicauda)體內(nèi)均能檢出WSSV陽性，它們是WSSV的敏感載體。養(yǎng)殖對蝦等敏感載體除自身對WSSV敏感外，其喜好殘食的生活習(xí)性進(jìn)一步加速了WSSV的橫向傳播。野生蟲下E.orientalis、Trachyenaeuscuvirostris、M.ensis、沼蟲下Macr0br9chiumsp、'克氏原螯蟲下Procambarusclarkii，野生蟹子Calappalophos、Portunussanguinolentus、Charybdisgranulata、C.feriata、Hemigrapsussanguineus禾口野生龍蝦Panulirusornatus、P.longipes、P.penicillatus等雖不呈WSSV陽性，但它們可被WSSV感染，且許多被感染個體不引起疾病癥狀，它們是WSSV的可能載體。野生蝦、蟹等WSSV的無癥狀攜帶者盡管在水產(chǎn)上不重要，但它們廣泛分布于對蝦養(yǎng)殖場，它們的可感染性在WSSV的水平傳播中起著重要作用。關(guān)于鹵蟲、輪蟲等生物在傳播WSSV中的作用近幾年也有報道。對蝦白斑綜合癥(whitespotsyndrome,WSS)是由WSSV引起的以感染對蝦甲殼內(nèi)側(cè)出現(xiàn)白色斑點(diǎn)為主要特征的暴發(fā)性傳染病。WSSV的感染力極強(qiáng)，WSS的發(fā)展分3各階段。初期病蝦游動緩慢，拒食，偶爾浮出水面；中期病蝦靜臥水底，腸胃空虛，頭胸甲和腹甲被揭開，且不粘連表皮，在皮下、甲殼及附肢出現(xiàn)直徑為0.52mm大小不等的白色斑點(diǎn)；后期病蝦對外界刺激反應(yīng)遲鈍，大多蟲下體微紅，腹節(jié)肌肉略白，血淋巴稀薄不凝固，在3-7日內(nèi)致死率高達(dá)卯-100%。通過對感染病毒后的組織進(jìn)行病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，對蝦的鰓、胃、淋巴器官等受到嚴(yán)重破環(huán)。病毒感染早期的特征表現(xiàn)為宿主的細(xì)胞核腫大，染色質(zhì)邊移。超薄切片觀察發(fā)現(xiàn)大量病毒粒子集中在被感染的細(xì)胞核內(nèi)。ffSSV目前尚無有效的防治方法。對蝦和其它無脊椎動物一樣，缺乏脊椎動物特異的抗原/抗體免疫反應(yīng)機(jī)制，因此寄希望于通過免疫來控制WSS是不切實(shí)際的。提高對蝦機(jī)體的抗病能力，優(yōu)化蝦池生態(tài)環(huán)境，改善對蝦養(yǎng)殖環(huán)境，加強(qiáng)科學(xué)飼養(yǎng)管理，是目前防治病毒感染的最有效手段。有報道多糖、生物堿、酮類、有機(jī)酸等能激活免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)對蝦的抗病能力,如Itami等(ItamiT.EnhancementofdiseaseinsistenceofKurumashrimppenaeuj印onicus，afteroraladministrationofpeptidoglycanderivedfromBifidobacteriumthemophilum[J].Aquaculture，1998,164:277-288.)利用從細(xì)菌提取的肽聚糖喂對蝦，發(fā)現(xiàn)對蝦血淋巴的免疫活性和抗毒力得到明顯的提高；1995年Direkbusarakom等(DirekbusarakomS.EffectofPhyllanthusspp.againstyellow-headbaculovirusinfectioninblacktigershrimp,penaeusmondon[M].In:DiseasesinAsianAquacultureII.MShariff,J.R.ArthurRPSubasinghe(eds.)，F(xiàn)ishHealthSection,AsianFish-eriesSociety,Manila,1995:81-88.),李春猛(李春猛.中國對蝦免疫力的增強(qiáng)途徑[D].山東青島青島海洋大學(xué)，1995:26-35.)利用口服多糖或中草藥能使對蝦抗病力提髙，王安利等也報道(王安利，王維娜.對蝦病毒性流行病防治新技術(shù)研究[A].首屆世界華人蝦類養(yǎng)殖研討會論文等.北京海洋出版社，1998:42-49.)釆用免疫增強(qiáng)劑提高對蝦苗和對蝦免疫力，但均成本較高，勞動量大，技術(shù)復(fù)雜。也有報道通過轉(zhuǎn)基因的方法將某種基因?qū)爰轶w，培育優(yōu)質(zhì)抗病的對蝦新品種，如劉志毅等(劉志毅，等。用基因槍將外源DNA導(dǎo)入中國對蝦。中國通報。2000，45(23):2539-2544)利用基因槍的方法轉(zhuǎn)移了綠色熒光蛋白基因作為報告基因的重組抗對蝦WSSV核酶基因的質(zhì)粒pGDNA-RZI，成功得到了轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因的中國對蝦個體，但其技術(shù)要求高，效率較低。也有人發(fā)現(xiàn)，通過免疫病毒基因重組蛋白可以誘導(dǎo)對蝦產(chǎn)生抗病保護(hù)效應(yīng)。如Witteveldt等(WitteveldtJ,CifuentesCC,VlakJM,etal.ProtectionofPenaeusmonodonagainstWhiteSpotSyndromeVirusbyoralvaccination[J].JVirol，2004,78(4):2057-2061.)用E.coli表達(dá)重組WSSV囊膜蛋白VP28口服免疫斑節(jié)對蝦，7天后浸浴攻毒免疫保護(hù)率達(dá)77%?？咕?antimicrobialp印tides)是在誘導(dǎo)條件下，昆蟲產(chǎn)生的一類對抗外源性病原體致病作用的防御性多肽類物質(zhì)的總稱，具有"傳統(tǒng)抗生素"無法比擬的優(yōu)越性:不會誘導(dǎo)抗藥菌株的產(chǎn)生，有希望成為新一代抗菌劑。1975年瑞典科學(xué)家G.Boman等人(STEINERHD,fflJLTMARKA,ENGSTR0MH，etal.Sequenceandspecificityoftwoantibacterialtwoantibacterialproteinsinvolvedininsecti畫nity[J].Nature,1981,292:246-248.)從惜古比天蠶(Hyatophoracecropia)蛹中誘導(dǎo)分離得到一種殺菌肽，并將其命名為cecropin。此后，許多抗菌肽相繼被分離、純化。一些抗菌肽的氨基酸一級結(jié)構(gòu)和基因序列得到確定。80年代，有關(guān)抗菌肽的研究主要集中在大型的經(jīng)濟(jì)昆蟲。90年代以來，在繼續(xù)對大型經(jīng)濟(jì)昆蟲進(jìn)行研究的同時,又?jǐn)U展到一些小型昆蟲和其它無脊椎及脊椎動物,抗菌肽己成為免疫學(xué)和分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，其中昆蟲抗菌肽基因工程研究最受重視。目前已發(fā)現(xiàn)抗菌肽或類似抗菌肽的小分子肽類廣泛存在于生物界,包括細(xì)菌、動植物和人類。這種內(nèi)源性的抗菌肽經(jīng)誘導(dǎo)而合成,在機(jī)體抵抗病原的入侵方面起著重要的作用，更被認(rèn)為是缺乏特異性免疫功能生物的重要防御成分?？咕木哂袕V譜殺菌作用，大多數(shù)對革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的殺滅作用，有些則對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均起作用。對某些真菌、原生動物，尤其對耐藥性細(xì)菌有殺滅作用，并能選擇殺傷腫瘤細(xì)胞,抑制乙型肝炎病毒的復(fù)制。迄今為止從不同生物體內(nèi)誘導(dǎo)的抗菌肽已不下200種，僅從昆蟲體內(nèi)分離獲得的就多達(dá)170余種。根據(jù)抗菌肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可將其分為5類(l)單鏈無半胱氨酸(Cys)的抗菌肽，或由無規(guī)則巻曲連接的兩段a-螺旋組成的肽。該類包括天蠶素Cecropins,Magainins等。Magainins最初是從非洲爪蟾的皮膚中發(fā)現(xiàn)的，它是爪蟾的皮膚在一定的環(huán)境壓力下分泌出的抗感染和促進(jìn)傷口愈合的成分，由兩個緊密相連的肽鏈組成,每一個肽鏈有23個氨基酸，低濃度便可抑制許多細(xì)菌和真菌生長(ZaslofM,etal.ProcNatlAcadSciUSA,1987，84:5449-5455)。(2)富含某些氨基酸殘基但不含Cys的抗菌肽。如富含脯氨酸(Pro)或甘氨酸(Gly)殘基的抗菌肽。如從豬腸內(nèi)分離的抗菌肽PR39中Pro含量占49%[6]。鞘翅肽Coleoptericin和半翅肽Hemiptericin的全序中富含Gly(BAgerberth,JYLee，etal.EuropeanJournalofBiochemistry,1991,202:849854.)。(3)含一個二硫鍵的抗菌肽，該二硫鍵的位置通常在肽鏈C端。如爪蟾皮膚細(xì)胞中產(chǎn)生的Brevinins(陳留存,王金星.生物工程進(jìn)展，1999,19(5):55-59.)。(4)有兩個或兩個以上二硫鍵，具有P折疊結(jié)構(gòu),的抗菌肽。如綠蠅防御素(Phormindefensin),分子內(nèi)有6個Cys形成3個分子內(nèi)二硫鍵,肽鏈C末段是帶有擬e轉(zhuǎn)角的反向平行的e片層(饒賢才，胡福泉，等.生命的化學(xué),2001,21(5):357359.)。實(shí)驗(yàn)證明，分子中的二硫鍵在其抗菌作用中至關(guān)重要。(5)由其他已知功能較大的多肽衍生而來的具有抗菌活力的肽。