專利名稱：：一種用于篩選定向進(jìn)化突變酶的快速質(zhì)粒營(yíng)救法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是生物工程體外定向進(jìn)化快速篩選技術(shù)，特別是一種用于篩選定向進(jìn)化突變酶的快速質(zhì)粒營(yíng)救法，是一種快速高效篩選耐高溫和耐酸堿酶的方法。特別適合用于大規(guī)模的篩選工業(yè)用超高溫突變酶基因，能短時(shí)間內(nèi)得到大量的突變基因。
背景技術(shù)：
：體外定向進(jìn)化是近幾年新興起來(lái)的一種蛋白質(zhì)改造新策略，它可以在尚不知道蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，或者根據(jù)現(xiàn)有的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)知識(shí)尚不能進(jìn)行有效的定點(diǎn)突變時(shí)，借鑒實(shí)驗(yàn)室手段在體外模擬自然進(jìn)化的過(guò)程(隨機(jī)突變、重組和選擇),使基因發(fā)生大量變異,并定向選擇出所需性質(zhì)或功能,從而使幾百萬(wàn)年的自然進(jìn)化過(guò)程在短期內(nèi)得以實(shí)現(xiàn)。用定向進(jìn)化的方法改造工業(yè)用酶，提高酶在非天然環(huán)境(如有機(jī)溶劑)中的活性、耐熱穩(wěn)定性、非天然底物的特異性、對(duì)映體選擇性等方面都有成功。但在構(gòu)建突變體庫(kù)的策略日益成熟的今天，如何快速、高通量的篩選出適合工業(yè)用途的進(jìn)化酶的篩選策略成為制約酶定向進(jìn)化的瓶頸問(wèn)題。現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)篩選定向誘變轉(zhuǎn)化子的方法A、將定點(diǎn)誘變和隨機(jī)誘變的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌；B、構(gòu)建目的基因的巨大突變文庫(kù)；C、將轉(zhuǎn)化子進(jìn)行拷貝；E、對(duì)一個(gè)拷貝進(jìn)行高溫(60-100'C)處理或酸堿(pH4~10)處理；F、在對(duì)應(yīng)于相應(yīng)的拷貝中，挑選在高溫、酸堿條件下有酶活的轉(zhuǎn)化子；G、對(duì)挑取的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)(16-18小時(shí))；H、抽提質(zhì)粒；I、采用快速轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化驗(yàn)證；J、最后對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定直到獲得目的突變子。該方法對(duì)轉(zhuǎn)化子必須進(jìn)行拷貝備份，費(fèi)工費(fèi)時(shí)，不能快速篩選出突變酶
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提出一種篩選定向進(jìn)化突變酶的快速質(zhì)粒營(yíng)救法，可直接從加熱處理或耐酸處理后再加熱處理的平板中回收攜帶有突變基因的質(zhì)粒，用于進(jìn)一步的篩選和基因測(cè)序，篩選定向進(jìn)化突變酶。本發(fā)明的步驟為-A、將定點(diǎn)誘變和隨機(jī)誘變的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌；B、構(gòu)建目的基因的巨大突變文庫(kù)；C、高溫60-100'C處理(10-30分鐘)構(gòu)建的突變基因文庫(kù)；或者耐酸pH4"40處理(10-15分鐘)再高溫60-100'C處理(10-30分鐘)構(gòu)建的突變基因文庫(kù)；D、直接挑選在高溫條件下有酶活的轉(zhuǎn)化子的部分死亡菌體；E、將挑出的少量死亡的菌體和大腸桿菌的高效感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行混合，采用快速轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化；F、最后對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定直到獲得目的突變子。本發(fā)明具體做法為1.質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化將定點(diǎn)誘變和隨機(jī)誘變的不同大小重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-GOLD，涂布帶有氨芐抗性的LB平板Amp50u/ml，37'C培養(yǎng)過(guò)夜，到轉(zhuǎn)化子單菌落直徑大小約為12mm，選取質(zhì)粒，構(gòu)建突變體文庫(kù)。