專利名稱：隱孢子蟲屬及微小隱孢子蟲種特異pcr檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及隱孢子蟲病的診斷和檢測技術(shù)，更確切地說是提供了一種隱孢子蟲屬 特異性及微小隱孢子蟲種特異PCR檢測試劑盒及檢測方法，屬于寄生蟲檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隱孢子蟲病(Oy/7ftw/wrWtoWs)是由隱孢子蟲所引起的一種危害嚴重的人獸共患 原蟲病，可造成哺乳動物尤其是反芻動物以及人的嚴重腹瀉。目前已經(jīng)命名隱孢子蟲 有27種，能感染人的隱孢子蟲有多種，其中以微小隱孢子蟲的感染最為常見，微小隱 孢子蟲宿主范圍廣泛且危害嚴重，多感染人、家畜等哺乳動物，因此是隱孢子蟲屬中 危害最大的隱孢子蟲種。
隱孢子蟲病的診斷方法主要有病原學診斷、免疫學診斷及分子生物學診斷三大類。 病學學診斷多通過糞便顯微鏡檢及改良的抗酸染色法檢查，此法費時費力且檢出率低 下。免疫學診斷有間接血凝試驗(IHA)、免疫熒光試驗(IFA)、嗨聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)、單克隆抗體(McAb)等方法，然這些免疫學方法特異性和敏感性也較低。 因此，開發(fā)一種特異靈敏的隱孢子蟲屬及微小隱孢子蟲種的檢測方法己經(jīng)是迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種隱孢子蟲屬及微小隱孢子蟲種特異的PCR檢測試劑盒，用于隱孢 子蟲病及微小隱孢子蟲種的鑒別診斷。 本發(fā)明還提供了該試劑盒的檢測方法。
本發(fā)明隱孢子蟲屬及微小隱孢子蟲種特異PCR檢測試劑盒，包括以下部分
(1) DNA裂解液含不同濃度的NaCl、 Tris-HCl、 EDTA、 SDS和蛋白酶K的混 合溶液；
其中，濃度配比為NaCl 100mM、 Tris-HCl(pH7.5)20Mm、 EDTA25Mm、 SDS20/。 (w/v)和蛋白酶K0.1ug/lU;
(2) PCR反應液終濃度各100-300uM的4種dNTPs，終濃度各10-100pmo1/ VI1的引物CF、 CR、 HF和HR， 1.5-4.5mM的Mg^濃度；T叫酶按每個PCR反應(20^1)
含2.01)加入，反應液中不含T叫酶；
(3)隱孢子蟲屬和微小隱孢子蟲種特異性引物 屬特異性診斷引物CF: 5'-ATTGGAGGTTGTTCCTTACTCCT-3'
CR: 5'-AGCCGCCCATAGAATCAAGAA-3' 種特異性診斷引物HF: 5'-TAAGAAGCCACCAAGAAGGCG-3'
HR: 5'-TCAATAGGCTTAAATGGGTTCGGGA-3 (4)陽性對照陽性對照為微小隱孢子蟲基因組DNA，比較PCR產(chǎn)物以及監(jiān)測 PCR操作過程是否正確。
本發(fā)明的試劑盒還可以含有瓊脂糖(A辟rose)、溴酚藍點樣緩沖液和Taq酶，其濃 度優(yōu)選為溴化乙錠10iig/iU;溴酚藍點樣緩沖液和Taq酶5U/ul。也還可以含有PCR 反應管。
本發(fā)明所述的試劑盒的檢測方法，包括以下歩驟
1) 樣本的預處理取樣本用水混勻過篩，先過60目，再過100目篩，濾液反復 離心沉淀三次，沉淀即為備用樣本；
2) 樣本DNA的提取
(1) 將上述沉淀轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，加入lml裂解液，在液氮和65flC水浴 中反復凍融三次；
(2) 將凍融后的樣品加入5-6 li 1 (20mg/ml)蛋白酶K,使其終濃度為100" g/ml。 混勻后在65C水浴中浸泡2h;
(3) 用酚:氯仿:異戊醇(24:25:1)進行抽提兩次，7000r/min離心十分鐘；
