專利名稱：一種具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
半纖維素酶是降解木糖、葡糖糖、甘露糖和五碳糖的一組酶的總稱。木聚糖酶是 半纖維素酶的主要酶之一。木聚糖酶是一組可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的復(fù)合酶 系。由于木聚糖分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有許多不同的取代基。因此，木聚糖的生物降解就 需要一個復(fù)雜的酶系統(tǒng)中不同組分之間的協(xié)同作用，才能將其轉(zhuǎn)化為基本單糖。作用 于主鏈的有兩種酶P -1， 4-內(nèi)切木聚糖酶和e -木糖苷酶。
(1 ) e -1, 4-內(nèi)切木聚糖酶f em/o- 7,4- "- Z)-xy/aray/a"o/^士o/a", 五C3.2丄&」， 一般而言，內(nèi)切木聚糖酶的作用是切開木聚糖主鏈內(nèi)的糖苷鏈，降低基質(zhì)的聚合度。 在內(nèi)切木聚糖酶作用的前期，所形成的主要產(chǎn)物是聚合度較大的低聚木糖，隨著水解 的深入主要生成木三糖、木二糖，但一般不會生成木糖。
(2) e-木糖苷酶W-xj;/ara:j;/o/^&o/必e,EC3.27.37y) ， P-木糖苷酶，是木聚糖 的外切水解酶，主要水解短鏈的低聚木糖或木二糖，并從非還原性末端釋放出木糖。 木二糖是此酶的最后底物，酶對低聚木糖的親和性隨聚合度的增加而降低。
作為粗纖維的一種，半纖維素廣泛應(yīng)用于飼料當(dāng)中。但單胃動物從日糧中攝取的 半纖維素會在腸道中形成高黏性多糖，從而阻止蛋白質(zhì)、脂肪的消化吸收，降低飼料 的轉(zhuǎn)化率。同時高黏度多糖通過改變腸細(xì)胞轉(zhuǎn)換速率、內(nèi)源性酶合成速率、微生物區(qū) 系及球蟲數(shù)量來影響動物的生產(chǎn)性能。半纖維素酶能將植物細(xì)胞壁中半纖維素分解成 葡萄糖，同時還可解除細(xì)胞壁對其他營養(yǎng)成分的封阻作用，所以在飼料中添加半纖維 素酶具有非常重要的意義。
由黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的微生物半纖維素酶能夠提高肉雞對大豆粕中粗纖維的利用 率。但在相當(dāng)長的歷史時期內(nèi)，由于生產(chǎn)成本高、活性低、穩(wěn)定性差等問題， 一直未能進(jìn)入實用階段。隨著生物技術(shù)和發(fā)酵工藝的發(fā)展，發(fā)達(dá)國家環(huán)保意識的提高，半纖 維素酵的研究和應(yīng)用重新被提到議事日程上來。目前微生物半纖維素酶己在西歐和各 國廣泛地用于畜禽生產(chǎn)。以往工業(yè)上生產(chǎn)的半纖維素酶是以自然界存在的微生物產(chǎn)生 具有高性能的自然酶為基礎(chǔ)。現(xiàn)通過基因工程技術(shù)，用經(jīng)選擇在廉價原料中容易培養(yǎng) 并且發(fā)酵液中容易純化酶的宿主微生物來生產(chǎn)。通過基因工程技術(shù)可在生物體間轉(zhuǎn)移 基因，而且還可以修飾結(jié)構(gòu)基因，從而使生產(chǎn)過程易進(jìn)行，并可按應(yīng)用要求剪接得到 具有特有性能的酶。國內(nèi)外對半纖維素酶展開了大量的研究，研究的領(lǐng)域不斷擴(kuò)大， 取得了許多進(jìn)展。近十幾年來，人們對真菌半纖維素酶基因的克隆與表達(dá)做了大量的 研究。黑曲霉(Aspe/^iW^加^e^所產(chǎn)生的半纖維素酶的降解作用日益受到重視，國
內(nèi)外對這方面的研究也日益增多。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷成熟，黑曲霉木聚糖酶基因 在基因工程上的應(yīng)用，逐漸引起人們的關(guān)注。
粟酒裂殖酵母OS^owZ^是一種單細(xì)胞的、真核生物，擁有同高等生物極其相似的 屬性染色體結(jié)構(gòu)和功能、細(xì)胞循環(huán)的控制以及RNA的拼接，這些屬性使S.pom^成為 生產(chǎn)真核蛋白的理想系統(tǒng)。用粟酒裂殖酵母作為宿主直到最近才引起重視，國外目前 利用裂殖酵母成功表達(dá)外源蛋白的例子很多，但國內(nèi)研究報道極少。2002年2月基因組 的測序及其各基因功能的取得更有利于研究外源蛋白在粟酒裂殖酵母中的表達(dá)。 S./ww&被用來通過基因互補(bǔ)來克隆真核基因，意味著在S.; om&中異質(zhì)基因的表達(dá)是 活躍的。利用各種表達(dá)構(gòu)建大量的po(ycw^ Wmy m/t^/e-艱原、f/ze /wwaw 朋礎(chǔ)raw6/"i7/、 Ae /z騰朋//ver e/7ox/iife /^t/ra/aye、 Ae / 謹(jǐn)朋Wood coagw/ario" ZTZ/a、 Ae A麵朋 /zj ocoWn /、 ra, <arg//7<xye、 ra/ M)尸-zt/waye、 /"敏/6油> -6(7丄-6)、爿ra6油戸'51 /7a/細(xì)a swgar的"5poWer ST尸7等高等真核基因，已在 5".; ow^被表達(dá)和純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其構(gòu)建方法。 本發(fā)明所提供的重組粟酒裂殖酵母工程菌，是將構(gòu)建含有半纖維素酶基因的重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體導(dǎo)入粟酒裂殖酵母中得到的。
本發(fā)明所提供的重組粟酒裂殖酵母工程菌的構(gòu)建方法是將半纖維素酶基因插入到 粟酒裂殖酵母表達(dá)載體的多克隆位點處，將構(gòu)建的重組粟酒裂殖酵母表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入粟 酒裂殖酵母中，獲得重組粟酒裂殖酵母轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)重組粟酒裂殖酵母使半纖維素酶 基因得到分泌表達(dá)。
本發(fā)明所述的半纖維素酶基因來源于黑曲霉基因組DNA，本發(fā)明提供了適用于黑 曲霉基因組DNA的提取方法。
本發(fā)明所述的兩種半纖維素酶基因內(nèi)切木聚糖酶基因XYNB，其序列如SEQ ID NO.l所述；木糖苷酶基因XLND,其序列如SEQIDN0.2所述。