2.將突變體文庫(kù)分別置于60~100'C，加熱處理10~30min;或者用pH為4.0~10.0的緩沖液分別對(duì)文庫(kù)平板處理10~15min后再分別置于60^100T，加熱處理10~30min;3.營(yíng)救質(zhì)粒轉(zhuǎn)化從加熱處理后的培養(yǎng)基上隨機(jī)選擇3個(gè)克隆，用牙簽或小槍頭刮下菌體，在冰浴條件下，分別混勻于大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。將混合液按照常規(guī)轉(zhuǎn)化步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化。然后分別將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液涂布于含Amp50u/ml的LB培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。4.細(xì)菌質(zhì)粒的提取驗(yàn)證挑取轉(zhuǎn)化克隆，接種于1ml含Amp50u/ml的LB培養(yǎng)液，37"C培養(yǎng)過(guò)夜，按試劑盒說(shuō)明抽提細(xì)菌質(zhì)粒，然后用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒分子量。本發(fā)明的基本原理和特點(diǎn)本發(fā)明打破了常規(guī)篩選的方法必須拷貝的思路，不對(duì)突變文庫(kù)進(jìn)行拷貝，將建庫(kù)的轉(zhuǎn)化子直接加熱，采用轉(zhuǎn)化子游離出的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化，節(jié)省了大量時(shí)間，提高了篩選效益。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單，易操作?？砂岩惠喌暮Y選過(guò)程縮短1-2天。大大減少人力、物力和財(cái)力的支出。本發(fā)明適合于質(zhì)粒大小在3-IOKB范圍的載體，篩選作用溫度60-100'C、PH范圍為4-IO的突變體酶。本發(fā)明和常規(guī)的方法如影印法和拷貝法相比，減少了影印和拷貝過(guò)程中的操作及培養(yǎng)菌體和抽提質(zhì)粒的操作，最少節(jié)約時(shí)間l-2天；同時(shí)還能避免影印法造成的混亂，不能正確挑取對(duì)應(yīng)菌落的不良現(xiàn)象。本發(fā)明和直接涂板加碘檢驗(yàn)透明圈后，然后刮取可以產(chǎn)生透明圈的那部分菌進(jìn)行質(zhì)粒的抽提相比，避免了由于菌體太少抽不到質(zhì)粒，以及在操作過(guò)程中造成污染的不良現(xiàn)象。圖1是不同條件對(duì)質(zhì)粒營(yíng)救效率的影響A:不同處理溫度對(duì)快速營(yíng)救的轉(zhuǎn)化子的影響，從60度到100度，溫度越高轉(zhuǎn)化子數(shù)越少。B:在70度的溫度條件下，高溫處理從10分鐘到30分鐘對(duì)快速營(yíng)救的轉(zhuǎn)化子的影響。C:經(jīng)PH4-10的處理，然后采用70度處理30分鐘，對(duì)快速營(yíng)救的轉(zhuǎn)化子的影響，結(jié)果顯示隨pH升高，轉(zhuǎn)化子數(shù)量增加。D:不同大小質(zhì)粒對(duì)對(duì)快速營(yíng)救的轉(zhuǎn)化子的影響，結(jié)果顯示質(zhì)粒從3-lOKb，質(zhì)粒越大轉(zhuǎn)化子越小。圖2是轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒抽提電泳圖，它是對(duì)圖1D的驗(yàn)證，顯示我們確實(shí)得到了從3-10Kb大小的質(zhì)粒。圖3是耐高溫淀粉酶突變基因的篩選平板，A加熱前淀粉酶基因的轉(zhuǎn)化平板；B加熱后顯示水解圈的轉(zhuǎn)化平板。從B看出，經(jīng)高溫處理后，轉(zhuǎn)化子顯示出的酶活，我們直接挑取有酶活的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行下一步的驗(yàn)證研究。具體實(shí)施方式A材料l.菌種和質(zhì)粒大腸桿菌菌株XL10"COLD，本發(fā)明所用質(zhì)粒(見(jiàn)表l)均由實(shí)驗(yàn)室保存和構(gòu)建。pBluescriptKS是原始質(zhì)粒，在TaKaRa等公司有售，其他質(zhì)粒是本實(shí)驗(yàn)室按常規(guī)方法構(gòu)建。高效感受態(tài)細(xì)胞XL10"GOLD的制備方法參考分子克隆手冊(cè)方法(1989)。2.試劑0.2mol/L醋酸緩沖液(pH4.0)，磷酸緩沖液(pH6.0)，磷酸緩沖液(pH8.0)，和NaOH-磷酸緩沖液(pH10.0)，LB培養(yǎng)基用于五.//的生長(zhǎng)和保存。