專利名稱：在豌豆中瞬時表達外源蛋白的發(fā)芽種子真空侵染法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及在豌豆中瞬時表達外源蛋白的發(fā)芽種 子真空侵染法。
背景技術(shù)：
近年來以植物作為生物反應(yīng)器瞬時表達外源蛋白以其周期短、易操作和低成本等優(yōu)點成 為一個研究熱點。到目前為止利用植物瞬時表達體系的主要方法有葉片直接涂抹法、葉片真 空侵染法和葉片注射法三種。其中直接涂抹法和葉片注射法需要逐個葉片操作耗時比較長； 葉片真空侵染法主要是在離體葉片上進行，外源蛋白的表達只能限定在被侵染的葉片上，而 且真空侵染后需要后續(xù)的工作來維持葉片的新鮮度。
作為生物反應(yīng)器瞬時表達體系的植物有很多種，包括煙草、西紅柿、黃瓜、水稻和生菜 等。其中以茄科植物作為生物反應(yīng)器的研究居多，但茄科植物體中含有煙堿，在后期蛋白純 化過程中可能污染目的蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個方便、快捷可以在豌豆中大量瞬時表達外源蛋白方法。 本發(fā)明的具體方案如下 1.以綠色熒光蛋白GFP為報告基因建立和優(yōu)化發(fā)芽種子真空侵染瞬時表達體系。
首先將豌豆早褐病毒載體pCAPEl和pCAPE2-GFP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，挑取經(jīng)轉(zhuǎn) 化和鑒定的農(nóng)桿菌GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPEl單菌落，分別接種于LB液體培 養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)，離心收集菌體，菌體沉淀用無菌水溶液重懸，將GV3101-pCAPE2-GFP和 GV3101-pCAPEl兩種菌體的重懸液混合后侵染根長2-3厘米的豌豆發(fā)芽種子，侵染后將種子 播種于土壤中，8-20天在紫外燈下觀察豌豆植株中綠色熒光蛋白的表達情況以確定侵染條 件。選擇適當?shù)恼婵諌毫?、真空時間、菌液濃度和傷害處理四個因子進行體系的優(yōu)化，在無傷 害處理條件下，重懸液濃度OD60(pl.0-1.2，真空壓力為0.06-0.lMPa,真空時間為1-15分鐘， 于侵染后12-14天收獲外源蛋白。
2.以發(fā)芽種子真空侵染法在豌豆中瞬時表達人源酸性成纖維細胞生長因子
4將編碼人源酸性成纖維細胞生長因子DNA序列連入豌豆早褐病毒表達載體pCAPE2中 構(gòu)建得至lj pCAPE2-aFGF ，將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，挑取經(jīng)鑒定的農(nóng)桿菌 GV3101-pCAPE2-aFGF和GV3101-pCAPEl單菌落，分別接種于LB液體培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)， 離心收集菌體，菌體沉淀用無菌水溶液重懸，將GV3101-pCAPE2-aFGF和GV3101-pCAPEl 兩種菌體的重懸液混合后侵染根長2-3厘米的豌豆發(fā)芽種子，在無傷害處理條件下，侵染時 重懸液濃度OD6()()=1.0-1.2，真空壓力為0.06-0.1MPa，真空時間為1-15分鐘，侵染后將種子 播種于土壤中，并以1中以綠色熒光蛋白GFP為報告基因建立和優(yōu)化發(fā)芽種子真空侵染瞬 時表達體系為參照依據(jù)，于侵染后12-14天收獲外源蛋白。并以Western blot檢測外源蛋白 人源酸性成纖維細胞生長因子。
豆科植物是非常重要的經(jīng)濟作物，多數(shù)的豆科植物蛋白質(zhì)含量比較高，而且很多豆科植 物都是非常優(yōu)質(zhì)的牧草，因此以豆科植物作為生物反應(yīng)器具有重要意義。本發(fā)明周期短、易 操作、成本低、無污染，可以方便、快捷在豌豆中大量瞬時表達外源蛋白。
具體實施方案
本發(fā)明的實施例包括以下內(nèi)容
1. 以綠色熒光蛋白GFP為報告基因構(gòu)建并優(yōu)化豌豆發(fā)芽種子真空瞬時表達外源蛋白體系 將豌豆種子在清水中浸泡6-8小吋，之后置于濕潤的濾紙上于25-28'C黑暗條件下進行催芽，