3) 、 PCR擴增
(1) 準備待檢樣品數(shù)+2的PCR反應管，管內(nèi)包括PCR液、Taq酶等，蓋緊蓋子， 在渦旋器上混勻備用；
(2) 將陰性和陽性對照分別加入標記好的管中，然后把樣品依次加入并標記好， 置于PCR儀中。PCR條件為95"預變性5min、 94"C變性30s、 6(TC退火40s、 72卩 延伸30s，共30個循環(huán)，后72'C延伸10min;
4)、 PCR產(chǎn)物觀察
稱取瓊脂糖，用電泳液混勻后(0.8%-1.0%)在微波爐中加熱三分鐘。等膠冷卻 后在加樣孔中分別加樣，100V電壓下電泳10分鐘，之后在紫外燈下觀察實驗結(jié)果，
如果出現(xiàn)同時存在424bp和223bp擴增條帶就證明是微小隱孢子蟲感染，如果只有 223bp條帶就證明是其它種的隱孢子蟲感染。
試驗例l
試劑盒的組成
裂解液(NaC1100mM、 Tris-HCl(pH 7.5)20Mrn、 EDTA25Mm、 SDS2% (w/v)和 蛋白酶K0.1ug/iil) 20ml; PCR反應液10管(20ul體系)，其中各自dNTPs的濃度 為250nM、引物HF、HR和CF、CR的終濃度各為0.5pmol/u 1，Mg^終濃度為1.5 mM; 4g瓊脂糖；50ul溴化乙錠(20"g/iil); 0.5外溴酚藍點樣緩沖液50nl; 10ulT叫酶 (5U/u 1); 1支微小隱孢子蟲基因組DNA陽性對照。
實驗例2
試劑盒特異性實驗
取羊微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、貝氏隱孢子蟲、豬隱孢子蟲、人源賈第蟲、 犬源賈第蟲、雞艾美爾球蟲、鼠艾美爾球蟲、弓形蟲、毛滴蟲等10個樣本的DNA為 模板，用建立的擴增體系分別對其進行擴增。
擴增條件為
,950C5min 940C 30s 590C 40s
72。C30s Goto2 30tims 720C lOmin
擴增產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖進行電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。
結(jié)果顯示(見附圖2、 3):種特異引物H只在牛和羊微小隱孢子蟲樣本中得到了 擴增，其它樣本均無擴增，擴增條帶為424bp，符合種特異檢測標準。屬特異引物C 分別在微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、貝氏隱孢子蟲、豬隱孢子蟲樣本中都得到了擴 增，擴增條帶為223bp，其它樣本均無擴增，符合屬特異檢測標準。
圖中，Lanel-10:牛微小隱孢子蟲、羊微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、貝氏隱孢 子蟲、豬隱孢子蟲、人源賈第蟲、犬源賈第蟲、雞艾美爾球蟲、鼠艾美爾球蟲、弓形 蟲、毛滴蟲。
實驗例3
試劑盒敏感性實驗
將提取出的總核酸在核酸分析儀上定量，分別將濃度稀釋到第個反應體系中的含
量為100ng、 10ng、 lng、 0.1 ng、 0.01 ng、 0.001 ng、 0.0001 ng。反應條件同特異性檢 測實施例，同時設(shè)陰性對照。產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖進行電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)上 觀察結(jié)果。結(jié)果表明H引物的檢測閾值為0.0Ing(10pg)， C引物的檢測閾值為0.001ng (lpg)，且二重PCR檢測的閾值也分別是H(10pg)和C(lpg)，完全符合敏感性檢測標 準。
