專利名稱：一種固定化脂肪酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于脂肪酶固定化技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
動(dòng)植物油脂與短鏈醇在催化劑的作用下，通過酯化和酯交換反應(yīng)生成 的烷基酯類化合物稱為生物柴油。生物柴油不含硫和芳烴，十六垸值高， 潤(rùn)滑性能好，是一種優(yōu)質(zhì)清潔柴油。生物柴油的的制備方法主要有化學(xué)法、 生物酶法和超臨界甲醇法，工業(yè)化生產(chǎn)生物柴油的方法仍然是化學(xué)法。檢 索現(xiàn)有專利文獻(xiàn)，中國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局已經(jīng)公開了大量與之有關(guān)的
發(fā)明專利。如專利號(hào)ZL02133591.5、 ZL200310111696. 7，專利公開文獻(xiàn)號(hào) CN1412278A、 CN1760336A、 CN1861752A、 CN1556174、 CN1382762A、 CN1670128 等專利文件公開了生產(chǎn)生物柴油的方法，所用催化劑分別為酸性催化劑(如 濃硫酸、苯磺酸)和苛性鈉強(qiáng)堿性催化劑。然而，化學(xué)法制備生物柴油仍 然存在著諸多技術(shù)難題，主要體現(xiàn)在1、使用堿催化法生產(chǎn)生物柴油，由 于反應(yīng)中有皂腳生成，形成絮狀沉淀，使得生物柴油產(chǎn)品不易分離；反應(yīng) 過程中生成的皂腳、甘油易與生物柴油、甲醇等乳化，致使生物柴油收率 低；反應(yīng)中易排放廢水，形成"二次污染"；2、使用濃硫酸作催化劑，盡 管具有催化效率較高、反應(yīng)時(shí)間較短等優(yōu)點(diǎn)，但同樣存在反應(yīng)中易排放硫 酸廢水，形成"二次污染"，酯化產(chǎn)物難于分離，催化劑不能被重復(fù)利用， 從而導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高等技術(shù)難題。
針對(duì)化學(xué)法制備生物柴油存在的問題，人們開始研究生物酶法合成生 物柴油。如陳志鋒等人探討了無溶劑系統(tǒng)中固定化脂肪酶Novozym 435催 化餐飲業(yè)高酸廢油與乙酸甲酯酯交換生產(chǎn)生物柴油，指出添加有機(jī)堿三羥 甲基氨基甲烷或三乙胺可使酶的操作穩(wěn)定性和催化活性有所提高(陳志鋒 等，固定化脂肪酶催化高酸廢油脂酯交換生產(chǎn)生物柴油，催化學(xué)報(bào)，2006 (2): 146-150)。專利ZL200410100479.2公開了脂肪酶法制備生物柴油和微生物發(fā)酵生產(chǎn)l， 3-丙二醇的偶聯(lián)技術(shù)。公開文獻(xiàn)號(hào)CN1730613A的專利文 件公開了一種生物酶法催化高酸值油脂進(jìn)行酯交換反應(yīng)生產(chǎn)生物柴油的方 法，以短鏈脂肪酸酯作為?；荏w，采用堿性物質(zhì)為添加劑，利用脂肪酶 催化高酸值油脂生產(chǎn)生物柴油。
但是，由于甲醇對(duì)酶有毒性，致使酶法生物柴油轉(zhuǎn)化率低；脂肪酶耐 高溫差，生產(chǎn)過程中高溫對(duì)酶活影響較大；而且酶及酶固定化成本較高。 以上種種問題使酶法生產(chǎn)生物柴油仍未不能普及工業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種固定化脂肪酶的制備方法，得到的固定化 脂肪酶具有較好的穩(wěn)定性和催化效果。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了如下技術(shù)方案大孔樹脂經(jīng)預(yù)處理后， 加入脂肪酶液和印跡分子，振蕩吸附，冷凍干燥后進(jìn)行界面激活技術(shù)處理， 過濾脫除激活劑，再次冷凍干燥，獲得固定化脂肪酶。