20多年來,人們對抗菌肽已進(jìn)行了比較系統(tǒng)的理論和應(yīng)用研究,其作用及機(jī)理如下抗菌肽的抗菌作用及其機(jī)理抗菌肽分子可以在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜上穿孔而形成離子孔道,造成細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，引起胞內(nèi)水溶性物質(zhì)大量滲出，而最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡?？咕姆肿邮紫冉Y(jié)合在質(zhì)膜上，接著其分子中的疏水段和兩親性a-螺旋也插入到質(zhì)膜中，最終通過膜內(nèi)分子間的相互位移，抗菌肽分子聚集形成離子性通道，使細(xì)菌失去膜勢而死亡。但是Gazit(GazitE，etal.[J].Biochemistry,1994,33(35):10681-10692.)等得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗菌肽只是結(jié)合到了單位膜的表面上，并未插入膜中，更未形成通道。然而，抗菌肽的作用靶部位是細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜，以及抗菌肽的作用結(jié)果是導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜通透性增大等基本內(nèi)容是確切無疑的，這也正是抗菌肽與青霉素等傳統(tǒng)抗生素對細(xì)菌作用機(jī)制不同的本質(zhì)所在?？咕牡目共《咀饔眉捌錂C(jī)理研究發(fā)現(xiàn)煙芽夜蛾幼奸的血淋巴對6種DNA、RNA病毒有明顯的抑制作用，使病毒感染力迅速降低，而且這種抗病毒活性具有廣譜性。Mariam(MariamE.etal.[J〗.InternationalJofAntimicrobialAgents,1999，13:57-60.)試驗(yàn)表明來源于爪蟾的抗菌肽Magainins及其它Magainins類抗菌肽具有抗皰疹病毒-HSV的作用，還發(fā)現(xiàn)人的嗜中性粒細(xì)胞防御素(HNP-l)對一種皰疹病毒有抑制作用。此外，蜂毒素和天蠶素也可以在亞毒性濃度下抑制艾滋病毒HIV-1的基因表達(dá),從而抑制減少HIV-1的增殖。這表明抗菌肽對于當(dāng)今人類的頑癥——艾滋病也有抑制作用。抗菌肽的抗寄生蟲作用及其機(jī)理抗菌肽可以有效地殺滅產(chǎn)生人類及動物寄生蟲病的寄生蟲,如瘧疾、Chagas氏病、萊什曼病等。目前發(fā)現(xiàn)一種合成的天蠶素-蜂毒素雜合體對萊什曼原鞭毛蟲有損傷作用，起作用的靶目標(biāo)是細(xì)胞質(zhì)膜,它可以快速降低H-0H+的通透性，破壞膜電勢，質(zhì)膜形態(tài)也受到損壞。Shahabuddin(ShahabuddinM,etal.[J].ExperimentalParasitogy,1998,89(l):103-112.)研究發(fā)現(xiàn)昆蟲抗菌肽對感染蚊子的瘧原蟲發(fā)育的不同時期有不同的作用，主要對瘧原蟲的卵囊期和子孢子期造成明顯的損傷?？咕膶δ[瘤細(xì)胞作用及其機(jī)理國內(nèi)外己對抗菌肽殺傷腫瘤細(xì)胞的作用進(jìn)行了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)抗菌肽對體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞的作用主要是使癌細(xì)胞膜上形成孔洞，內(nèi)容物外泄，線粒體出現(xiàn)空泡化,嵴脫落。核膜界限模糊不清,有的核膜破損,核染色體DNA斷裂，并抑制染色體DNA的合成，細(xì)胞骨架也受到一定程度的損傷(王芳，等.[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1998，25(1):64-67.賈紅武，等.[J].蠶業(yè)科學(xué),1996，22(4):62.)。通過對荷瘤小鼠的研究證明,抗菌肽能顯著抑制ECA腹水瘤荷瘤小鼠腹水的積累；對S180肉瘤和U14宮頸癌的抑瘤率亦達(dá)30%-50%(許玉澄,等.[J].動物學(xué)研究,1998,19(4):263-268.)?？咕倪€可以調(diào)動機(jī)體的免疫機(jī)能,從體液免疫方面來抵抗癌瘤的入侵?？咕牡奶烊划a(chǎn)量低,合成或從機(jī)體中提取步驟復(fù)雜、產(chǎn)率低、價格相當(dāng)昂貴,利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗菌肽具有重要意義?？咕乃鶖y帶的堿性氨基酸使其對蛋白酶非常敏感,必須采用融合表達(dá)策略以抵消其堿性并降低其對宿主細(xì)胞的毒性。謝維等合成了家蠶抗菌肽CMIV基因，并將其克隆到金黃色葡萄球菌A蛋白和IgG親合的結(jié)構(gòu)域ZZ的融合表達(dá)載體中，得到Pezz318-CMIW質(zhì)粒，以此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliHB101,得到ZZ-CMIV融合表達(dá)的蛋白，用CNBr切割后,得到CMIV肽。李秀蘭等(李秀蘭等.家蠶抗菌肽CMIV基因結(jié)構(gòu)改造及表達(dá)產(chǎn)物的研究[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，1999，15(3):387-391.)對天然抗菌肽CMIV的氨基酸序列作了50%的改動，根據(jù)E.coli偏愛的密碼子人工合成了肽基因片斷,重組到測序載體,再將此片斷重組到表達(dá)載體Pet-28上進(jìn)行表達(dá)，融合蛋白經(jīng)CNBr裂解后，具有與天然抗菌肽相同的生物活性。吳映雅等將柞蠶抗菌肽D基因連接在牛成纖維細(xì)胞生長因子cDNA的上游,在酵母中成功地得到了表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物具有抗菌活性和牛成纖維細(xì)胞生長因子的抗原性。Kevin等(KevinLP,MelissaHB,RoberEW.RecombinantDNAproceduresforproducingsmallantimicrobialcationicp印tideinbacteria[J].Gene.1993,134:7-13.).將HNP(h畫nneutrophilp印tide1)和CEME(syntheticcecropin/melittinhybrid)分另!j與GST(glutathione-S-transferase)、0RRF、IgG結(jié)合序列及SPA(staphylococcalproteinA)在E.coli或S.aureus中融合表達(dá)，結(jié)果在S.aureus中雖實(shí)現(xiàn)了與SPA的融合分泌表達(dá),但表達(dá)產(chǎn)量較低；Zhang等(ZhangL，F(xiàn)allaT，WuM,etal.DetennintsofrecombinantproductionofantimicrobialcationicpeptidesandcreationofpeptidevariantinbacteriaLj].BiochemBiophys.Res.Com隨n.1998，247:674-680.)選擇R印A蛋白的序列作為抗菌肽的融合表達(dá)伴侶，并插入Histag等序列作為純化親和位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了在E.coli中的融合表達(dá)。ChristsnenB等研究中得到的融合抗菌肽的抗菌活性比其任何一個供體抗菌肽的活性都高?？咕暮透蓴_素、補(bǔ)體一樣是機(jī)體非特異性天然防御系統(tǒng)的重要組成部分。機(jī)體受損傷或病原微生物入侵時，能迅速產(chǎn)生抗菌肽來殺傷入侵者，它對正常真核細(xì)胞幾乎沒有作用，而且許多抗菌肽在IOO'C加熱10min條件下仍能保持一定活力，且對較大的離子強(qiáng)度和較低或較高的PH都有較強(qiáng)的抗性。另外，因?yàn)榭咕牡暮铣伤俣确浅？?假定核糖體上肽鍵合成速率不變,抗菌肽的產(chǎn)生比IgM要快100多倍)，而且小肽的擴(kuò)散比大的蛋白質(zhì)和免疫細(xì)胞更加迅速,作用更顯靈活,所以Boman曾指出，抗菌肽是機(jī)體的一種理想的一線防御物。與普通抗生素相比，抗菌肽的"抗菌譜"更廣，除了抗細(xì)菌外,有的抗菌肽還能作用于真菌、原蟲、有包膜的病毒及癌細(xì)胞(對癌細(xì)胞的選擇性作用可能與其細(xì)胞骨架的改變有關(guān))，同時能加速免疫和傷口愈合過程。這預(yù)示抗菌肽在治療及預(yù)防癌癥和抗病毒、抗感染等方面具有良好的應(yīng)用前景。更為重要的是，由于抗生素的濫用導(dǎo)致菌株產(chǎn)生了抗性,人們需要尋找新的抗菌藥劑?？咕倪@種從生物體中獲得的物質(zhì)恰巧具有獨(dú)特的抗菌機(jī)理，不是像一般的抗生素那樣通過阻斷生物大分子的生物合成來發(fā)揮作用，因而極有希望開發(fā)成為一類新型的廣譜高效抗菌藥物。然而，由于抗菌肽分子小，分離提純存在一定的困難,故天然資源有限?；瘜W(xué)合成和基因工程法獲得抗菌肽是主要手段,但化學(xué)合成抗菌肽成本高，而通過基因工程在微生物中直接表達(dá)抗菌肽基因，則可能對宿主有害而不能獲取表達(dá)產(chǎn)物。家蠶抗菌肽CecropionD,最早從家蠶免疫血淋巴中分離得到的高效抗菌肽。其具有熱穩(wěn)定性，水溶性好，對較強(qiáng)的離子強(qiáng)度和較高或較低的H1都有較強(qiáng)的耐受性。家蠶抗菌肽CD成熟肽為陽離子小蛋白，二級結(jié)構(gòu)上主要含兩個(x-螺旋。