見附圖3、 4、 5、 6: Lanel-7:模板濃度梯度設(shè)為100ng、 10ng、 1 ng、 0.1 ng、 0.01 ng、 0.001 ng、 0.0001 ng。由圖可見H和C引物最低檢測閾值分別為H(10pg)和 C(lpg)。
實驗例4
試劑盒的穩(wěn)定性和重復性實驗
陽性模板，PCR反應液，EX T叫酶在-20。C條件下貯存，裂解液、溴酚藍等其它 物品4QC保存即可。當貯存時間為30天、60天、100天、150天、200天時取出各組 分，用已知PCR陽性的樣品檢測試劑盒穩(wěn)定性。另外，15份PCR陽性樣本用此試劑 盒重復試驗3次，15份PCR陰性樣本同樣重復3次，擴增條件如前所述。結(jié)果表明在 以上各時段取出的組分在已知PCR陽性樣品和15份PCR陽性樣本均得到了兩條明亮 特異的目的帶，而空白對照和15份陰性樣品均無任何擴增帶，故此試劑盒穩(wěn)定性和重 復性良好。
實施例5
試劑盒的保質(zhì)期試驗
將分別在4"和-2(TC貯存1個月、3個月、5個月、7個月和IO個月的試劑盒取 出并對已知陽性樣品進行檢測。擴增及檢查方法同前，結(jié)果表明在4C和-20"條件下 保存達10月之久的試劑盒依然能擴增出清晰的目的條帶，無雜帶。
本發(fā)明的積極效果在于利用PCR的特異性檢測方法，根據(jù)分析屬特異及種特異 的診斷序列設(shè)計屬和種特異引物，通過優(yōu)化擴增條件來提高其敏感性，電泳分析直接 觀察擴增結(jié)果。本發(fā)明試劑盒設(shè)計嚴謹，簡單易操作，靈敏性強，特異性強，能同時 鑒定屬特異和種特異隱孢子蟲感染，結(jié)果判定準確客觀。


圖l: 二重PCR引物(H和C)濃度配比摸索； 圖2、 3: 二引物特異性摸索；
圖4、 5、 6: 二引物各自及二重PCR體系敏感性摸索；
具體實施例方式
為了便于理解本發(fā)明，特例舉以下實施例。其作用被理解為是對本發(fā)明的闡釋而 非對本發(fā)明的任何形式的限制。
實施例l
隱孢子蟲屬特異診斷序列18SrRNA基因(此基因為隱孢子蟲的各個種所共有且 是種間基因變異最小的一段基因)序列中保守的部分，在NCBI中比對為多個隱孢子 蟲種共有，且同源性大于98%,符合屬特異檢測標準。
attggaggttgttccttactccttcagcaccttatgagaaatcaaagtctttgggttctagggggagtat ggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggagtggagcctgcggcttaatttg actcaacacgggaaaactcaccaggtccagacataggaaggattgacagattgatagctccttcttgatt ctatgggcggct
微小隱孢子蟲種特異診斷序列 一段指狀Ul核內(nèi)小分子核糖核蛋白基因，NCBI 中比對僅為人源和微小隱孢子蟲所共有，同源性均為100%，符合種特異檢測研究標準。 taagaagccacc幼g幼ggcggaaggcacaactataatttaagaaagttgttgaaaagtgaaaactatagggaactacag aagaaaaaagatgaggaagaggtccgaaaggagtttatgaagttacaaggggtcgagcaaac加taatcgtgaaaagaaaa gaatcaaactgatagataaggaagtoagatcaggaagttctaccacttttggagataatgttttcacagccaattatacctttgatg attcaaagaatatttttgaaaaaaaagatcataatgaa^ccatgacaaaacgaacgaaatgggaattattgggaaatgggaag aagttaaagagtctgaatctgcctttttaggaaatattaccttagaacaacaagatcatactcaaatcccgaacccatttaag cctattga 實施例2