本發(fā)明所提供的表達(dá)半纖維素酶基因的系統(tǒng)為五S尸表達(dá)系統(tǒng)，采用pESPUC質(zhì)粒作 為表達(dá)載體。這種質(zhì)粒源自尸祝"^"^// 噬菌粒且由如下四部分組成(1)一個Co/五7 復(fù)制起始點和氨芐青霉素抗性基因(aw^"7/z力ww'rfa"ce.v4m/ +)，其允許在大腸桿菌克隆 時進(jìn)行載體的復(fù)制和抗生素選擇；(2)—個wW序列可以提供在粟酒裂殖酵母OS.pom&) 中使載體自動復(fù)制所需要的復(fù)制起始點；(3)選擇標(biāo)記基因LEU2-d，源自釀酒酵母 (&cem^/ae)可以作為向粟酒裂殖酵母(S.p頻&)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化表達(dá)結(jié)構(gòu)的選擇標(biāo)定物；(4) 一個表達(dá)盒，包括粟酒裂殖酵母(S.p畫&)全長的nmtl啟動子(P訓(xùn)u)-終止子(T腦u)，和一 個多克隆位點(multiple cloning site,MCS)。 pESPUC物理圖譜如圖l所示。
本發(fā)明所述半纖維素酶XYNB基因位于粟酒裂殖酵母表達(dá)載體pESPUC的多克隆位 點處的XhoI和SalI限制性內(nèi)切酶酶切位點之間。
本發(fā)明所述半纖維素酶XLND基因位于粟酒裂殖酵母表達(dá)載體pESPUC的多克隆位 點處的BamHI和NotI限制性內(nèi)切酶酶切位點之間。
本發(fā)明所述篩選標(biāo)記有兩種， 一種為氨芐青霉素抗性基因(am/^c///^ myiWawce ^mp+)，其允許在大腸桿菌克隆時進(jìn)行載體的復(fù)制和抗生素選擇； 一種為選擇標(biāo)記基因 LEU2-d，源自釀酒酵母可以作為向粟酒裂殖酵母0S.;ww6e)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化表達(dá)結(jié)構(gòu)的選擇
標(biāo)定物。體，構(gòu)建含有XYNB基因的重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體為 pESPUC-XYNB，獲得的重組粟酒裂殖酵母工程菌為SP-Q01/pESPUC-XYNB;以 pESPUC為出發(fā)載體，構(gòu)建含有XLND基因的重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體為 pESPUC-XLND,獲得的重組粟酒裂殖酵母菌株為SP-QO 1/pESPUC-XLND。
本發(fā)明所提供的半纖維素酶基因表達(dá)的方法,是將構(gòu)建的含有半纖維素酶基因的重 組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體pESPUC-XYNB和pESPUC-XLND采用電穿孔法導(dǎo)入粟酒裂殖 酵母中。培養(yǎng)重組粟酒裂殖酵母時，無需加入誘導(dǎo)物，半纖維素酶基因前端自帶信號 肽序列，可以使半纖維素酶基因分泌表達(dá)，重組酵母表達(dá)的時間為3-6天。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點本發(fā)明所提供了具有高半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工 程菌及其構(gòu)建方法，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)半纖維素酶制備方法以及原核表達(dá)系統(tǒng)、其他酵母表
達(dá)系統(tǒng)的不足。
(1) 傳統(tǒng)半纖維素酶制備方法采用天然和誘變菌株發(fā)酵生產(chǎn)，成本高；另一方面 表現(xiàn)在酶的有效性差，應(yīng)用效果不穩(wěn)定。
(2) 雖然粟酒裂殖酵母屬于酵母類，但粟酒裂殖酵母與其它的酵母相比在進(jìn)化上 更高級，其類似的操作技術(shù)也能應(yīng)用于其它的酵母，但很多性質(zhì)不同于芽殖的釀酒酵 母，如本發(fā)明所用的是含有內(nèi)含子的半纖維素酶基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母中不能表達(dá)，但同 樣的基因在粟酒裂殖酵母中卻獲得了表達(dá)，其產(chǎn)物表達(dá)水平高，可直接分泌到培養(yǎng)基 中，并具有正常的生物學(xué)活性。這樣在進(jìn)行工程菌構(gòu)建時就不需要提取真菌總RNA在 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄來克隆半纖維素酶基因，只需要提取其總基因組DNA，成本低、省時省 力。
(3) 本發(fā)明所用的粟酒裂殖酵母表達(dá)菌株是SP-QOl，是用于ESP酵母表達(dá)和純化 系統(tǒng)中的單倍體菌株，含有h—交配型的和leul-32基因型，這個表達(dá)菌株包括一個變異的 LEU1基因，它編碼亮氨酸生物合成必備的3-丙基脫氫酶，LEU1基因突變導(dǎo)致亮氨酸營 養(yǎng)缺陷。而選用的表達(dá)載體卻含有選擇標(biāo)記基因LEU2-d，就可以通過基因互補(bǔ)直接對 轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，提高了篩選效率；而畢赤酵母系統(tǒng)需要用價格昂貴的抗生素進(jìn)行篩選。
(4)本發(fā)明所獲得的工程菌在進(jìn)行培養(yǎng)使半纖維素酶基因獲得表達(dá)時，無需加入 誘導(dǎo)物，半纖維素酶基因是否表達(dá)被培養(yǎng)基中硫胺(維生素B1)的濃度嚴(yán)格調(diào)控，當(dāng)培 養(yǎng)基中含X).5nM硫胺時，Pnmt,就被強(qiáng)烈的抑制，半纖維素酶基因不表達(dá)，而當(dāng)培養(yǎng)基
中不含硫胺時啟動子的誘導(dǎo)率約為400倍，半纖維素酶基因高度表達(dá)。并且半纖維素酶 基因前端自帶信號肽序列，可以使半纖維素酶基因分泌表達(dá)。結(jié)果如圖10所示，兩種 重組酵母轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)96h以內(nèi)的時間里有半纖維素酶酶活性，目的基因表達(dá)最高水平 出現(xiàn)在36-96h， SP-Q01/pESPUC-XYNB在培養(yǎng)0-60h間酶活逐漸升高，在培養(yǎng)60h達(dá)到 最高，分別為155U/mL，從60h到94h酶活逐漸降低；SP-Q01/pESPUC-XLND在培養(yǎng) 0-72h間酶活逐漸升高，在培養(yǎng)72h達(dá)到最高為86U/mL ，從72h到96h酶活逐漸降低。 此外，若將發(fā)明應(yīng)用于工業(yè)化半纖維素酶的生產(chǎn)，則具有酶活性高，熱穩(wěn)定性 強(qiáng)，生長周期短，提取成本低的優(yōu)點，從而可以提高畜禽生產(chǎn)性能和減少排泄物的污 染，同時也為開辟新的飼料資源、降低飼料生產(chǎn)成本提供了有效的途徑。