根據(jù)文獻(xiàn)(ZhangL，RozekA，HancockREW.Interactionofcationicantimicrobialpeptideswithmodelmembranes[J].JBiolChem'2001,276:35714-35722.)報道，陽離子抗菌肽蛋白最主要的作用機(jī)制為通過其兩親性a-螺旋上正電荷與細(xì)胞質(zhì)膜磷脂分子上負(fù)電荷之間的靜電吸引而結(jié)合聚集在質(zhì)膜上，隨后抗菌肽分子中的疏水段C端(酰胺基)a-螺旋插入到疏水的胞膜中央，雙親的a-螺旋留在質(zhì)膜表面，打亂了質(zhì)膜上蛋白質(zhì)和脂質(zhì)原有的排列秩序，使得膜外正電荷增多，超過閾值時導(dǎo)致膜去極化從而破壞病毒，腫瘤細(xì)胞或細(xì)菌質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，引起胞內(nèi)水溶性物質(zhì)大量滲出，從而最終導(dǎo)致病毒，腫瘤細(xì)胞和細(xì)菌死亡。李偉燦等(李偉燦，等。家蠶抗菌肽CD高效表達(dá)及其抗BmNPV感染作用[J].中國病毒學(xué)，2006,21(6):589-593)用重組家蠶抗菌肽通過抑菌實(shí)驗(yàn)測得其對于革蘭氏陰性及陽性菌均有抑菌活性，并將其與家蠶病毒BmNPV作用混合4h后，一起投喂家蠶，發(fā)現(xiàn)病毒感染力有明顯降低，說明其具有抗病毒感染作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種大腸桿菌基因工程菌株，該菌株可以表達(dá)對蝦白斑綜合征病毒囊膜蛋白VP28和家蠶抗菌肽成熟肽CD基因工程融合蛋白(VP28-CD)。其優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)量大且可溶，易于工業(yè)化生產(chǎn)，成本低，且安全性好。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種重組融合蛋白VP28—CD亞單位疫苗的制備方法，方法易行，操作簡單，不僅能夠預(yù)防對蝦白斑綜合征(WSS),還能夠抑殺抗其它病原微生物。本發(fā)明的再一個目的基因工程融合蛋白在制備治療或預(yù)防對蟲下白斑綜合癥病毒的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的融合蛋白VP28-CD能有效的防治對蝦白斑綜合征(WSS)。前己述及，WSSV的主要囊膜蛋白之一VP28能阻斷WSSV與宿主細(xì)胞受體結(jié)合,從而提高對蟲下抗WSSV感染的能力；家蠶抗菌肽能抑殺病毒和細(xì)菌等病原微生物。通過注射、口服應(yīng)用于對蝦養(yǎng)殖試驗(yàn)，結(jié)果證明VP28和CD共同作用可以明顯提高對蝦的抗WSSV感染的能力。本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于，本發(fā)明利用大腸桿菌表達(dá)WSSV囊膜蛋白VP28和家蠶抗菌肽成熟肽(CD)的融合蛋白，旨在預(yù)防并治療WSS。通過基因工程生產(chǎn)的VP28-CD融合蛋白可以作為抗WSS病源微生物藥物應(yīng)用于對蝦養(yǎng)殖業(yè)，能夠明顯提高對蝦的免疫力和抗病力。本發(fā)明另一個創(chuàng)新之處在于，在融合蛋白之間插入了酸水解位點(diǎn)天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)，在酸性、高溫條件下或在對蝦的胃里分離開來，并保持了其各自的天然構(gòu)像，能更有效地行使其各自的功能。抗菌肽目前還沒有直接應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè),但抗菌肽獨(dú)特的作用機(jī)理不易產(chǎn)生耐藥性的特性十分具有吸引力。本發(fā)明首次將家蠶抗菌肽應(yīng)用于對蝦中，并創(chuàng)造性地在VP28和將家蠶抗菌肽成熟肽之間插入酸水解位點(diǎn)，使可溶性融合蛋白在酸性、高溫條件下或在對蝦的胃里分離開來，并保持了其各自的天然構(gòu)像，能更有效地行使各自的功能從而達(dá)到防治WSS的目的。而且本發(fā)明公開的基因工程菌株的構(gòu)建方法可應(yīng)用于大規(guī)模的養(yǎng)殖業(yè)中，表達(dá)量大，操作簡單，成本低。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)之一是表達(dá)基因工程融合蛋白VP28-CD的大腸桿菌基因工程菌株的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)明所涉及的分子生物學(xué)方法為常規(guī)方法，為本領(lǐng)域人員所熟悉。本發(fā)明中未詳述的請參見《精編分子生物學(xué)試驗(yàn)指南》F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.塞德曼等主編。利用大腸桿菌基因工程菌株制備融合蛋白的方法步驟如下1.WSSV的y;^礎(chǔ)因的制備.(1)WSSV病毒基因組的制備在冰上取患病對!fe下的鰓、胃和心臟，冰浴勻槳，然后加入蛋白酶K(100ug/ml)，在沸水(100'C)中煮15分鐘，立即冰浴5分鐘，12000rpm離心10分鐘，取其上清置4'C保存。(2)PCR擴(kuò)增V7^堪因根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的WSSV(GenBank:EU414753)的序列設(shè)計PCR引物，以上述上清作為模板DNA，？0擴(kuò)增目的基因^2&PCR產(chǎn)物通過DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產(chǎn)物并將其克隆到pGEM-T載體(由TIANGEN公司購置)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMI09(在INVITR0GEN公司購置)，挑取單菌落培養(yǎng)，用堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測序得到的陽性克隆子為包含f7^堪因的大腸桿菌，命名為pGEM-T-vp28。2.家蠶抗菌肽成熟肽基因的制備(l)家蠶抗菌肽CecropinD成熟肽基因的制備通過大腸桿菌JM109誘導(dǎo)家蠶，按照RNA提取試劑盒的方法提取其脂肪體總mRNA后，通過RT-PCR得到總cDNA，根據(jù)GenBank家蠶抗菌肽CeeropinD(GenBank:NM001043368)的cDNA序列，設(shè)計并合成引物，以上述得到的總cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到CecropinD基因，PCR產(chǎn)物通過DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產(chǎn)物并將其克隆到pUCm-T載體(在TIANGEN公司購置)中，挑取單克隆用堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測序，根據(jù)CecropinD基因的成熟肽序列，去掉信號部分和將C末端的甘氨酸突變成天冬酰胺，并插入酸水解位點(diǎn)Asp-Pro，重新設(shè)計引物(上游引物MgQHl5^irCCAlGGCAACTTCTTCAAGGATCT(劃線處為HindHI位點(diǎn)，方框內(nèi)為Asp-Pro酸水解位點(diǎn))，下游引物eie^AeCTAGTTTTGTCCGAGAGCTTTTGCT(劃線處為XhoI位點(diǎn)，粗體為終止密碼子，將C末端甘氮酸突變成天冬酰胺)。以上述pUCm-T-cecropinD質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增基因，將PCR產(chǎn)物組裝入pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑取單菌落用堿裂解法提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測序，得到的陽性克隆子即為包含基因的大腸桿菌，用于基因的增殖和保藏；3.融合基因的制備及表達(dá)載體的構(gòu)建首先同時雙酶切含crf基因的重組質(zhì)粒和含yp2S基因的重組質(zhì)粒，膠回收含crf基因的片段和開環(huán)pGEM-T-vp28片段，4'C連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coU中，所得到的陽性克隆子命名為pGEM-T-vp28-cd,再同時雙酶切重組質(zhì)粒pGEM-T-vp28-cd和質(zhì)粒pET-32a(+)(在INVITROGEN公司購置)，膠回收含vp28-cd基因的片段和開環(huán)pET-32a(+)片段，16'C連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli中，所得到的陽性克隆子是vp28-cd融合基因的大腸桿菌，為pET-32a(+)-VP28-CD;所述的大腸桿菌基因工程融合蛋白的分子量為47.95Kda，在VP28和CD之間插入酸水解位點(diǎn)天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)。4.大腸桿菌基因工程菌的制備將質(zhì)粒pET-32a(+)-VP28-CD轉(zhuǎn)化到感受態(tài)BL21(DE3)中，pck鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，所得陽性克隆即為本發(fā)明涉及的能夠融合表達(dá)vp28基因和cd基因的重組基因工程菌株^sc力e/7'c力y汰co7/BL21(pET-32a-VP28-CD)，該菌株已保藏，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2008年3月10日，保藏編號CCTCCNO:M208032,分類命名重組基因工程菌株^sc力er/c力ya.co7/BL21(pET-32a-VP28-CD)。