根據(jù)實施例1的隱孢子蟲屬特異和種特異診斷序列設(shè)計特異性診斷引物如下
屬特異性診斷引物CF: 5' -ATTGGAGGTTGTTCCTTACTCCT-3'
CR: 5， -AGCCGCCCATAGMTCMGAA-3，
種特異性診斷引物HF: 5'-TAAGAAGCCACCAAGMGGCG-3'
HR: 5' -TCAATAGGCTTAAATGGGTTCGGGA-3
以上兩種引物在同一體系中(二重PCR)能同時擴增出種特異和屬特異的診斷基 因片斷，目的條帶明亮，無非特異性雜帶。實現(xiàn)同時檢測隱孢子蟲屬和微小隱子蟲的 目的。
實施例3
隱孢子蟲屬和微小隱孢子蟲PCR檢測試劑盒，組成結(jié)構(gòu)如下
(1) DNA裂解液含不同濃度的NaCl、 Tris-HCl、 EDTA、 SDS和蛋白酶K的混 合溶液。各濃度配比為NaCl 100mM、 Tris-HCl(pH 7.5)20Mm、 EDTA25Mm、 SDS2%
(w/v)和蛋白酶K 0.1lig/iU。裂解液的作用是將卵囊裂解并消化其中的蛋白質(zhì)，釋 放出基因組DNA。
(2) PCR反應液終濃度各100-300 u M的4種dNTPs,終濃度各10-100pmo1/ "1的弓l物CF、 CR、 HF和HR, 1.54.5mM的Mg^濃度。T叫酶按每個PCR反應(20 111)含2.011加入，反應液中不含T叫酶。
(3) 隱孢子蟲屬和微小隱孢子蟲種特異性引物
(4) 陽性對照本發(fā)明的試劑盒所用陽性對照為微小隱孢子蟲基因組DNA,其 作用是比較PCR產(chǎn)物以及監(jiān)測PCR操作過程是否正確。
此外，本發(fā)明的試劑盒還可以含有瓊脂糖(Agarose)、溴酚藍點樣緩沖液和T叫 酶，其濃度優(yōu)選為溴化乙錠10lig/ul;溴酚藍點樣緩沖液和Taq酶5U/Ul。還可以含 有PCR反應管。
實施例4
本發(fā)明試劑盒PCR反應條件的優(yōu)化過程為
二對引物各自濃度的優(yōu)化設(shè)置引物在體系的終濃度梯度為0.5ixM、 1UM、 1.5 ii M、 2uM、 2.5uM、 3uM,用此區(qū)間的引物嘗試都得到相應的擴增，其中當引物量為 lOpmol (引物的貯存濃度為20pmol/u 1,取0. 5u 1)終濃度為0. 5 pmol/u 1時效果 最佳。
二對引物各自退火溫度的優(yōu)化設(shè)置引物的退火溫度分別為47"C、 49"C、 52"C、 54"C、 56"C、 59。C、 61°C、 63°C,在梯度PCR儀上進行擴增，結(jié)果在59"C時兩引物都有 最優(yōu)化的擴增。
二對引物各自dNTPs濃度的優(yōu)化設(shè)置每種dNTPs (each)濃度梯度為50uM、 100ixM、 250u M、 350 ii M、 400 uM。，在這個濃度段里都得到不錯的擴增，其中在濃度 為250uM (each)時兩引物均有最佳擴增。
二對引物各自Mg"濃度的優(yōu)化設(shè)置Mg"終濃度梯度為lnM、 1.5nM、 2 nM、 3 nM、 4 nM、 5 nM,其中濃度在1. 5 mM時兩引物均有最佳擴增。
兩引物最佳酶濃度的摸索設(shè)置酶濃度梯度為0.5U、 1U、 2U、 3U、 4U，兩引物 在此濃度段時均有不錯的擴增，但在2U時兩引物均得到最優(yōu)化的擴增。
二重PCR體系條件的摸索二重PCR體系的Mg"終濃度為3mM, dNTPs(each)的終 濃度為500uM，酶濃度為2U,退火溫度為59"C,弓|物C的濃度為0. 5 pmol/" 1,弓l物 H的終濃度為0. 5pmol/ul。
見附圖1: Lanel-6: H和C引物各濃度配比梯度為:0.5/0.5uM、 0.6/0.5uM、 0.7/0.5uM、 0.8/0.5wM、 0.9/0.5uM、 1/0.5uM。由上圖可見，兩引物濃度配比為