耐高溫瓊脂(Phytage,Sigma)，氨芐青霉素(Amp)，DNAMaiker，質(zhì)粒抽提試劑盒、感受態(tài)制備試劑等分別購(gòu)自TaKaRa、Sigma等公司，其它常規(guī)試劑采用進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。表l本發(fā)明用的菌株和質(zhì)粒<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例1篩選耐高溫的酶A高溫處理選取質(zhì)粒大小為6.0kb的pGEX-amy為材料，構(gòu)建突變體文庫(kù)，將文庫(kù)平板分別置于60"C，70。C，80°C，90°C，100°C，加熱處理10~30min。B.營(yíng)救質(zhì)粒轉(zhuǎn)化從加熱處理后的培養(yǎng)基上對(duì)每個(gè)處理選擇3個(gè)酶活有變化的克隆(見(jiàn)圖3顯示處理后的結(jié)果)，用牙簽或小槍頭刮下菌體，在冰浴條件下，分別混勻于大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。將混合液按照常規(guī)轉(zhuǎn)化步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化。然后分別將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液涂布于含Amp50u/ml的LB培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。C.處理結(jié)果處理溫度越高，轉(zhuǎn)化子越少(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖1A);但不影響我們對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化子的下一步研究。能夠迅速的篩選到編碼耐高溫的基因。D.結(jié)果驗(yàn)證最后對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定直到獲得目的突變子。實(shí)施例2篩選耐酸和堿酶的編碼基因A.pH條件對(duì)質(zhì)粒營(yíng)救效率的影響選取質(zhì)粒大小為4.0kb的pET23A-h3e為材料，構(gòu)建突變體文庫(kù)；用pH為4.0，6.0，8.0，10.0的緩沖液分別對(duì)文庫(kù)平板處理lOmin，倒掉多余的緩沖液。B.高溫處理將經(jīng)不同pH處理過(guò)的文庫(kù)置于70"C，加熱處理l(^30min。c:.營(yíng)救質(zhì)粒轉(zhuǎn)化從加熱處理后的培養(yǎng)基上隨機(jī)選擇3個(gè)克隆，用牙簽或小槍頭刮下菌體，在冰浴條件下，分別混勻于大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。將混合液按照常規(guī)轉(zhuǎn)化步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化。然后分別將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液涂布于含Amp50u/ml的LB培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。D.處理結(jié)果隨酸堿度不一樣，轉(zhuǎn)化子數(shù)量有變化(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖l-C);但不影響我們對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化子的下一步研究。能夠迅速的篩選到編碼耐酸堿的酶的基因。E.結(jié)果驗(yàn)證最后對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定直到獲得目的突變子。實(shí)施例3篩選不同大小的質(zhì)粒A質(zhì)粒大小為研究質(zhì)粒大小對(duì)質(zhì)粒營(yíng)救轉(zhuǎn)化效率的影響，選取單菌落分散良好的pBluescriptKs(2.9kb)，pET23A(4.0kb)，pGEX-amy(6.0kb)，pYES2/NTA(8.0kb)，pPIC9K-xamy(10.0kb)轉(zhuǎn)化平板，B高溫處理70'C，加熱處理30min。C.營(yíng)救質(zhì)粒轉(zhuǎn)化從加熱處理后的培養(yǎng)基上分別隨機(jī)選擇3個(gè)克隆，用牙簽或小槍頭刮下菌體，在冰浴條件下，分別混勻于大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。將混合液按照常規(guī)轉(zhuǎn)化步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化。