5.基因工程融合蛋白的表達(dá)重組基因工程菌株^sc力ej"ic力j'a.co7j'BL21(pET-32a-vp28-cd)的單菌落接種到LB(含100pg/mL氨芐青霉素)培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)過夜，第2天活化菌液以4%接種到新鮮的LB(含100嗎/mL氨芐青霉素)培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)至O"咖為0.6時(約3小時)加入終濃度為1.0mmol/L異兩基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37'C誘導(dǎo)4h后，離心12000g，4°C,10min收集菌體，用10mMPBS(pH8.0)重懸超聲波破碎，離心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達(dá)。以優(yōu)化后的條件擴(kuò)大培養(yǎng)，超聲波破碎后，離心(12000g，4'C,20min)收集上清。融合蛋白VP28-CD的純化按Ni-NTA說明書進(jìn)行，用SDS-PAGE檢測蛋白純化結(jié)果。本發(fā)明的基因工程融合蛋白的活性鑒定。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中提供了一種基因工程融合蛋白活性鑒定的方法，SPMTT法，證明本發(fā)明所涉及的基因工程融合蛋白既能阻斷WSSV與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合，從而抑制WSSV囊膜與細(xì)胞膜的融合，達(dá)到抗WSSV感染的作用，又能抑殺其它病原微生物，提高對蝦對WSSV的抗病能力和免疫能力。方法如下(1)細(xì)菌培養(yǎng)，用血細(xì)胞計數(shù)板測量細(xì)胞數(shù)目。無菌條件下，用肉湯培養(yǎng)基倍比稀釋，將菌濃度調(diào)整到2X105CFU/ml。(2)無菌條件下，用移液槍向無菌96孔微孔板中加入50^1菌液，再向各孔中加入待測樣品50nl，混勻，實(shí)驗(yàn)設(shè)三個平行組。同時設(shè)置陽性對照組(50nl菌液+5(HU15pg/ml氨芐青霉素)、陰性對照組(50lil菌液+5(Hil20mMPBSpH7.4)。37。C下培養(yǎng)12h。(3)無菌條件下，向各孔分別加入5mg/ml的噻唑藍(lán)(MTT，稱取MTT0.5克，溶于100ml20mM的PBS，pH7.4中，用0.22ym濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4'C避光保存)溶液l(Hd，繼續(xù)培養(yǎng)4h。(4)向各孔中加入卯pl二甲基亞砜(DMSO,在Amresco公司購置)，混勻并使藍(lán)色晶體充分溶解于DMSO中，用酶標(biāo)儀測量各孔在570nm處的光密度OD值(0D570)，并作記錄。(6)結(jié)果分析。計算公式細(xì)菌抑制率=1-(待測樣品組0D570/空白對照組0D570)。本發(fā)明以枯草芽孢桿菌為例，MTT法的結(jié)果表明重組融合蛋白VP28-CD對枯草芽孢桿菌有一定的抑殺作用。本發(fā)明與現(xiàn)有報道的單一VP28DNA疫苗或亞單位疫苗相比，其優(yōu)勢在于(1)本發(fā)明所涉及的VP28-CD重組蛋白，不僅可以阻斷病毒與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合，達(dá)到阻礙病毒感染的作用，而且還具有抑殺其它病原微生物的雙重功能，本發(fā)明創(chuàng)造性地把它應(yīng)用于對蝦抗wssv中，至今在國內(nèi)外未見報道；(2)本發(fā)明所涉及的融合蛋白VP28-CD為可溶蛋白，便于大規(guī)模生產(chǎn)，成本低廉，操作工藝簡單；(3)在VP28和CD之間插入酸水解位點(diǎn)天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)，重組蛋白經(jīng)對蝦口服之后能在蝦胃酸性條件下水解成單獨(dú)VP28和CD天然分子，能更好地發(fā)揮其阻斷病毒感染和抑殺病原微生物的雙重功能。圖l重組擴(kuò)增質(zhì)粒pGEM-T-vp28-cd的構(gòu)建過程示意2重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-VP28-CD的構(gòu)建過程示意3重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-VP28-CD的酶切和PCR鑒定示意圖其中l(wèi).MarkerIV2.pET-32a(+)-VP28-CD質(zhì)粒3.pET-32a(+)-VP28-CD單切/XhoI4.VP28-CDPCR5.pET-32a(+)-VP28-CD雙切/EcoRI、XhoI6.D2000圖4SDS-PAGE鑒定示意圖其中1:ProteinMarker;2:pET-32a-VP28-CD誘導(dǎo)前；3:pET-32a-VP28-CD未誘導(dǎo)；4:pET-32a-VP28-CD誘導(dǎo)后；5:pET-32a-VP28-CD破碎；6:pET-32a-VP28-CD破碎后上清具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。在實(shí)施例中涉及的所有培養(yǎng)基和分子生物學(xué)操作方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明中未詳述的請參見《精編分子生物學(xué)試驗(yàn)指南》F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.塞德曼等主編，科學(xué)出版社出版。實(shí)施例lWSSV的VP28基因的制備(1)WSSV病毒基因組的制備在冰上取患病對蝦的鰓、胃和心臟，冰浴勻漿，然后加入蛋白酶K(100ug/ml),在沸水中煮15分鐘，立即冰浴5分鐘，12000rpm離心10分鐘，取其上清置4'C保存。(2)WSSV的yp^礎(chǔ)因的制備根據(jù)GenBank中己經(jīng)發(fā)表的yp2S的序列設(shè)計引物，P7^5的上游引物primerl:GAATTCATGGATCTTTCTTTCACTCTY戈ij線處為EcoRI位點(diǎn)，粗體為啟始密碼子)，vp^鄉(xiāng)下游引物primer2:AAGCIICTCGGTCTCAGTGCCAGA(劃線處為Hindin位點(diǎn))。以上述上清為模板進(jìn)行PCR,PCR反應(yīng)體系10XTaqBufferwithKC12.5uL,MgC12(25mM)1.5uL,dNTPMixture(2.5mM)luL,上下游引物各luL(25pmol)，模板luL,TaqDNA聚合酶(1U/uL)luL，加無菌水至終體積25uL。PCR反應(yīng)條件為94'C30s,55°C30s，72°Clmin(30個循環(huán))；72°C10min。由此得到k/7i"權(quán)因的PCR產(chǎn)物。實(shí)施例2家蠶抗菌肽成熟肽基因(crf)的制備(1)家蠶脂肪體總RNA的提取取5-10條經(jīng)大腸桿菌JM109(在INVETR0GEN公司購置)誘導(dǎo)24h后的家蠶，用焦碳酸二乙酯(DEPC，在上海生工購置)水(0.1%焦碳酸二乙酯的水溶液)清洗干凈后，切開起腹腔，將脂肪提擠出收集后，在液氮中研磨成粉末狀，按照RNeasyRKit的操作說明書提取脂肪體總RNA，提取得到的總RNA放置-80'C備用。(2)合成CecropinDcDNA的第一條鏈按照ReverseTranscriptionSystem試齊ij盒說明書(在TIANGEN公司購置)，以01igo(dT)2。為引物合成cDNA第一鏈。反應(yīng)體系如下，依次將以下試劑加入經(jīng)DEPC水處理并滅菌過的PCR管中25mMMgCl2ReverseTranscriptionlOXBufferdNTPMixture10mMRecombinantRNasinRibonucleaseInhibitorAMVReverseTranscriptase4n101igo(dT)20Primer6u1Total腿15u112y16U16w12u1力BNuclease-free60u1反應(yīng)參數(shù)為42'C水到終體積為h95°C3'C5min5min將反應(yīng)后的產(chǎn)物放置于-20'C以作為目的基因克隆的模板。(3)家蠶抗菌肽Cecrop/"Z)的制備依據(jù)GenBank中已發(fā)表的家蠶抗菌肽CecropinDcDNA序列，綜合分析后設(shè)計PCR弓I物。上游弓l物primer3:ATGAAATTCTCGAAAATTTTCGTT,下游弓l物primer4:TCCTTGTCCGAGAGCTTTTGC。弓l物由上海生物工程有限公司合成。以cDNA第一鏈為模板，按照以下反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系cDNA第一鏈2n125mMMgCl24u1ReverseTranscription10X2u1Bufferd證Mixture10mM4y1Upstreamprimer(20jiM/L)2y1Downstreamprimer(20iiM/L)2u1TaqDNAPolymerase0.5u1DEPC處理的去離子水_3.5u1總反應(yīng)體積20y1應(yīng)用降落式PCR的形式進(jìn)行反應(yīng)，其反應(yīng)參數(shù)為95'C預(yù)變性4min，94。