0、 5/0. 5 ii M時就能發(fā)揮最佳擴增效果。
實施例5
分別采集長春地區(qū)的35份牛糞樣和50份羊糞樣，用經(jīng)典的改良抗酸染色方法作 對比結(jié)合二重PCR方法對樣品進行檢測。
(一) 改良抗酸染色法
每個糞樣取20g,加5倍水用玻璃棒攪勻，先用60目尼龍篩過濾，再用100目尼 龍篩過濾，將濾液涂片，自然干燥或在酒精燈上干燥，將適量復紅染液覆蓋在固定好 的濾液上面，7-8分鐘后流水沖洗。滴加1096硫酸覆蓋在復紅著色的濾液上面，5-6分 鐘后流水沖洗。滴加孔雀綠于樣品上面，2min后水洗，自然干燥后10X100倍油鏡鏡 檢。
附抗酸染色染液配制方法
1.復紅染液堿性復紅4g, 95%酒精20ml,石炭酸8ml,蒸餾水lOOml。 2.10%硫酸 9896濃硫酸10ml，蒸餾水90ml。 3.孔雀綠復染0.2g孔雀綠，蒸餾水100ml。
(二) PCR檢測
1、 樣本的預處理
取樣本20g用水混勻過篩，先過60目，再過100目篩，濾液用水平離心機3000r/min
反復離心沉淀三次，沉淀即為備用樣本。
2、 樣本DNA的提取
(1) 將上述沉淀轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，加入lml裂解液，在液氮和65iC水浴中反 復凍融三次。
(2) 將凍融后的樣品加入5-6ul (20rag/ml)蛋白酶K，使其終濃度為100ug/ml。 混勻后在651C水浴中浸泡2h。
(3) 用酚:氯仿:異戊醇(24:25:1)進行抽提兩次，7000r/rain離心十分鐘。
(4) 將上面的水相小心的吸取到滅菌的EP管中，注意不要吸取中層變性的蛋白層。
(5) 在水相中加入3M醋酸鈉(PH5.2) 60-70ul，再加入2倍體積的冷乙醇在-20。C 冰箱中過夜沉淀。
(6) 次日，將沉淀完全的樣品在4"C冷凍離心機中離心30rain，棄上清后再用75 酒 精洗滌一遍。
(7) 棄酒精后在冷凍干燥機中凍干，用TE液或是滅菌4蒸水溶解保存。
3、 PCR擴增
(1) 按待檢樣品數(shù)+2的PCR反應管取PCR反應液、Taq酶等，混于一管中，建立20 "1體系，蓋緊蓋子，在渦旋器上混勻備用。
(2) 取陰性和陽性對照各liU分別加入標記好的管中，然后取樣品各lixl依次加 入并標記好，置于PCR儀中。
(3) PCR擴增條件為
<formula>formula see original document page 11</formula>
4、 PCR產(chǎn)物觀察
稱取瓊脂糖，配制0.挑的瓊脂糖凝膠，按0. 5 ii g/ml加入E. B.，用電泳液混勻后 (0.8%_1.0%)在微波爐中加熱三分鐘。等膠冷卻后在加樣孔中分別加樣，IOOV電壓下 電泳10分鐘，之后在紫外燈下觀察實驗結(jié)果，如果出現(xiàn)同時存在424bp和223bp擴增 條帶就證明是微小隱孢子蟲感染，如果只有223bp條帶就證明是其它種的隱孢子蟲感 染。
(三)、改良抗酸染色和二重PCR檢測結(jié)果
經(jīng)改良抗酸染色和二重PCR檢測發(fā)現(xiàn)35份牛糞樣中改良抗酸染色法檢出3例微小 隱孢子蟲和18例安氏隱孢子蟲，二重PCR法檢出4例微小隱孢子蟲和20例安氏隱孢 子蟲，50份羊糞樣中改良抗酸染色法檢出6例微小隱孢子蟲和0例安氏隱孢子蟲，二 重PCR法檢出8例微小隱孢子蟲和0例安氏隱孢子蟲。
權(quán)利要求