所述大孔樹脂為AB-8或NKA聚苯乙烯型大孔吸附樹脂。 作為本發(fā)明的改進(jìn)，按照以下方法對(duì)大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理用極性有
機(jī)溶劑浸泡大孔樹脂，過濾脫去有機(jī)溶劑，再水洗樹脂以去掉殘留極性有
機(jī)溶劑，最后用緩沖液浸泡平衡。
所述極性有機(jī)溶劑對(duì)大孔樹脂的浸泡時(shí)間為2 8 h，浸泡溫度為30 70。C。
所述緩沖液摩爾濃度為0.05 1.5Omol/L， pH值為6.8 7.2，緩沖液加入 量為2 8mL/g樹脂，緩沖液浸泡時(shí)間為8 16h，浸泡溫度為30 70 °C。 所述印跡分子為底物類似物，底物類似物加入量為2 12 mg /g樹脂。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果體現(xiàn)在本發(fā)明采用了聚丙乙烯大 孔樹脂作固定化載體，結(jié)合分子印跡和界面激活技術(shù)，酶固定化率高(達(dá) 9690、催化效果好(甲酯轉(zhuǎn)化率達(dá)97%)、重復(fù)利用批次多(高達(dá)200批次)。


圖l是本發(fā)明工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式
圖1為本發(fā)明工藝流程圖，現(xiàn)結(jié)合附圖和實(shí)施例具體說明本發(fā)明。
稱取1. 1242 g型號(hào)為NKA聚苯乙烯大孔樹脂，加入5 mL無水乙醇浸 泡2 h，脫除乙醇并以蒸餾水洗滌4次，加5 mL濃度為0.05 mol/L ， pH 為6.8的磷酸鈉緩沖液液平衡8 h，脫除緩沖液，再加入2.5 mL濃度為 160mg/mL的脂肪酶液和10 ixmol月桂酸，置于37 。C條件下，設(shè)定轉(zhuǎn)速為 150 rpm振蕩吸附l h，然后取出過濾，并以磷酸鈉緩沖液洗滌3次后，于 真空度為20Pa，干燥溫度-50 。C條件下真空干燥4h。最后，加入125 mL 激活劑(正己烷、庚烷)，于37。C下界面激活處理lh后，再將固定化脂肪 酶置于通風(fēng)櫥中，使有機(jī)溶劑揮發(fā)完全，得固定化脂肪酶產(chǎn)品。測(cè)定脂肪 酶固定化率為96%，固定化酶蛋白比酶活為19500 U/g.
實(shí)施例2
稱取1. 0042 g型號(hào)為AB-8聚苯乙烯大孔樹脂，加入5 mL無水乙醇浸 泡2 h，脫除乙醇并以蒸餾水洗滌4次，加8 mL濃度為1.00 mol/L pH 為7.2的磷酸鈉緩沖液液平衡12 h，脫除緩沖液，再加入8.0 mL濃度為 160 mg/mL的脂肪酶液和60 u mol月桂酸，置于37匸條件下，設(shè)定轉(zhuǎn)速 為280 rpm振蕩吸附4h，然后取出過濾，并以磷酸鈉緩沖液洗滌3次后， 于真空度為20Pa，干燥溫度-50 。C條件下真空干燥10 h。最后，加入105 mL激活劑(正己烷、庚垸)，于37"C下界面激活處理2h后，再將固定化脂
肪酶置于通風(fēng)櫥中，使有機(jī)溶劑揮發(fā)完全，得固定化脂肪酶產(chǎn)品。測(cè)定脂 肪酶固定化率為89%，固定化酶蛋白比酶活為10600 U/g.