然后分別將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液涂布于含Amp50u/ml的LB培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。D.處理結(jié)果質(zhì)粒大小不一樣，轉(zhuǎn)化子數(shù)量有變化，(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖l-D);但不影響我們對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化子的下一步研究。能夠迅速的篩選到分子量大小從3-10KB的質(zhì)粒(見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖2)。E.結(jié)果驗(yàn)證最后對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定直到獲得目的突變子。權(quán)利要求1.一種用于篩選定向進(jìn)化突變酶的快速質(zhì)粒營(yíng)救法，其特征在于步驟為A、將定點(diǎn)誘變和隨機(jī)誘變的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌；B、構(gòu)建目的基因的巨大突變文庫(kù)；C、高溫60-100℃處理(10-30分鐘)構(gòu)建的突變基因文庫(kù)；或者酸堿pH4～10處理(10-15分鐘)后，再高溫60-100℃處理(10-30分鐘)構(gòu)建的突變基因文庫(kù)；D、直接挑選在高溫條件下有酶活的轉(zhuǎn)化子的部分死亡菌體；E、將挑出的少量死亡的菌體和大腸桿菌的高效感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行混合，采用快速轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化；F、最后對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定直到獲得目的突變子。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于篩選定向進(jìn)化突變酶的快速質(zhì)粒營(yíng)救法，其特征在于步驟為1.質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化將定點(diǎn)誘變和隨機(jī)誘變的不同大小重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-GOLD,涂布帶有氨芐抗性的LB平板Amp50u/ml，37"C培養(yǎng)過(guò)夜，到轉(zhuǎn)化子單菌落直徑大小約為l2mm，選取質(zhì)粒，構(gòu)建突變體文庫(kù)；2.將突變體文庫(kù)分別置于60~100'C，加熱處理10~30min;或者用pH為4.0~10.0的緩沖液分別對(duì)文庫(kù)平板處理10~l5min后，再高溫60-100'C處理(10-30分鐘)；3.營(yíng)救質(zhì)粒轉(zhuǎn)化從加熱處理后的培養(yǎng)基上隨機(jī)選擇3個(gè)克隆，用牙簽或小槍頭刮下菌體，在冰浴條件下，分別混勻于大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞液中，進(jìn)行快速轉(zhuǎn)化，然后分別將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液涂布于含Amp50u/nd的LB培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)J4.細(xì)菌質(zhì)粒的提取驗(yàn)證挑取轉(zhuǎn)化克隆，接種于1ml含Amp50u/ml的LB培養(yǎng)液，37'C培養(yǎng)過(guò)夜，按試劑盒說(shuō)明抽提細(xì)菌質(zhì)粒，然后用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒分子量。全文摘要本發(fā)明提出了一種篩選定向進(jìn)化突變酶的快速質(zhì)粒營(yíng)救法，可直接從加熱處理或酸堿處理后再加熱處理的平板中回收攜帶有突變基因的質(zhì)粒，用于進(jìn)一步的篩選和基因測(cè)序，篩選出定向進(jìn)化突變酶。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單，易操作?？砂岩惠喌暮Y選過(guò)程縮短1-2天。大大減少人力、物力和財(cái)力的支出。本發(fā)明適合于質(zhì)粒大小在3-10KB范圍的載體，篩選作用溫度60-100℃、pH4-10。快速定向篩選出耐高溫和耐酸堿酶進(jìn)化突變酶。文檔編號(hào)C12Q1/02GK101302559SQ200810047900公開(kāi)日2008年11月12日申請(qǐng)日期2008年6月3日優(yōu)先權(quán)日2008年6月3日發(fā)明者濤柯,馬向東申請(qǐng)人:湖北大學(xué)