圖1為粟酒裂殖酵母表達(dá)載體pESPUC的物理圖譜。
圖2a為含有半纖維素酶XYNB基因的重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體構(gòu)建流程圖。
圖2b為含有半纖維素酶XLND基因的重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體構(gòu)建流程圖。
圖3為黑曲霉基因組DNA。
圖4a為XYNB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。
圖4b為XLND基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。
圖5a為重組克隆載體pMD18-T-XYNB的PCR和酶切鑒定。
圖5b為重組克隆載體pMD18-T-XLND的PCR和酶切鑒定。
圖6a為重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體pESPUC-XYNB的PCR和酶切鑒定。
圖6b為重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體pESPUC-XLND的PCR和酶切鑒定。
圖7a為重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體pESPUC-XYNB的電穿孔轉(zhuǎn)化子。圖7b為重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體pESPUC-XLND的電穿孔轉(zhuǎn)化子。 圖8a為重組粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESPUC-XYNB質(zhì)粒DNA的PCR鑒定。 圖8b為重組粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESPUC-XLND質(zhì)粒DNA的PCR鑒定。 圖9為重組粟酒裂殖酵母菌株SP-QO 1 /pESPUC-X YNB和SP-QO1 /pESPUC-XLND和 SP-Q01/ pESPUC表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。
圖10a為重組粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESPUC-XYNB、 SP-Q01/pESPUC-XLND不同
培養(yǎng)時間酶活力測定結(jié)果。
圖10b為重組粟酒裂殖酵母菌株SP-Q01/pESPUC-XYNB、 SP-Q01/pESPUC-XLND最適
培養(yǎng)溫度酶活力測定結(jié)果。
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實施例l、黑曲霉半纖維素酶基因的克隆 1、黑曲霉基因組DNA的提取
察氏培養(yǎng)基(PH=7.2) : 30g蔗糖，3g硝酸鈉,0.5g硫酸鎂，0.5氯化鉀，0.01 g硫酸亞 鐵，lg磷酸氫二鉀，13g瓊脂，加蒸餾水至1L。
(1) 菌絲的培養(yǎng)用察氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)黑曲霉3-5天,然后用察氏液體培養(yǎng)基培 養(yǎng)3天，28°C、 190r/min。
(2) 離心收集菌體，收集的菌體先用蒸餾水洗滌三次，然后真空抽干。
(3) 向1.5ml離心管中加入0.3mlCTAB提取液，然后將其置于65"水浴鍋中預(yù)熱。
(4) 取上述干燥后的菌體0.03g，用液氮研磨迅速研磨成粉。
(5) 將凍粉迅速轉(zhuǎn)入提取液中，盡快用移液槍混勻，在65。C水浴30min，期間輕 輕搖動幾次(防止DNA斷裂)。
(6) 取出離心管，冷至室溫，每管加入等體積氯仿/異戊醇(24: 1)，輕輕顛倒 混勻，靜止10min， 10000rpm、離心10min。
(7)吸取上清夜于另一新離心管中，加入2/3體積的異丙醇，輕緩顛倒混勻，室溫放置15min，然后10000rpm、離心10min去上清。
(8) 分別用70%、 80%酒精洗滌沉淀，將沉淀吹干。
(9) 力口100plTE緩沖液回溶DNA沉淀(不要反復(fù)吸打，用手指輕彈)，同時加入終 濃度50nl/mgRNase，置37。C處理lh。
(10) 加入等體積的氯仿/異戊醇(24: 1)抽提l-3次。
(11) 吸取上清，加入l/10體積0.3mol/l的NaAc和2倍體積的無水乙醇，-20°。放置111 左右，12000rpm 、離心10min除去上清夜。
(12) 用70%乙醇洗滌沉淀2-3次，自然干燥后，溶于30pl去離子水中形成DNA提取液。
13)抽取2111進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度，結(jié)果如圖3所示。
2、 引物設(shè)計
根據(jù)GenBank己發(fā)表的黑曲霉半纖維素酶基因XYNB (GenBank的登錄號為 DQ174549)、 XLND (GenBank的登錄號為AF108944)、 DNA序列，應(yīng)用PrimerPremier5.0 引物設(shè)計軟件分別設(shè)計一對特異性引物，為了便于定向克隆和載體構(gòu)建，在上游引物 和下游引物的5'端分別加入限制性內(nèi)切酶位點和保護(hù)堿基(畫線部分為加入的酶切位 點)
XYNB上游引物5'-CTA CTC GAGATG CTC ACC AAG AAC CT-3， (XhoI)
下游引物5'陽GG GTC GAC TTA CTG AAC AGT GAT GGA G-3'
(Sail)
XLND上游引物5'-TT GGA TCC ATG GCG CAC TCA ATG TCT CGT-3， (BanHI)
下游弓l物5'-TTT GCG GCC GC CTA CTC CTT CCC AGG CCA CTT-3'
(Notl)
3、 黑曲霉半纖維素酶基因的PCR擴(kuò)增以黑曲霉基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增黑曲霉半纖維素酶基因的DNA片段， PCR擴(kuò)整的反應(yīng)體系使用大連寶生物公司的LA Taq酶(含GC buffer)。