以根長為2-3厘米的豌豆種子為實驗材料進行真空侵染。挑取經(jīng)轉(zhuǎn)化和鑒定的農(nóng)桿菌 GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPEl單菌落，分別接種于5 ml含有50 mg /L卡那霉素， 12.5 mg/L四環(huán)素和50 mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28 °C過夜培養(yǎng)。次日，按照1:50 的比例將1 ml的菌液加入50 ml的含有上述抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，選擇OD,值范圍 在1.0-1.2的菌液于常溫下4000 rpm， IO分鐘離心收集菌體，菌體沉淀用含有終濃度100 乙 酰丁香酮、10 mM NaCl、 1.75 mM CaCl2，， 250 pl Tween20、 pH 5.6的無菌水溶液重懸，將 GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPEl兩種菌體的重懸液l : 1混合，于室溫放置90分鐘 后侵染豌豆發(fā)芽種子。將侵染后的種子播種于土壤中，8-20天后在紫外燈下觀察GFP的表達 情況。通過設(shè)置傷害處理和不同的侵染時間、真空壓力以及菌液濃度對豌豆發(fā)芽種子真空侵 染體系進行優(yōu)化，我們確定最佳侵染條件為無傷害處理，菌液濃度OD6orl.0-1.2，真空壓力 為0.08MPa，真空時間為1分鐘。侵染后12-14天綠色熒光蛋白表達量最大，此為外源蛋白 收獲的最佳時間。
2. 以發(fā)芽種子真空侵染法在豌豆植株中表達人源酸性成纖維細胞生長因子
對pCAPE2載體進行改造，通過PCR方法在原載體上引入BglII酶切位點，根據(jù)AaFGF序列設(shè)計引物(正義引物5'-GGAAGATCTACATGGCTAATTACAAGAAGCC-3'反義引物 5'-CGGAATTCTTAATCAGAAGAGACTGGCAGG-3').經(jīng)PCR擴增出的aFG尸片段。PCR參 數(shù)94。C 3min;94。C 35 sec， 54°C 30sec，72。C 1 min共30個循環(huán)；72°C 1 min; 4 。C10min。 雙酶切后將"FGF片段連入pCAPE2得到目的載體pCAPE2-aFGF。將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 中，挑取經(jīng)鑒定的農(nóng)桿菌GV3101-pCAPE2-aFGF和GV3101-pCAPEl單菌落，分別接種于5ml 含有50mg/L卡那霉素，12.5 mg/L四環(huán)素和50mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28。C過 夜培養(yǎng)。次日，按照l:50的比例將lml的菌液加入50ml的含有上述抗生素的LB液體培養(yǎng) 基中，選擇OD6oo值范圍在1.0-1.2的菌液于常溫下4000 rpm， 10分鐘離心收集菌體，菌體沉 淀用含有終濃度100pM乙酰丁香酮、10mMNaCl、 1.75 mM CaCl2，、 250 pl Tween20、 pH 5.6 的無菌水溶液重懸，將GV3101-pCAPE2-aFGF禾tl GV3101-pCAPEl兩種菌體的重懸液1 : 1 混合，于室溫放置90分鐘后侵染根長2-3厘米的豌豆發(fā)芽種子，用于在豌豆中瞬時表達。根 據(jù)報告基因表達情況在侵染后12-14天后提取豌豆植株可溶性總蛋白。方法如下
取碗豆植物全株，快速稱量后放入研缽，加入液氮進行充分研磨。成粉末后轉(zhuǎn)移到 Eppendorf管中,加入預(yù)冷的蛋白提取緩沖溶液，顛倒混勻置于冰上。12000轉(zhuǎn)/分在4。C條件 下離心，取上清檢測；Western雜交分析，在分子量約17 kDa處有陽性信號，說明該體系能 夠有效的表達人源酸性成纖維細胞生長因子。
權(quán)利要求
1、在豌豆中瞬時表達外源蛋白的發(fā)芽種子真空侵染法，其特征是1). 以綠色熒光蛋白GFP為報告基因建立和優(yōu)化發(fā)芽種子真空侵染瞬時表達體系首先將豌豆早褐病毒載體pCAPE1和pCAPE2-GFP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，挑取經(jīng)轉(zhuǎn)化和鑒定的農(nóng)桿菌GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPE1單菌落，分別接種于LB液體培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)，離心收集菌體，菌體沉淀用無菌水溶液重懸；將GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPE1兩種菌體的重懸液混合后侵染根長2-3厘米的豌豆發(fā)芽種子；侵染后將種子播種于土壤中，8-20天在紫外燈下觀察豌豆植株中綠色熒光蛋白的表達情況以確定侵染條件，選擇適當?shù)恼婵諌毫Α⒄婵諘r間、菌液濃度和傷害處理四個因子進行體系的優(yōu)化，在無傷害處理條件下，重懸液濃度OD600＝1.0-1.2，真空壓力為0.06-0.1MPa，真空時間為1-15分鐘，于侵染后12-14天收獲外源蛋白；