C變性30sec，60-50。C退火30min，72'C延伸1min,20個循環(huán)；94。C變性30sec，50'C退火30sec,72'C延伸lmin，10個循環(huán)，72'C再延伸10min。將反應(yīng)后的產(chǎn)物置于-20'C備用。將上述PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳并回收純化，方法見實(shí)施例3。將純化的PCR產(chǎn)物與pUCm-T載體(在INVETR0GEN公司購置)連接。連接體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>連接反應(yīng)液16'C水浴放置過夜后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109,方法見實(shí)施例4。從LB平板上挑取4個單菌落于500ul新鮮液體LB培養(yǎng)基(含終濃度100ug/ml氨芐青霉素)中，37°C,300rpm搖床培養(yǎng)3小時，以此菌液為模板，primer3、primer4為引物進(jìn)行PCR初步鑒定，并送上海生工有限公司測序。將陽性克隆的菌液轉(zhuǎn)接5ul于20ml新鮮液體LB培養(yǎng)基(含終濃度為100ug/ml氨芐青霉素)中，37'C，300rpm搖床培養(yǎng)過夜，堿裂解法小量提取質(zhì)粒，置于-80'C備用。重組質(zhì)粒命名為pUCm-T-cecro/Z"Z)。(4)家蠶抗菌肽Cecrow'""成熟肽基因(以下簡稱cd)根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的Cecro/^'77"成熟肽的序列設(shè)計引物。crf的上游引物primer5:AAGCTTJGATCCAlGGCAACTTCTTCAAGGATCT(戈iJ線處為Hindm位點(diǎn)，方框內(nèi)為Asp-Pro酸水解位點(diǎn))，cc的下游引物primer6:—CTCGAGCTAGTTTTGTCCGAGAGCTTTTGCT(劃線處為XhoI位點(diǎn)，粗體為終止密碼子，將C末端甘氨酸突變成天冬酰胺)。以pUCm-T-cecrop/"Z)為模板進(jìn)行PCR,PCR反應(yīng)體系10XTaqBufferwithKC12.5uL,MgC12(25mM)1.5uL，dNTPMixtureluL,上下游弓|物各lu"25prao1),模板luL，TaqDNA聚合酶(1U/uL)luL，加無菌水至終體積25uL。PCR反應(yīng)條件為；94'C30s，50°C30s，72'C20s(30個循環(huán))；72°C10min。由此得至!jcrf的PCR產(chǎn)物。實(shí)施例3PCR產(chǎn)物的回收、純化和亞克隆將實(shí)施例1中得到的vp2S的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，通過凝膠加樣緩沖液顯示的顏色判斷要回收的目的帶與其它帶完全分離時，停止電泳。在紫外燈下迅速切下欲回收的條帶，用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化，將單一的目的DNA條帶放入干凈的Eppendorf管中，稱取重量。向膠塊中加入3倍體積的溶膠液(凝膠重為0.lg，其體積可視為100uL，以此類推)。50'C水浴10分鐘，其間每2分鐘溫和上下翻轉(zhuǎn)Eppendorf管，以確保膠塊充分溶解。將所得溶液取750uL加入到一個吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室溫(20-25°C，以下相同)放置2分鐘，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入700uL漂洗液，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。再向吸附柱中加入500uL漂洗液，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中?？罩?2000rpm離心2分鐘，盡量除盡漂洗液。將吸附柱放入一個干凈的Eppendorf管中，室溫放置2分鐘，徹底晾干，防止殘留的漂洗液影響下一步的實(shí)驗(yàn)。向吸附膜中間位置懸空滴加30uL洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，12000rpm離心2分鐘。將回收到的PCR產(chǎn)物取5uL電泳檢測定量，其余貯于-20'C備用。PCR產(chǎn)物的亞克隆將回收、純化的PCR產(chǎn)物與pGEM-T(在INVITROGEN公司購置)連接，連接體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>連接反應(yīng)液4'C水浴放置過夜。同樣的方法回收、純化和亞克隆實(shí)施例2中得到的erf的PCR產(chǎn)物，分別得到v/72S基因和基因與pGEM-T載體的連接產(chǎn)物。實(shí)施例4質(zhì)粒pGEMT-cd和質(zhì)粒pGEMT-vp28的構(gòu)建氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(1)用接種環(huán)挑取固體LB平板上新活化的大腸桿菌JM109單菌落，接種到20ml液體LB培養(yǎng)基(將lg蛋白胨、0.5g酵母粉、lgNaCl溶解在75mlddH20中，調(diào)整pH值至7.0，最后加ddH20定容至100ml,分裝于5個三角瓶里，15磅滅菌處理20min后備用)中，37'C，250rpm搖床活化過夜。(2)無菌條件下取60ul上述活化的大腸桿菌于新鮮的20ml液體LB培養(yǎng)基中，37°C,250rpm搖床培養(yǎng)3小時左右至0De。。值為0.4-0.6。(下述所有步驟均需無菌操作)(3)無菌條件下取1.5ul上述菌液于無菌Eppendorf管中，在冰上放置IO分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至0°C。4000rpm,4'C離心10分鐘，用移液槍吸干上清。(4)加入300ul冰預(yù)冷的0.1MCaCl2溶液重懸菌體沉淀，冰浴30分鐘，4000rpm，4'C離心10分鐘，用移液槍吸干上清。(5)加入lOOul冰預(yù)冷的0.1MCaCl2溶液重懸沉淀，即得感受態(tài)細(xì)胞，置于4'C保存，24小時內(nèi)使用為宜。將實(shí)施例3中得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(1)無菌條件下取連接反應(yīng)液10ul，加入到100ul大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。(下述所有步驟均需無菌操作)(2)42'C水浴中熱激90秒，迅速移至冰中冰浴2分鐘。(3)加入800ul液體LB培養(yǎng)基，37°C,150rpm輕搖45分鐘使細(xì)菌復(fù)蘇。(4)4000rpm離心10分鐘，吸取800ul上清棄去，將剩余菌液用移液槍輕輕混勻。(5)將上述菌液用無菌三角玻棒均勻涂布在含10ul1MIPTG,40ul20mg/mlX-gal，10ul200mg/mlArap的LB平板上，正向放置1_2小時，直至液體被全部吸收，倒置平板于37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。由此法可分另U帝!l備得至!]E.coliJM109pGEM-T-cd禾口E.coliJM109pGEM-T-vp28的菌落。陽性正向重組子pGEM-T-cd和pGEM-T-vp28的酶切鑒定用堿裂解法小量提取E.coliJM109pGEM-T-cd的質(zhì)粒pGEMT-cd，和E.coliJM109pGEM-T-vp28的質(zhì)粒pGEMT-vp28,對所提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切體系如下(O重組質(zhì)粒pGEMT-cd的雙酶切質(zhì)粒pGEMT-cd8ul10XMBuffer2ulHindinlulPstIlul加無菌水至終體積20ul。(2)重組質(zhì)粒pGEMT-vp28的雙酶切質(zhì)粒pGEMT-vp288ul10XMBuffer2ulPstIlulHindmlul加無菌水至終體積20ul。酶切反應(yīng)條件均為37'C,反應(yīng)時間3-4個小時，酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。實(shí)施例5融合基因的制備和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建(1)重組擴(kuò)增質(zhì)粒pGEM-T-vp28-cd的構(gòu)建用HindIH和PstI雙酶切質(zhì)粒pGEMT-vp28和質(zhì)粒pGEMT-cd,目的片段開環(huán)質(zhì)粒pGEMT-p28和含cd基因的片段進(jìn)行膠回收后4'C連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，方法同實(shí)施例4。挑取單克隆E.coliJM109pGEM-T-vp28-cd于500ul新鮮液體LB培養(yǎng)基(含終濃度100ug/ml氨芐青霉素)中，37'C,300rp邁搖床培養(yǎng)3小時，以此菌液為模板，primerl、primer6為引物進(jìn)行PCR初步鑒定，其產(chǎn)物為vp28-cd,大小約為750bp。將PCR鑒定所得陽性克隆的菌液轉(zhuǎn)接5ul于20ml新鮮液體LB培養(yǎng)基(含終濃度為100ug/ml氨芐青霉素)中，37'C，300rpm搖床培養(yǎng)過夜，堿裂解法小量提取質(zhì)粒，用Hindm和XhoI雙酶切進(jìn)一步鑒定陽性重組子，并送上海生工有限公司測序。