1) XYNB:
反應(yīng)體系25 U 1
2XGCbufferl (5mMMg2+ Plus) 12.5 yl
dNTP Mixture (各2.5m M) 4 iU
Upper primer (50 pmol/L) 0.5 n 1
Lower primer (50 pmol/L) 0.5 y 1
Template (70ng/ u 1) 1 "
LA-Taq酶(5u/ y 1) 0.3 n 1
滅菌ddH20 up to 25 y 1
反應(yīng)條件-
94。C預(yù)變性5min
94。C變性35sec
53.4。C退火35sec - 30cycles
72。C延伸lmin _
72t:延伸8min
2) XLND
反應(yīng)體系25ul
2 XGC buffer I (5mMMg2+ Plus) 12.5^L dNTP Mixture (10mmol/L) 4pL Upper primer (50 pmol/L) 1 Lower primer (50 pmol/L) 1 |oL
Template (70ng/ y 1) 1 P 1
LA-Taq酶(5u/iU) 0.3pL35cycles
滅菌ddH20 up to 25 u 1
反應(yīng)條件 94。C預(yù)變性5min
94°C變性55sec
58。C退火55sec
72°C延伸lmin20sec 72。C延伸10min
PCR反應(yīng)結(jié)束后，全量反應(yīng)液進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果如圖 4a、 4b所示圖4a為XYNB基因電泳檢測圖(泳道1為PCR產(chǎn)物，泳道2為DNA分子量 標(biāo)準(zhǔn))泳道l在745bp處有一條清晰條帶，圖4b為XLND基因電泳檢測圖(泳道1為DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為PCR產(chǎn)物)泳道2在2508bp處有一條清晰條帶。
4、 重組克隆載體pMD18-T-XYNB、 pMD18-T-XLND的構(gòu)建
PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，采用V-gene公司的DNA Gel Extraction Kit回 收目的片斷。將回收的目的片段分別克隆到pMD18-T Vector,進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。在 Eppendor滑內(nèi)配制10ul反應(yīng)體系，混勻16'C反應(yīng)16h。反應(yīng)液直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a 感受態(tài)細(xì)胞，用含50mg/mlAmp+的LB抗性平板37'C培養(yǎng)過夜進(jìn)行篩選。
5、 分別對三個基因的陽性菌落進(jìn)行鑒定
1) 重組克隆載體質(zhì)粒DNA的提取
對于每一個連接，挑取在上述抗生素平板上長出的單菌落接于5ml含50mg/ml Amp +的液體1^培養(yǎng)基中，190rpm， 37t:過夜培養(yǎng)。次日，取400iU菌液于1.5mlL離心觀 管中，加80。/o甘油存于-80。C冰箱。其余菌液用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。
2) 重組克隆載體質(zhì)粒DNA的PCR和酶切檢測
以重組質(zhì)粒DNA為模板，分別PCR擴(kuò)增半纖維素酶基因，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同 上；同時對重組質(zhì)粒DNA做限制性內(nèi)切酶雙酶切(XYNB: XhoI和SalI XLND: BanHI和NotI)， 酶切體系20ul，混合液置于37^反應(yīng)311。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR和酶切產(chǎn)物進(jìn)行1% Agarose凝膠電泳，觀察片段的位置和大小。結(jié)果如圖5a、 5b所示圖5a 為XYNB基因電泳檢測圖(泳道l為酶切產(chǎn)物，泳道2為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道3為20ul PCR產(chǎn)物)泳道l在2700bp和745bp處各有一條清晰條帶，泳道3在745bp處有一條清晰 條帶，圖5b為XLND基因電泳檢測圖(泳道1為PCR產(chǎn)物，泳道2為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳 道3為酶切產(chǎn)物)泳道l在2508bp處有一條清晰條帶，泳道3在2700bp和2508bp處各有一 條清晰條帶，兩個基因的電泳結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，初步證明重組克隆載體構(gòu)建成 功。
將PCR和酶切鑒定都正確的重組克隆載體分別命名為pMD18-T- XYNB、 PMD18-T- XLND，然后將保存的菌液送去測序，測序由北京三博遠(yuǎn)公司完成。XYNB 測序結(jié)果與GenebankDQ174549黑曲霉XYNB基因同源性達(dá)100冗，XLND與Genebank AF108944黑曲霉XLND基因同源性達(dá)967。，表明所克隆的兩個半纖維素酶基因都正確， 達(dá)到預(yù)期目的。
實施例2、半纖維素酶基因重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
含有目的基因的重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體pESPUC- XYNB、 pESPUC- XLND的 構(gòu)建過程如圖2a、 2b所示,具體步驟如下
1、 重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體pESPUC-XYNB、 pESPUC-XLND的構(gòu)建 堿裂解法大量提取重組克隆載體pMD18-T- XYNB、 pMD18-T- XLND和表達(dá)載體