2、按照權(quán)利要求1所述的在豌豆中瞬時表達外源蛋白的發(fā)芽種子真空侵染法，其特征是1).以綠色熒光蛋白GFP為報告基因構(gòu)建并優(yōu)化豌豆發(fā)芽種子真空瞬時表達外源蛋白體系將豌豆種子在清水中浸泡6-8小時，之后置于濕潤的濾紙上于25-28i:黑暗條件下進行催 芽，以根長為2-3厘米的豌豆種子為實驗材料進行真空侵染；挑取經(jīng)轉(zhuǎn)化和鑒定的農(nóng)桿菌 GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPEl單菌落，分別接種于5 ml含有50 mg /L卡那霉 素，12.5mg/L四環(huán)素和50mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28。C過夜培養(yǎng)；次日，按照、1:50的比例將1 ml的菌液加入50ml的含有上述抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，選擇006<3()值 范圍在1.0-1.2的菌液于常溫下4000 rpm， 10分鐘離心收集菌體，菌體沉淀用含有終濃度100 乙酰丁香酮、10 mM NaCl、 1.75 mM CaCl2，、 250 |al Tween20、 pH 5.6的無菌水溶液重懸； 將GV3101-pCAPE2-GFP和GV3101-pCAPEl兩種菌體的重懸液1 : 1混合，于室溫放置90 分鐘后侵染豌豆發(fā)芽種子；將侵染后的種子播種于土壤中，8-20天后在紫外燈下觀察GFP 的表達情況；設(shè)置侵染條件為無傷害處理，菌液濃度OD6o『1.0-1.2，真空壓力為0.08MPa， 真空時間為1分鐘；侵染后12-14天綠色熒光蛋白表達量最大，為外源蛋白收獲的最佳時間； 2).以發(fā)芽種子真空侵染法在豌豆植株中表達人源酸性成纖維細胞生長因子 對pCAPE2載體進行改造，通過PCR方法在原載體上引入BglII酶切位點，根據(jù)/^FGF 序列設(shè)計引物，正義引物5'-GGAAGATCTACATGGCTAATTACAAGAAGCC-3'反義引物 5，-CGGAATTCTTAATCAGAAGAGACTGGCAGG-3，，.經(jīng)PCR擴增出的片段，PCR 參數(shù)94°C 3 min; 94°C 35 sec, 54°C 30 see, 72°C 1 min共30個循環(huán)；72°C ,1 min; 4 °C10 min,雙酶切后將aFGF片段連入pCAPE2得到目的載體pCAPE2-aFGF，將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 GV3101中，挑取經(jīng)鑒定的農(nóng)桿菌GV3101-pCAPE2-aFGF和GV3101-pCAPEl單菌落，分別 接種于5 ml含有50 mg /L卡那霉素，12.5 mg/L四環(huán)素和50 mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基 中，28。C過夜培養(yǎng)；次日，按照l:50的比例將lml的菌液加入50ml的含有上述抗生素的 LB液體培養(yǎng)基中，選擇OD6oo值范圍在1.0-1.2的菌液于常溫下4000 rpm， 10分鐘離心收集 菌體，菌體沉淀用含有終濃度100 pM乙酰丁香酮、10 mM NaCl、 1.75 mM CaCl2,、 250 pl Tween20、 pH 5.6的無菌水溶液重懸；將GV3101-pCAPE2-aFGF和GV3101-pCAPEl兩種菌 體的重懸液1 : 1混合，于室溫放置90分鐘后侵染根長2-3厘米的豌豆發(fā)芽種子，設(shè)置侵染 條件為無傷害處理，菌液濃度OD6Q(rl.0-1.2、真空壓力為0.08MPa、真空時間為1分鐘；將 侵染后的種子播種于土壤中，并以l)中以綠色熒光蛋白GFP為報告基因建立和優(yōu)化發(fā)芽 種子真空侵染瞬時表達體系為參照依據(jù)，于侵染后12-14天的最佳時間收獲外源蛋白。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及在豌豆中瞬時表達外源蛋白的發(fā)芽種子真空侵染法 首先，建立發(fā)芽種子真空侵染法并進行優(yōu)化，選擇根長2-3厘米的豌豆種子為侵染材料，以綠色熒光蛋白GFP為報告基因?qū)φ婵諘r間、真空壓力及菌液濃度進行優(yōu)化得到表達外源蛋白的最適條件。然后進行人源酸性成纖維細胞生長因子植物病毒表達載體的構(gòu)建，將編碼人源酸性成纖維細胞生長因子DNA序列連入改造的植物病毒表達載體，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中用于在植物中瞬時表達。在最佳條件下侵染豌豆發(fā)芽種子，侵染后12-14天收獲外源蛋白。本發(fā)明周期短、易操作、成本低、無污染，可以方便、快捷在豌豆中大量瞬時表達外源蛋白。
文檔編號C12N15/83GK101457236SQ20081005144
公開日2009年6月17日 申請日期2008年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月20日
發(fā)明者朱筱娟, 偉 李, 王興智, 范亞軍 申請人:東北師范大學