重組質(zhì)粒命名為pGEM-T-vp28-cd。(2)重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-VP28-CD的構(gòu)建用EcoRI禾BHindm雙酶切質(zhì)粒pGEMT-VP28-CD和質(zhì)粒pET-32a(+)(在INVITROGEN公司購置)，目的片段VP28-CD和開環(huán)pET-32a(+)膠回收后16'C連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，方法如下①無菌條件下取連接反應(yīng)液lOul,加入到100ul大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。(下述所有步驟均需無菌操作)②42'C水浴中熱激90秒，迅速移至冰中冰浴2分鐘。③將上述菌液用無菌三角玻棒均勻涂布在含10ul200mg/mlAmp的LB平板上，正向放置1-2小時，直至液體被全部吸收，倒置平板于37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。挑取單克隆E.coliJM109pET-32a(+)-VP28-CD于500ul新鮮液體LB培養(yǎng)基(含終濃度為100ug/ml的氨節(jié)青霉素)中，37'C，300rpm搖床培養(yǎng)3小時，以此菌液為模板，primerl、primer6為引物進(jìn)行PCR初步鑒定，其產(chǎn)物為VP28-CD全長融合基因，大小約為750bp。將PCR鑒定所得陽性克隆的菌液轉(zhuǎn)接5ul于20ml新鮮液體LB培養(yǎng)基(含終濃度為100ug/ml的氨芐青霉素)中，37°C,300rpm搖床培養(yǎng)過夜，堿裂解法小量提取質(zhì)粒，用EcoRI和XhoI雙酶切鑒定陽性重組子，重組質(zhì)粒命名為pET-32a(+)-VP28-CD，并送上海生工有限公司測序，測序結(jié)果見一種基因工程融合蛋白，其序列為SEQIDNO:l所示的核苷酸序列，核苷酸序列與預(yù)期的完全一致，符合翻譯閱讀框。實(shí)施例4和實(shí)施例5中所述重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-VP28-CD的構(gòu)建過程見附圖1，酶切及PCR鑒定見附圖2。實(shí)施例6基因工程菌的構(gòu)建及融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)(1)基因工程菌的構(gòu)建將質(zhì)粒pET-32a(+)-VP28-CD(lul)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(在INV;TROGEN公司購置)感受態(tài)細(xì)胞。挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆于500ul新鮮液體LB培養(yǎng)基(含終濃度為100ug/ml的氨芐青霉素)中，37'C，300rpm搖床培養(yǎng)3小時，以此菌液為模板，primerl、primer6為引物進(jìn)行PCR鑒定，其產(chǎn)物為VP28-CD全長融合基因，大小約為750bp。(2)融合蛋白VP28-CD的誘導(dǎo)表達(dá)將PCR鑒定所得陽性克隆的菌液轉(zhuǎn)接5ul于20ml新鮮液體LB培養(yǎng)基(含終濃度為100ug/ml的氨芐青霉素)中，37'C,300rpm搖床培養(yǎng)過夜。將500ul過夜培養(yǎng)物分別同時接種到兩瓶新鮮2XYT培養(yǎng)基(將1.6g蛋白胨、Ig酵母粉、0.5gNaCl溶解在75mlddH20中，調(diào)整pH值至7.0，最后加ddH20定容至100ml，分裝于5個三角瓶中，15磅滅菌處理20min后備用，臨用前加入終濃度為100ug/ml的氨芐青霉素)中，37°C，300rpm搖床培養(yǎng)，一瓶作誘導(dǎo)，一瓶作對照。3小時后，取欲誘導(dǎo)的2XYT培養(yǎng)物在無菌條件下用移液槍吸取lml于一個干凈的Eppendorf管中，再向上述2XYT培養(yǎng)物中加入20ul1MIPTG，37'C，300rpm搖床繼續(xù)培養(yǎng)。4小時后，停止誘導(dǎo)，同時取出經(jīng)誘導(dǎo)和未經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物，用移液槍分別吸取600ul誘導(dǎo)后的培養(yǎng)物和500ul未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物于兩個干凈的Eppendorf管中。(3)融合蛋白VP28-CD的SDS-PAGE鑒定將誘導(dǎo)前、未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后小量取樣的Eppendorf管于室溫以12000rpm離心1分鐘，棄去上清，加100ul無菌水重懸菌體沉淀。分別取上述樣品各20ul于20ul2XSDS凝膠加樣緩沖液(100mMTris-Cl、200mMp-巰基乙醇、4%SDS、0.2%溴酚藍(lán)、20%甘油)中，IOO'C加熱IO分鐘，樣品可貯存于-4'C，以備在凝膠上加樣。融化樣品，于室溫以12000rpm離心1分鐘。取20ul加樣到10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，卸下凝膠，在考馬斯亮藍(lán)染色液(1g考馬斯亮藍(lán)R-250，450ml甲醇，450mlddH20,100ml冰醋酸)中染色2個小時，然后用脫色液(40ml甲醇，10ml乙酸，50mlddH20)脫色，每隔30分鐘換液一次，直至背景脫干凈為止。通過觀察凝膠可知在ProteinMarker的45.OkDa指示偏上處，經(jīng)過誘導(dǎo)的樣品有大量目的蛋白表達(dá)，且80%為可溶蛋白。融合蛋白VP28-CD的SDS-PAGE鑒定見附圖3，一種基因工程融合蛋白VP28-CD的氨基酸序列為SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，并命名為重組基因工程菌株fscAe_ricAia.co7iBL21(pET—32a—VP28—CD)。實(shí)施例7融合蛋白VP28-CD的純化(1)融合蛋白VP28-CD的提取按照實(shí)施例6(1)的誘導(dǎo)方法發(fā)酵lL重組基因工程菌fsc力ehc力ia.coh'BL21(pET-32a-VP28-CD),于室溫4200rpm離心20分鐘，收集并稱量濕菌體。取lg濕菌體力卩入30mllysisBuffer(10mM咪唑，20mMTris-HCl,500mMNaCl溶解于400mlddH20，調(diào)整PH至7.9,最后加ddH20定容至500ml)，-20'C反復(fù)凍融3次，再進(jìn)行超聲波破碎(4'C,工作3秒，間歇3秒)，待菌液破碎至清亮，取樣20ul以備作SDS-PAGE鑒定。將破碎后的菌液于4'C，10000rpm離心20分鐘，分別收集菌體沉淀和上清液。分別取誘導(dǎo)前、未誘導(dǎo)、誘導(dǎo)后、破碎后、破碎后上清各20ul于20ul2XSDS凝膠加樣緩沖液中，IOO'C加熱IO分鐘，于室溫以12000rpm離心l分鐘。取20ul加樣到10WSDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。SDS-PAGE結(jié)果表明80%融合蛋白VP28-CD為可溶蛋白(見附圖3)。(2)Ni-NTASuperflow柱親和層析法純化融合蛋白VP28-CD①將上述30ml上清液用濾頭(微孔濾膜尺寸025min,孔徑0.45ul)過濾，然后加入到平衡好的柱子中，用蠕動泵以lml/min的速率，4'C循環(huán)上樣過夜(12小時)，使融合蛋白前端的6XHis與Ni"充分結(jié)合。收集流出液，即穿漏液。(下述所有步驟均在4'C下迸行)②用50mllysisBuffer以lml/min的速率洗勝，以洗脫下柱內(nèi)未與N廣結(jié)合的蛋白。③用50ml含20mM咪唑的WashBuffer(20raM咪唑，20mMTris-HCl,500mMNaCl溶解于400mlddH20，調(diào)整PH至7.9，最后力口(1犯2。定容至500ml)以lml/min的速率洗柱，以洗脫下Ni"柱上的非目的蛋白。④用EluteBuffer(250mM咪唑，20mMTris-HCl,500mMNaCl溶解于400mlddH20，調(diào)整PH至7.9，最后加ddH20定容至500ml)以lml/4min的速率洗柱，收集目的蛋白VP28-CD。一個Eppendorf管lml，收集10管。⑤取收集的蛋白進(jìn)行10S6SDS-PAGE檢測純化效果，并與純化前和穿漏液作對照。(3)超濾濃縮純化后的融合蛋白VP28-CD并置換EluteBuffer①將純化后的蛋白用移液槍轉(zhuǎn)移至超濾管(截留分子量為10KD)中，4'C，4700g離心20分鐘，棄去收集管中的廢液。②力卩入20mMPBS(3.12gNaH2P04，NaOH調(diào)pH值至7.4,加水定容至1000ml，15磅20min滅菌處理后備用)至原體積，4'C,4700g離心20分鐘，棄去收集管中的廢液。重復(fù)次步驟3次。④不加PBS，4'C,4700g離心20分鐘，棄去收集管中的廢液，用200ul的移液槍小心地收集樣品。由此即得到濃縮的融合蛋白VP28-CD,融合蛋白的濃度可用Bradford法測定。實(shí)施例8Bradford法測定融合蛋白的濃度(1)將Bradford試劑工作液平衡至室溫并顛倒混勻，將酶標(biāo)儀預(yù)熱。(2)將0、1、2、4、8、12、16、20ul牛血清蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)溶液(lmg/ml)依次加入酶標(biāo)微孔板中，用10mMPBS補(bǔ)足至20ul。