pESPUC(本實驗室保存)質(zhì)粒DNA，然后分別雙酶切重組克隆載體 !^018-^ XYNB、 pMD18-T- XLND和粟酒裂殖酵母表達(dá)載體pESPUC。酶切體系20u 1， pMD18-T- XYNB 和pESPUC用限制內(nèi)切酶XhoI和SalI雙酶切，pMDl8-T-XLND和pESPUC用限制內(nèi)切酶 BamHI和 Notl雙酶切，37'C酶切3h。反應(yīng)結(jié)束后，全量反應(yīng)液于1%的瓊脂糖凝膠電 泳，分別回收DNA。最后分別用T4DNA連接酶連接目的片段和載體，反應(yīng)體系10ul， 混勻，16'C反應(yīng)16h。反應(yīng)液直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，用含5011^/1111八1^+ 的LB抗性平板37'C培養(yǎng)過夜進(jìn)行篩選。
2、 重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體的鑒定1) 重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體質(zhì)粒DNA的提取
對于每一個連接，挑取在上述抗生素平板上長出的單菌落接于5ml含50mg/ml Amp +的液體!^培養(yǎng)基中，190rpm,37。C過夜培養(yǎng)。次日，取400 U l菌液于1.5mlL離心觀管 中，加80。/c甘油存于-8(TC冰箱。其余菌液用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。
2) 重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體PCR和酶切鑒定
以重組表達(dá)載體質(zhì)粒DNA為模板，分別對重組表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增和限制 性內(nèi)切酶雙酶切，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同重組克隆質(zhì)粒的PCR檢測和酶切檢測。反應(yīng) 結(jié)束后，對PCR和酶切產(chǎn)物進(jìn)行iy。 Agarose凝膠電泳，觀察片段的位置和大小。結(jié)果 如圖6a、 6b所示圖6a為XYNB基因電泳檢測圖(泳道l為酶切產(chǎn)物，泳道2為空載體 PCR產(chǎn)物，泳道3為重組表達(dá)載體PCR產(chǎn)物，泳道4為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))泳道l在8900bp 和745bp處各有一條清晰條帶，泳道2在745bp處沒有條帶，泳道3在745bp處有一條清晰 條帶；圖6b為XLND基因電泳檢測圖(泳道1為重組表達(dá)載體PCR產(chǎn)物，泳道2為重組表 達(dá)載體質(zhì)粒，泳道3為酶切產(chǎn)物，泳道4為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))泳道l在2508bp處有一條清 晰條帶，泳道3在8900bp和2508bp處各有一條清晰條帶;兩個基因的電泳結(jié)果與預(yù)期結(jié)果 相符，證明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功,將PCR和酶切鑒定都正確的為陽性菌種命名為 pESPUC-XYNB、 pESPUC-XLND。
實施例3、重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化及鑒定
1 、堿裂解法大量提取重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體pESPUC-XYNB、 pESPUC-XLND的質(zhì)粒DN A
2、電穿孔轉(zhuǎn)化法
宿主菌SP-Q01
YCD培養(yǎng)基酵母浸粉10g,葡萄糖20g,水解酪蛋白2g,山梨醇218.6g溶于1L蒸餾水
中
1.2M山梨醇218.604g山梨醇溶于lL蒸熘水中。 EMM培養(yǎng)基(L):鄰苯二甲酸氫鈉 14.7mM Na2HP04 15.5mM NH4C1 93.5mM 葡萄糖 lllmM
Salts2%(v/v)50XstockVitamins 0.l%(v/v) 1000 X stock
Minerals 0.0l%(v/v) 10000 X stock
Salts (50 X stock) (L)
MgCl2' 6H200.26MCaCl2* 2H204,99mM
KC10.67MNa2S0414.1mM
Vitamins (1000X stock)
泛酸4.20mM煙酸81.2mM
肌醇55.5mM生物素40.8Um
Minerals (10000Xstock)a)
硼酸80.9mMMnS0423.7mM
ZnS04 7H2013.9mMFeCl3* 6H207.40mM
鉬酸2.47 mMKI6.02mM
CuS04 5H201.60mM檸檬酸47.6mM
1)酵母感受態(tài)細(xì)胞的準(zhǔn)備
(1) 將酵母單菌落過夜培養(yǎng)于10mlYCD液體培養(yǎng)基中3(TC， 140rpm。
(2) 次日將10ml菌液轉(zhuǎn)入500mlYCD培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，30°C、 250rpm至濃度為lX 1()7細(xì)胞/ml, OD6oo=0.7。
(3) 將細(xì)胞放到冰浴上15min,使其停止生長。
(4) 輕輕將細(xì)胞倒入兩個滅過菌的250ml離心管中，4。C、 3000rpm、離心15min，
收集菌體。
(5) 棄上清，將收集細(xì)胞的離心管置于冰上。
(6) 每管加入50ml滅過菌的冰上預(yù)冷的1.2M山梨醇懸浮細(xì)胞沉淀，加山梨醇至 250ml， 4°C、 3000rpm、離心5min，收集菌體，棄上清。(7) 重復(fù)步驟6。
(8) 加入20ml滅過菌的冰上預(yù)冷的1.2M山梨醇懸浮沉淀,每管分裝200u 1，將細(xì)胞放 到冰上,盡可能快的電擊。
2)用BIO-RADMicroPluser進(jìn)行電擊。
(1) 將預(yù)轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA(約l(ig)加入到200u l感受態(tài)細(xì)胞中，混均。
(2) 將MicroPluser設(shè)為"ShS"。
(3) 將DNA細(xì)胞樣品轉(zhuǎn)入0.2cm已預(yù)冷的電擊杯中，輕輕敲打管底懸浮液，1.5kv、 25pF、 200Q、 4.48ms電擊一次。
(4) 將杯拿出，加入冰冷的1.2M山梨醇0.8ml,然后將稀釋的細(xì)胞轉(zhuǎn)入到滅菌的離心 管中。