1、一種隱孢子蟲屬及微小隱孢子蟲種特異PCR檢測試劑盒，包括以下部分(1)DNA裂解液含不同濃度的NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；各濃度配比為NaCl 100mM、Tris-HCl(pH7.5)20Mm、EDTA25 Mm、SDS 2％(w/v)和蛋白酶K 0.1μg/μl；(2)PCR反應液終濃度各100-300μM的4種dNTPs，終濃度各0.5-3pmol/μl的引物CF、CR、HF和HR，1.5-4.5mM的Mg2+濃度；Taq酶按每個PCR反應(20μl)含2.0U加入，反應液中不含Taq酶；(3)隱孢子蟲屬和微小隱孢子蟲種特異性引物屬特異性診斷引物CF5’-ATTGGAGGTTGTTCCTTACTCCT-3’ CR5’-AGCCGCCCATAGAATCAAGAA-3’種特異性診斷引物HF5′-TAAGAAGCCACCAAGAAGGCG-3′ HR5′-TCAATAGGCTTAAATGGGTTCGGGA-3(4)陽性對照本發(fā)明的試劑盒所用陽性對照為微小隱孢子蟲基因組DNA，其作用是比較PCR產(chǎn)物以及監(jiān)測PCR操作過程是否正確。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中PCR反應液中4種dNTPs 的終濃度為各250uM，引物HF、 HR和CF、 CR和終濃度各為0.5pmo1/ li 1， Mg2+終濃度為1.5mM。
3、 權(quán)利要求1所述的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟 l)樣本的預處理取樣本用水混勻過篩，先過60目，再過100目篩， 濾液反復離心沉淀三次，沉淀即為備用樣本；2) 樣本DNA的提取(1) 將上述沉淀轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，加入lml裂解液，在液氮 和65'C水浴中反復凍融三次；(2) 將凍融后的樣品加入5-6iU (20mg/ml)蛋白酶K，使其終濃度 為100ug/ml?；靹蚝笤?5'C水浴中浸泡2h;(3) 用酚:氯仿:異戊醇(24:25:1)進行抽提兩次，7000r/min離心十分鐘；3) 、 PCR擴增(1) 準備待檢樣品數(shù)+2的PCR反應管，管內(nèi)包括PCR液、Taq酶 等，蓋緊蓋子，在渦旋器上混勻備用；(2) 將陰性和陽性對照分別加入標記好的管中，然后把樣品依次加 入并標記好，置于PCR儀中；PCR條件為95'C預變性5min、 94'C變性 30s、 60'C退火40s、 72-C延伸30s,從第二步開始共設(shè)30個循環(huán)，然后 72QC延伸10min;4) 、 PCR產(chǎn)物觀察稱取瓊脂糖，用電泳液混勻后(0.8%-1.0%)在微波爐中加熱三分鐘。 等膠冷卻后在加樣孔中分別加樣，100V電壓下電泳10分鐘，之后在紫外 燈下觀察實驗結(jié)果，如果出現(xiàn)同時存在424bp和223bp擴增條帶就證明是 微小隱孢子蟲感染，如果只有223bp條帶就證明是其它種的隱孢子蟲感 染。
全文摘要
本發(fā)明提供一種隱孢子蟲屬及微小隱孢子蟲種特異PCR檢測試劑盒，包括DNA裂解液、PCR反應液、隱孢子蟲屬和微小隱孢子蟲種特異性引物及陽性對照微小隱孢子蟲基因組DNA，利用PCR的特異性檢測方法，根據(jù)分析屬特異及種特異的診斷序列設(shè)計屬和種特異引物，通過優(yōu)化擴增條件來提高其敏感性，電泳分析直接觀察擴增結(jié)果。本發(fā)明試劑盒設(shè)計嚴謹，簡單易操作，靈敏性高，特異性強，能同時鑒定屬特異和種特異隱孢子蟲感染，結(jié)果判定準確客觀。
文檔編號C12Q1/04GK101353690SQ20081005095
公開日2009年1月28日 申請日期2008年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月11日
發(fā)明者宮鵬濤, 張國才, 張西臣, 巍 李, 李建華, 李淑紅, 舉 楊 申請人:吉林大學