(3)向每孔中加入200ulBradford試劑工作液(0.1先考馬斯亮藍(lán)G250，5%乙醇，8.5%磷酸)振蕩混勻后室溫放置2分鐘。(4)用酶標(biāo)儀測BSA蛋白各濃度的0Ds7。值。(5)以BSA蛋白濃度為橫坐標(biāo)，BSA蛋白各濃度的OD"。值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。(6)按照(1)至(4)所述的方法測定樣品的OD訓(xùn)值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中確定樣品的濃度。實(shí)施例9基因工程蛋白的抑菌活性測定本發(fā)明采用MTT法測定重組融合蛋白的抑菌活性。MTT法測定抑菌效果步驟-(1)細(xì)菌培養(yǎng)，用血細(xì)胞計數(shù)板測量細(xì)胞數(shù)目。無菌條件下，用肉湯培養(yǎng)基倍比稀釋，將菌濃度調(diào)整到2X10SCFU/ml。(2)無菌條件下，用移液槍向無菌96孔微孔板中加入50jil菌液，再向各孔中加入待測樣品50nl，混勻，實(shí)驗(yàn)設(shè)三個平行組。同時設(shè)置陽性對照組(50^1菌液+50pl15mg/ml氨芐青霉素)、陰性對照組(50pl菌液+50pl20mMPBSpH7.4)。37。C下培養(yǎng)12h。(3)無菌條件下，向各孔分別加入5mg/ml的噻唑藍(lán)(MTT，稱取MTT0.5克，溶于100ml20mM的PBS，pH7.4中，用0.22ym濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4'C避光保存)溶液10nl，繼續(xù)培養(yǎng)4h。(4)向各孔中加入90nl二甲基亞砜(DMSO，由Amresco公司提供)，混勻并使藍(lán)色晶體充分溶解于DMSO中，用酶標(biāo)儀測量各孔在570mn處的光密度OD值(OD570),并作記錄。(5)結(jié)果分析。計算公式細(xì)菌抑制率-l-(待測樣品組0D570/空白對照組0D570)。本發(fā)明以枯草芽孢桿菌為例(1)按照實(shí)施例8的方法測得濃縮后融合蛋白的濃度約為908ng/ml。(2)酸水解融合蛋白.用鹽酸將融合蛋白的pH值調(diào)至3.0,5(TC溫浴20小時，然后用200mMPBSpH9.0將pH調(diào)至7.0。(3)按照上述(1)至(5)所述的方法測定融合蛋白的抑菌活性，并作記錄。數(shù)據(jù)見下表-表lMTT法測定重組融合蛋白的抑菌活性<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表中數(shù)據(jù)說明，重組融合蛋白VP28-CD對枯草芽孢桿菌的抑制率達(dá)56n/t)以上，經(jīng)水解后對枯草芽孢桿菌的抑制率達(dá)63%以上。結(jié)果表明重組融合蛋白VP28-CD對枯草芽孢扦菌有一定的抑殺作用，且經(jīng)水解后其抑殺活性增強(qiáng)。實(shí)施例io基因工程融合蛋白抗wssv感染作用的實(shí)際應(yīng)用(1)試驗(yàn)樣品及來源VP28-CD融合蛋白亞單位疫苗預(yù)混粉劑，武漢大學(xué)生科院病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基因工程藥物及昆蟲病毒分子生物學(xué)研究室研制提供并購置。制備方法如下本發(fā)明所涉及的基因工程菌株大腸桿菌&BL21pET-32a-VP28-CD經(jīng)30L大罐發(fā)酵，發(fā)酵液4000rpm離心20分鐘，棄去上清，收集濕菌體。稱取濕菌體5g，加5ral、5mMPBSPH7.4，重懸于冰箱-20'C反復(fù)凍融二次，于超聲波破碎儀，冰浴破碎，經(jīng)顯微鏡檢測破碎良好，加入19g玉米淀粉吸附，35'C烘干，研缽研磨，過120目篩，備用。WSSV懸浮液，武漢大學(xué)生科院病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基因工程藥物及昆蟲病毒分子生物學(xué)研究室制備提供并購置。海水，從湛江市開發(fā)區(qū)海灣大橋處抽取，兌淡用的自來水系一般自來水。(2)試驗(yàn)條件每個養(yǎng)殖箱裝320升的海水，并用自來水兌成比重為1.Oilkg/L。從湛江市水產(chǎn)局對蝦原種場的對蝦精養(yǎng)池捕撈健康南美白對蝦(體長4-5cm,平均體重1.5g)，水體充氧運(yùn)輸至試驗(yàn)地，每箱投放50-60尾，室內(nèi)暫養(yǎng)，以備試驗(yàn)用。試驗(yàn)期間水溫平均23"C'-25'C,試驗(yàn)塑料箱內(nèi)養(yǎng)殖水體水質(zhì)指標(biāo)氨氮0.2-0.3mg/L，亞硝酸鹽0.25-0.30mg/L,PH值7.5-8.0，溶氧3-4mg/L。主要通過更換適量兌淡后比重為1.009-1.011kg/L的海水和增氧泵不間斷通氣來調(diào)控。(3)試驗(yàn)設(shè)計、調(diào)査及統(tǒng)計①各處理樣品預(yù)混粉劑分別包被對蝦飼料的方法用電子天平分別稱取VP28-CD融合蛋白亞單位疫苗預(yù)混粉劑及預(yù)混粉劑輔料(19克的玉米淀粉)各0.500克的樣品，分別加20ml淡水，攪拌均勻后，加入100克的粵海牌對蝦飼料2號料拌勻，涼千備用。②試驗(yàn)設(shè)有陰性對照組，陽性對照組，以及VP28-CD融合蛋白亞單位疫苗(樣品組)共3組處理，每組處理各設(shè)二個重復(fù)。各處理養(yǎng)殖箱貼上相應(yīng)標(biāo)簽，具體實(shí)施方法如下第一組(陰性對照組)喂食正常對蝦飼料，每日分三餐喂食。第二組(陽性對照組)每三天喂食一次上述包被預(yù)混粉劑輔料的飼料4g，一周后喂食包裹有對蝦白斑綜合癥病毒的飼料一次(在包被WSSV之前進(jìn)行WSSV口服侵染的預(yù)試驗(yàn)，以便確定WSSV懸液的感染力和病毒濃度，下同)。其余時間喂食正常對蟲下飼料，每日分三餐喂食。第三組(樣品組)每三天喂食一次上述包被VP28-CD融合蛋白亞單位疫苗組的飼料4g，一周后喂食包裹有對蝦白斑綜合癥病毒的飼料一次。其余時間喂食正常對!l下飼料，每日分三餐喂食。③調(diào)査及統(tǒng)計逐日早晚觀察記錄(并打撈)各處理項(xiàng)目養(yǎng)殖箱內(nèi)的死蝦，統(tǒng)計累計死亡頭數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)計各處理養(yǎng)殖箱內(nèi)剩余的活蝦，計算最后的存活率。保護(hù)效率見表l所示。從表2中可以看出，VP28-CD融合蛋白亞單位疫苗預(yù)混粉劑喂食南美白對蝦后，經(jīng)WSSV口服侵染21天后存活率可達(dá)100%,而未經(jīng)服用VP28-CD融合蛋白亞單位疫苗預(yù)混粉劑的陽性對照的經(jīng)WSSV口服侵染21天后平均存活率僅為1.94%。這表明服用VP28-CD融合蛋白亞單位疫苗預(yù)混粉劑的南美白對蝦能有效地預(yù)防WSSV的侵染。表2重組融合蛋白VP28-CD亞單位疫苗的保護(hù)效果<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>序列表<110〉廣西天池海洋生物藥業(yè)有限公司<120>抗對蟲下白斑綜合癥病毒工程蛋白VP28-CD及制備和應(yīng)用<130>抗對蟲下白斑綜合癥病毒工程蛋白VP28-CD及制備和應(yīng)用<160〉2<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211〉750<212〉DNA<213〉融合蛋白<220><221〉CDS<222〉(1)..(750)〈223〉<400〉1gaattcatggatctttctttcactctttcggtcgtgteggccateetc48GluPheMetAspLeuSerPheThrLeuSerValValSerAlalieLeu151015gccateactgetgtgattgetgtatttattgtgatttttaggtatcac96AlalieThrAlaVallieAlaValPhelieValliePheArgTyrHis202530aacactgtgaccaagaccategaaacccacacagacaatategagaca144AsnThrValThrLysThrlieGluThrHisThrAspAsnlieGluThr354045aacatggatgaaaacetccgcaltcctgtgactgetgaggttggatea192AsnMetAspGluAsnLeuArglieProValThrAlaGluValGlySer505560ggctacttcaagatgactgatgtgtectttgacagegacaccttgggc240GlyTyrPheLysMetThrAspValSerPheAspSerAspThrLeuGly65707580aaaateaagatecgcaatggaaagtctgatgcacagatgaaggaagaa288LyslieLyslieArgAsnGlyLysSerAspAlaGinMetLysGluGlu859095gatgcggatcttgtcateactcccgtggagggccgagcaetcgaagtg336AspAlaAspLeuVallieThrProValGluGlyArgAlaLeuGluVal100105110actgtggggcagaatetcacctttgagggaacattcaaggtgtggaac384ThrValGlyGinAsnLeuThrPheGluGlyThrPheLysValTrpAsn115120125aacacateaagaaagateaacateactggtatgcagatggtgccaaag432AsnThrSerArgLyslieAsnlieThrGlyMetGinMetValProLys130135140attlie145accThr犯cAsncccProaccaccThrThrgacatgAspMetgatAspcgaArg225gcaAlaCC3Pro210gacAspa肪LysccateaProSergtctctValSertttggcPheGly180tacgtgTyrVal195ggcaacGlyAsngccgtcAlaValgetetcAlaLeuaaggcctttLysAlaPhe150￡LttgatgaglieAspGlu165gcaccaattAlaProliecacgtcaccHisValThrttcPheatelieggaGly245ttcaagPheLys215agegcgSerAla230caaaacGinAsngtcggtValGlygatgaaAspGlugcagetAlaAla185tactctTyrSer200gatcttAspLeuagetecSerSer155gttggcValGly170accgccThrAlaggcactGlyThrg犯aaaGluLysgetccagcagtcAlaProAlaVal235tagetcgagLeuGluaacaccAsnThracctttThrPheggtggaGlyGlygagaccGluThr205atgggtMetGly220gacsecAspThrtectecttcSerSerPhe160gtgtgtggtValCysGly175aatcttttcAsnLeuPhe190gagaagcttGluLysLeucagagggttGinArgValctggcaaaaLeuAlaLys240480528576624672720750<210〉2<211>247〈212〉PRT<213〉融合蛋白<400>2GluPheMetA印LeuSerPheThrLeuSerValValSerAlalieLeu151015AlalieThrAlaVallieAlaValPhelieValliePheArgTyrHis202530AsnThrValThrLysThrlieGluThrHisThrAspAsnlieGluThr354045AsnMetAspGluAsnUuArglieProValThrAlaGluValGlySer505560GlyTyrPheLysMetThrAspValSerPheAspSerAspThrLeuGly65707580LyslieLyslieArgAsnGlyLysSerAspAlaGinMetLysGluGlu859095AspAlaAspLeuVallieThrProValGluGlyArgAlaLeuGluVal100105110ThrValGlyGinAsnLeuThrPheGluGlyThrPheLysValTrpAsn115120125AsnThrSerArgLyslieAsnlieThrGlyMetGinMetValProLys130135140lieAsnProSerLysAlaPheValGlySerSerAsnThrSerSerPhe145150155160ThrProValSerlieAspGluAspGluValGlyThrPheValCysGly165170175ThrThrPheGlyAlaProlieAlaAlaThrAlaGlyGlyAsnLeuPhe180185190AspMetTyrValHisValThrTyrSerGlyThrGluThrGluLysLeu195200205AspProGlyAsnPhePheLysAspLeuGluLysMetGlyGinArgVal210215220ArgAspAlaVallieSerAlaAlaProAlaValAspThrLeuAlaLys225230235240AlaLysAlaLeuGlyGinAsn24權(quán)利要求1.一種分離的基因工程融合蛋白，其序列為SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2、一種分離的基因工程融合蛋白，其序列為SEQ1DN0.2所示的氨基酸序列。3、一種基因工程菌株，其特征在于，該菌株為重組基因工程菌株￡scAen'c/'aco//BL21(pET-32a-VP28-CD),CCTCCNo:M208032。4、權(quán)利要求3所述的一種基因工程菌株的制備方法，它包括下列步驟A.WSSV的VP28基因的制備首先在冰上取對奸的鰓、胃和心臟，冰浴勻漿，然后加入蛋白酶K100ug/ml，在沸水中煮15分鐘，冰浴5分鐘，12000rpm離心10分鐘，取其上清置4'C保存，其次是設(shè)計PCR引物，以上述上清作為模板DNA，PCR擴(kuò)增目的基因VP28,PCR產(chǎn)物通過DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產(chǎn)物并將其克隆到pGEM-T載體中，挑取單菌落培養(yǎng)，用堿裂解法提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測序，得到的陽性克隆子即為包含VP28基因的大腸桿菌，為pGEM-T-VP28，用于基因的增殖和保藏；B.家蠶抗菌肽CecropinD成熟肽基因的制備通過大腸桿菌JMI09誘導(dǎo)家蠶，按照RNA提取試劑盒的方法提取其脂肪體總mRNA后，通過RT-PCR得到總cDNA，根據(jù)家蠶抗菌肽Cecr叩inD的cDNA序列，設(shè)計并合成引物，以上述得到的總cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到CecropinD基因，PCR產(chǎn)物通過DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產(chǎn)物并將其克隆到pUCm-T載體中，挑取單克隆用堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測序，根據(jù)CecropinD基因的成熟肽序列，去掉信號部分和將C末端的甘氨酸突變成天冬酰胺，并插入酸水解位點(diǎn)Asp-Pro,重新設(shè)計引物，上游引物AAGCTTGATCCAGGCAACTTCTTCAAGGATCT,下游引物CTCGAGCTAGTTTTGTCCGAGAGCTTTTGCT，以上述pUCm-T-cecr叩inD質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增CD基因，將PCR產(chǎn)物組裝入pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑取單菌落用堿裂解法提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測序，得到的陽性克隆子即為包含CD的大腸桿菌，為pGEM-T-CD，用于基因的增殖和保藏；C.融合基因的制備及表達(dá)載體的構(gòu)建首先同時雙酶切含CD基因的重組質(zhì)粒和含VP28基因的重組質(zhì)粒，膠回收含CD基因的片段和開環(huán)pGEM-T-VP28片段，4'C連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli中，所得到的陽性克隆子命名為pGEM-T-VP28-CD，再同時雙酶切重組質(zhì)粒pGEM-T-VP28-CD和質(zhì)粒pET-32a(+),膠回收含VP28-CD基因的片段和開環(huán)pET-32a(+)片段，16'C連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)Exoli中，所得到的陽性克隆子是VP28-CD融合基因的大腸桿菌，為pET-32a(+)-VP28-CD;D.大腸桿菌基因工程菌的制備將質(zhì)粒pET-32a(+)-VP28-CD轉(zhuǎn)化到感受態(tài)BL21中，PCR鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，所得陽性克隆即為本發(fā)明涉及的能夠融合表達(dá)VP28基因和CD基因的大腸桿菌基因工程菌株。5、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基因工程融合蛋白，其特征在于融合蛋白的分子量為47.95kDa，在VP28和CD之間插入酸水解位點(diǎn)天冬氨酸-脯氨酸Asp-Pro。6、權(quán)利要求1或2所述的一種基因工程融合蛋白在制備治療或預(yù)防對蝦白斑綜合癥病毒的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種抗對蝦白斑綜合癥病毒工程蛋白VP28-CD及制備和應(yīng)用，一種分離蛋白，其序列為SEQIDNO1所示的核苷酸和SEQIDNO2所示的氨基酸序列，菌株為重組基因工程菌株EscherichiacoliBL21(pET-32a-VP28-CD)，CCTCCNoM208032，從對蝦體中提取WSSV并通過PCR獲得VP28基因；通過大腸桿菌JM109誘導(dǎo)家蠶，提取其脂肪體總mRNA，通過RT-PCR得到總cDNA，再PCR獲得家蠶抗菌肽CecropinD成熟肽基因，其上游插入了酸水解位點(diǎn)天冬氨酸-脯氨酸；然后構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a(+)-VP28-CD。將重組質(zhì)粒pET-32a(+)-VP28-CD轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE₃)，在IPTG的誘導(dǎo)下，融合蛋白VP28-CD以可溶的形式得到高效表達(dá)，該融合蛋白在制備治療或預(yù)防對蝦白斑綜合癥病毒的藥物中的應(yīng)用。文檔編號C12N15/62GK101280021SQ20081004777公開日2008年10月8日申請日期2008年5月20日優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日發(fā)明者孟小林,孟海洋,徐進(jìn)平,健王,嵐王,偉魯申請人:廣西天池海洋生物藥業(yè)有限公司