(5) 室溫下，將離心管室溫放置40-60min，使電擊細(xì)胞在1.2M山梨醇的微量培養(yǎng)基 中培養(yǎng)生長。
(6) 將液體平鋪于EMM-thiamine篩選培養(yǎng)基平板上，3(TC培養(yǎng)4 6天，直到長出單 菌落。
結(jié)果如圖7a、 7b所示圖7a為pESPUC-XYNB篩選出的酵母轉(zhuǎn)化子， 圖7b為 pESPUC-XLND篩選出的酵母轉(zhuǎn)化子。
3、重組粟酒裂殖酵母轉(zhuǎn)化子的分子鑒定
1) 挑取EMM-thiamine篩選培養(yǎng)基平板上的單菌落于EMM-thiamine液體培養(yǎng)基 中，30'C培養(yǎng)2天，使用試劑盒提取酵母質(zhì)粒，將質(zhì)粒DNA儲存于-20'C冰箱。
2) 重組粟酒裂殖酵母轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA的PCR鑒定
將上述提取的質(zhì)粒DNA做PCR鑒定。反應(yīng)條件和反應(yīng)體系同重組克隆載體質(zhì)粒 DNA的PCR檢測。將PCR產(chǎn)物在P/。的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析,觀察片段的位置和大 小。結(jié)果如圖10a、 10b所示圖8a為XYNB基因電泳檢測圖(泳道1為DNA分子量標(biāo) 準(zhǔn)，泳道2、為PCR產(chǎn)物)泳道2在745bp處有一條清晰條帶，圖8b為XLND基因電泳檢 測圖(泳道1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為PCR產(chǎn)物)泳道2在2508bp處有一條清晰條帶，兩個基因的電泳結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，證明得到重組菌株。將鑒定正確的陽性菌 株命名為SP-Q01/pESPUC-XYNB禾口SP-Q01/pESPUC-XLND 。
實施例4、半纖維素酶基因在粟酒裂殖酵母中表達(dá)的檢測 1、目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
YES培養(yǎng)基酵母浸粉Q.5%(w/v) 葡萄糖3.0%(w/v) 腺嘌呤，組氨酸，亮氨酸， 尿嘧啶，賴氨酸，氫氧化物50-250 mg/1
PBS緩沖液(100ml) : NaCl 0.82g KC1 0.02g
Na2HP04 0.36g KH2P04 0.025g
ESB緩沖液(可在4'C貯存數(shù)天)
80 mmol/L Tris陽HCl (pH 6.8) 10%甘油 2% SDS 1.5% 二硫基蘇糖醇(DTT) O.lmg/ml溴酚藍(lán)
1) 酵母細(xì)胞培養(yǎng)的準(zhǔn)備
(1) 將含有重組質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化子細(xì)胞及含有空載體的酵母轉(zhuǎn)化子細(xì)胞接種到5mL YES培養(yǎng)基中30。C、 250rpm過夜培養(yǎng)。
(2) 接種約lmL過夜酵母細(xì)胞于1 OmL YES培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),直到006()()=0.2-0.4。
(3) 30°C 、 250rpm繼續(xù)培養(yǎng)約5小時,使OD6ocr0.7-1.0。
(4) 將10mL的細(xì)胞分裝入兩個50mL的離心管中，每個5mL。用"未誘導(dǎo)"標(biāo)志一 試管,另一試管標(biāo)志"誘導(dǎo)"。
(5) 室溫、1000rpm、離心5min，收集酵母細(xì)胞沉淀。
(6) 棄上清，每管中加入50mL的去離子水洗滌酵母細(xì)胞沉淀，室溫、1000rpm、離 心5min，棄上清。
(7) 重復(fù)一次步驟F。
2) GST蛋白的誘導(dǎo)步驟
(1)將酵母細(xì)胞沉淀分別培養(yǎng)于10mL EMM培養(yǎng)基中，加10nL的5mM抽濾的硫銨 (VB1)于標(biāo)記"未誘導(dǎo)"的試管中30。C 、 250rpm培養(yǎng)酵母細(xì)胞18-20個小時。(2) 為判斷重組蛋白誘導(dǎo)是否成功，分別吸移lmL的菌液于1.5mL離心管中，4°C、 1000rpm離心5min，收集酵母細(xì)胞沉淀。
(3) 棄上清，保存酵母細(xì)胞沉淀于-80。C，在下一步的SDS-PAGE驗證中使用。 3)酵母蛋白的提取
(1) 向GST蛋白的誘導(dǎo)步驟3中得到的酵母細(xì)胞沉淀中加入5OmM Tris-HCL (PH7.5)和10mM疊氮化鈉溶液懸浮沉淀。
(2) 4。C、 1000rpm、離心5min收集沉淀細(xì)胞。
(3) 棄上清，用30uLESB緩沖液懸浮細(xì)胞。
(4) 10(TC保溫3min，使蛋白酶失活之后，將樣品存放于-20。C。
(5) 加入0.3g直徑0.2mm的玻璃珠，劇烈振蕩混合2min。
(6) 加入150uLESB緩沖液，稍加振蕩，置10(TC保溫lmin。
(7) 取5-20n L抽提液上樣進(jìn)行SDS凝膠電泳。
3、 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析
將上述所提蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,結(jié)果如圖9所示(泳道l為空載轉(zhuǎn)化子，泳道2為 XYNB轉(zhuǎn)化子,泳道3為XLND轉(zhuǎn)化子，泳道4為Marker)在約24KD和93KD處有特異蛋白 帶，與己知的理論分子量一致，說明半纖維素酶基因在粟酒裂殖酵母中得到表達(dá)。
4、 DNS法(3， 5—二硝基水楊酸比色定糖法)測定重組酵母轉(zhuǎn)化子 SP-QO/pESPUC-XYNB酶活
先將生長在EMM+VBl固體培養(yǎng)基上的重組酵母轉(zhuǎn)化子SP-Q01/pESPUC-XYNB和 SP-Q01/ pESPUC分別接種于5mL EMM液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，當(dāng)重組酵母達(dá)到對數(shù) 生長期時(OD6(W=0.7-0.8),分別接入50mL的EMM液體培養(yǎng)基中，重組酵母經(jīng)擴(kuò)大誘 導(dǎo)培養(yǎng)12小時后，進(jìn)行半纖維素酶酶活測定，其中SP-Q01/ pESPUC為對照。取培養(yǎng)后 的菌液1.5mL，離心后取lmL的上清液，采用DNS法在550nm下測定重組 SP-Q01/pESPUC-XYNB酶活，XYNB以水楊苷為底物。