實(shí)施例3
原料取烏桕梓油100 g
首先，將原料油放入反應(yīng)釜內(nèi)，依次加4g固定化脂肪酶(載體為NKA 聚苯乙烯大孔樹脂)和20 mL甲醇，開啟恒溫水浴控制開關(guān)和內(nèi)循環(huán)控制開 關(guān)，當(dāng)溫度升至40 。C時(shí)，計(jì)時(shí)進(jìn)行酯交換反應(yīng)，反應(yīng)20h后停止反應(yīng)， 從反應(yīng)釜排液口放出酯化產(chǎn)物98.6g，靜置分層，收集輕相液，減壓蒸餾回收甲醇，生物柴油轉(zhuǎn)化率為97%。對(duì)本發(fā)明的固定化脂肪酶重復(fù)利用結(jié)果 表明，重復(fù)200批次，生物柴油轉(zhuǎn)化率仍為95%。
實(shí)施例4:
原料大豆油下腳料100g，測(cè)定原料油的酸價(jià)為85mgKOH/g油。 首先，將原料油放入反應(yīng)釜內(nèi)，依次加6g固定化脂肪酶(載體為NKA 聚苯乙烯大孔樹脂)和24mL甲醇，開啟恒溫水浴控制開關(guān)和內(nèi)循環(huán)控制開 關(guān)，當(dāng)溫度升至60 r時(shí)，計(jì)時(shí)進(jìn)行酯交換反應(yīng)，反應(yīng)18h后停止反應(yīng)， 從反應(yīng)釜排液口放出酯化產(chǎn)物98.4g，靜置分層，收集輕相液，減壓蒸餾回 收甲醇，生物柴油轉(zhuǎn)化率為97.1%。對(duì)本發(fā)明的固定化脂肪酶重復(fù)利用結(jié) 果表明，重復(fù)180批次，生物柴油轉(zhuǎn)化率仍為95%。
權(quán)利要求
1. 一種固定化脂肪酶的制備方法，具體步驟為大孔樹脂經(jīng)預(yù)處理后，加入脂肪酶液和印跡分子，振蕩吸附，冷凍干燥后進(jìn)行界面激活技術(shù)處理，過濾脫除激活劑，再次冷凍干燥，獲得固定化脂肪酶。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于， 所述大孔樹脂為AB-8或NKA聚苯乙烯型大孔吸附樹脂。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在 于，按照以下方法對(duì)大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理用極性有機(jī)溶劑浸泡大孔樹脂， 過濾脫去有機(jī)溶劑，再水洗樹脂以去掉殘留極性有機(jī)溶劑，最后用緩沖液 浸泡平衡。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的樹脂預(yù)處理方法，其特征在于，所述極性 有機(jī)溶劑對(duì)大孔樹脂的浸泡時(shí)間為2 8 h，浸泡溫度為30~70°C 。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于， 所述緩沖液摩爾濃度為0.05 1.50mol/L， pH值為6.8 7.2，緩沖液加入量為 2 8mL/g樹脂，緩沖液浸泡時(shí)間為8 16h，浸泡溫度為30~70 °C。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于， 所述印跡分子為底物類似物。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于， 所述底物類似物加入量為2~12 mg /g樹脂。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于， 在界面激活技術(shù)處理過程中采用的激活劑為庚烷。
全文摘要
一種固定化脂肪酶的制備方法，具體步驟為大孔樹脂經(jīng)預(yù)處理后，加入脂肪酶液和印跡分子，振蕩吸附，冷凍干燥后進(jìn)行界面激活技術(shù)處理，過濾脫除激活劑，再次冷凍干燥，獲得固定化脂肪酶。酯交換反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明制備的固定化脂肪酶具有較好的催化活力和使用穩(wěn)定性，其催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率可達(dá)97％以上，重復(fù)利用批次為200次。
文檔編號(hào)C12N11/00GK101280297SQ20081004785
公開日2008年10月8日 申請(qǐng)日期2008年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月28日
發(fā)明者云 劉, 濤 劉, 莉 徐, 楊江科, 閆云君, 瑛 黃 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)