l)酶活的定義5(TC時每小時產(chǎn)生1微克分子木糖的酶量為一個酶活力單位。 2)酶活的計算
樣品木糖量(mg) —對照木糖量(mg) U/ml= X 10:'
12(h) XI (ml)
結(jié)果如圖10a所示，測定了培養(yǎng)0-96h的重組半纖維素酶酶活，重組酵母轉(zhuǎn)化子在不 同培養(yǎng)時間內(nèi)均有酶活性，目的基因表達(dá)最高水平出現(xiàn)在36-96h， SP-Q01/pESPUC-XYNB在培養(yǎng)0-60h間酶活逐漸升高，在培養(yǎng)60h達(dá)到最高，為 155U/mL，從60h到96h酶活逐漸降低，說明黑曲霉半纖維素酶酶基因前部的信號肽能 夠被粟酒裂殖酵母正確的識別，并借助自身的信號肽序列將絕大部分表達(dá)產(chǎn)物分泌到 胞外培養(yǎng)液中，并且重組酶在20 — 8(TC均有酶活力，最適溫度分別為XYNB 50°C。
5重組酵母轉(zhuǎn)化子SP-Q01/pESPUC-XLND酶活測定
先將生長在EMM+VBl固體培養(yǎng)基上的重組酵母轉(zhuǎn)化子SP-Q01/pESPUC-XLND和 SP-Q01/ pESPUC分別接種于5mL EMM液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，當(dāng)重組酵母達(dá)到對數(shù) 生長期時(OD6W)=0.7-0.8)，分別接入50mL的EMM液體培養(yǎng)基中，重組酵母經(jīng)擴(kuò)大誘 導(dǎo)培養(yǎng)12小時后，進(jìn)行半纖維素酶酶活測定，其中SP-Q01/pESPUC為對照。取培養(yǎng)后 的菌液lmL，離心后取0.5mL的上清液，P-木糖苷酶活性是由從底物對硝基苯酚-0-D-木糖苷(p-m'"o;7/^wj^-Z)-;^/opyramw/cfe，;W尸^^釋放出對硝基苯酚的量來確定的，采 用分光光度法在410nm下測定。
1) 酶活定義
70°C， lmin內(nèi)催化產(chǎn)生lumol的對硝基苯酚所需要的酶量。
2) 酶活的計算樣品對硝基苯酚量(mg) —對照對硝基苯酚量(mg)
木糖苷酶活力-(IU/ml)
30 minx0,139 (mg/umol)x0.5 mL
結(jié)果如圖10b所示，測定了培養(yǎng)0-96h的重組半纖維素酶酶活，重組酵母轉(zhuǎn)化子在
不同培養(yǎng)時間內(nèi)均有酶活性，目的基因表達(dá)最高水平出現(xiàn)在36-96h，
SP-Q01/SP-Q01/pESPUC-XLND在培養(yǎng)0-72h間酶活逐漸升高，在培養(yǎng)72h達(dá)到最高為
86U/mL，從72h到96h酶活逐漸降低，說明黑曲霉半纖維素酶酶基因前部的信號肽能夠
被粟酒裂殖酵母正確的識別，并借助自身的信號肽序列將絕大部分表達(dá)產(chǎn)物分泌到胞
外培養(yǎng)液中，并且重組酶在30—9(TC均有酶活力，最適溫度分別為XLND65'C。序列表
〈110〉吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
〈120〉 一種具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其構(gòu)建方法 〈130〉 wangpiwu200701-03 <160> 2
<170〉 Patentln version 3.2
<210> 1
〈211〉 745
〈212〉 ■
〈213〉黑曲霉
<400〉 1
1 atgctcacca agaaccttct cctctgcttc gccgcagcta aggctgttct ggccgttccc 61 cacgactctg tcgtcgagcg ttcggatgcc ttgcacaagc tctctgagcg ttcgaccccg
121 agctcgaccg
181 gtgacctaca
241 tttgttggtg
301 gtccctctag
361 cggcaccttc
421 cctgatcgag
481 gtacaagggc
541 caacgccgct
601 caagagagtt
661 catgaacctg
721 stcttcctcc
gcgag^caa ccaacggtga ga卿ggctg ggtattcagt acccctagcg tactacatcg accgtcacct tctatccaag ggaggaactg ggtactcaca atcactgttc
cggcttctac cgctggctcg gaaccctgga ga犯caaatg gcaacggcta tcgagtccta ccgatggatc gaaccgctac ttaccacttc actaccagat
tactccttct tacaccgtcg agtgcgcagt ctcacataac cctctccgtc cggcgactac cgtctacgat cttcacccag caaccacttc tgtggctacc
gg織gacgg agtggtccaa aagttaacct ttcagggaca tatggctgga aaccccggca atctacacgg tactggtccg 犯cgcttggg gagggctacc
cggtggtgat cgttggcaac ctcccaagct tcacctacag ccactgaccc gtgg鄉(xiāng)cac ctacccgcac ttcgccagaa ctaagctggg agagcagcgg
〈210〉 2 〈211〉 2508 〈212〉 mRNA 〈213〉黑曲霉 〈400〉 2
1 atcgatcaac catggcgcac tcaatgtctc gtcccgtggc tgccactgcc gctgctctgt 61 tggctctggc tcttccccaa gctcttgccc aggccaacac cagctatgtc gattacaacg
121 tcgaggccaa ccctgacttg taccctttgt
181 actgccagaa tggccccctg cgcagccacc
241 accgagcagc atcgctcatc tcgctcttca
301 acaccggcct cggtgtctcc cgactgggcc
361 ttcacggcct cgaccgtgcc aacttcagcg
421 tcccccaacc tatcttgacc accgcggccc
481 ccatcatctc cacccaaggc cgtgccttca
541 acgcccccaa catcaacacc ttccgccacc
601 gagaggacgt ctctctcgcc gccgtctacg
gcatagaaac catcccactg agcttccccg tcatctgcga cgaatcagcc accccctatg cgctggacga gctgatcgcc aacaccggca tccctgcata ccaagtatgg agtgaagcac actcaggctc ctacaattgg gctacttcat tcaaccgcac cctcattcac caaatcgcct acaacgccgg ccgctacggc ctcgatgtct ccgtctgggg tcgcggacaa gaaactccag cctacgaata catcaccggc atccagggtc<formula>formula see original document page 22</formula>
權(quán)利要求
1、一種具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，是將構(gòu)建的含有半纖維素酶基因的重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體導(dǎo)入粟酒裂殖酵母中得到的。
2、 如權(quán)利要求l所述的具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征 是將半纖維素酶基因插入到粟酒裂殖酵母表達(dá)載體的多克隆位點處，將構(gòu)建的重組粟酒裂殖 酵母表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入粟酒裂殖酵母中，獲得重組粟酒裂殖酵母轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)重組粟酒裂殖酵母 使半纖維素酶基因得到分泌表達(dá)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，其特征在于重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體含有Pnmtl啟動子、半纖維素酶基因、P咖tl終止子序列、以及篩選標(biāo)志。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，其特征在于重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體含有半纖維素酶基因為內(nèi)切木聚糖酶基因XYNB，其序列如SEQ ID NO.l所述和木糖苷酶基因XLND，其序列如SEQ ID N0.2所述。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，其特征在于內(nèi)切 木聚糖酶XYNB基因位于粟酒裂殖酵母表達(dá)載體pESPLIC的多克隆位點處的XhoI和SalI限制性內(nèi) 切酶酶切位點之間，構(gòu)建的重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體為pESPUC-XYNB，獲得的重組粟酒裂 殖酵母工程菌為SP-Q01/pESPUC-XYNB,所述半纖維素酶XLND基因位于粟酒裂殖酵母表達(dá)載體 pESPUC的多克隆位點處的BamHI和Notl限制性酶酶內(nèi)切位點之間，構(gòu)建的重組粟酒裂殖酵母表 達(dá)載體為pESPUC-XLND，獲得的重組粟酒裂殖酵母菌株為SP-Q01/pESPUC-XLND。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌，其特征在于篩 選標(biāo)志一種為氨芐青霉素抗性基因(ampicillin resistance Amp，，其允許在大腸桿菌 (E.coli)克隆時進(jìn)行載體的復(fù)制和抗生素選擇；另一種為選擇標(biāo)記基因LEU2-d，源自釀酒酵 母(Saccharomy cescerevisiea)可以作為向粟酒裂殖酵母(S. pombe)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化表達(dá)結(jié)構(gòu)的 選擇標(biāo)定物亮氨酸。
7、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特 征在于半纖維素酶基因的表達(dá)是將構(gòu)建的含有半纖維素酶基因的重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載 體的質(zhì)粒DNA，采用電穿孔法導(dǎo)入粟酒裂殖酵母SP-Q01中，獲得重組粟酒裂殖酵母轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)重組粟酒裂殖酵母轉(zhuǎn)化子使半纖維素酶基因得到分泌表達(dá)。
8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特 征在于重組粟酒裂殖酵母在表達(dá)半纖維素酶基因無須加入誘導(dǎo)物，半纖維素酶基因前端自 帶的信號肽序列可使半纖維素酶基因獲得分泌表達(dá)，表達(dá)時間為2 6天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有半纖維素酶活性的粟酒裂殖酵母工程菌及其構(gòu)建方法。是將是將構(gòu)建的含有半纖維素酶基因的重組粟酒裂殖酵母表達(dá)載體導(dǎo)入粟酒裂殖酵母中得到的；構(gòu)建方法是構(gòu)建含有半纖維素酶基因的粟酒裂殖酵母表達(dá)載體，將其導(dǎo)入粟酒裂殖酵母中獲得重組酵母轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)重組酵母使半纖維素酶酶基因得到分泌表達(dá)。本發(fā)明彌補(bǔ)了傳統(tǒng)半纖維素酶制備方法以及原核表達(dá)系統(tǒng)、其他酵母表達(dá)系統(tǒng)的不足。應(yīng)用于工業(yè)化半纖維素酶的生產(chǎn)，則具有酶活性高，熱穩(wěn)定性強(qiáng)，生長周期短，提取成本低的優(yōu)點。
文檔編號C12R1/85GK101412973SQ20081005151
公開日2009年4月22日 申請日期2008年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月3日
發(fā)明者付永平, 靜 曲, 李曉婷, 王丕武 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)