專利名稱：：利用高保真dna聚合酶介導(dǎo)的替換性引物延伸反應(yīng)進(jìn)行序列分析的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種DNA序列分析方法，特別是涉及一種利用高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的替換性引物延伸反應(yīng)進(jìn)行序列分析的方法。
背景技術(shù)：
：基因組測(cè)序是當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)非常重要的工作。自1990年人類基因組計(jì)劃(HGP)啟動(dòng)至2001年基本完成，基因組研究有了飛速地發(fā)展。為揭示基因功能，開發(fā)個(gè)性化藥物和明確生物物種間的進(jìn)化關(guān)系以及不同生物體生命活動(dòng)的異同，需要對(duì)更多的基因組進(jìn)行測(cè)序。從這個(gè)意義上說，基因組測(cè)序僅僅是后基因組時(shí)代的開始?；蚪M研究的發(fā)展需要新一代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)。最近，美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)提供"革命性基因組測(cè)序技術(shù)"(RevolutionaryGenomeSequencingTechnologies)項(xiàng)目的基金，向生物科技發(fā)起了新的挑戰(zhàn)計(jì)劃到2009年，達(dá)到每測(cè)定一個(gè)人的全基因組序列只花費(fèi)10萬美元的目標(biāo)，而到2014年，費(fèi)用將降為1000美元。"1000美元基因組"所含的意思是，承諾DNA測(cè)序?qū)⒈阋说絺€(gè)人足以負(fù)擔(dān)得起，并使人們認(rèn)為這種能把自己的基因組序列存盤供醫(yī)生參考的一生一次的支出是值得的。此外，廉價(jià)測(cè)序技術(shù)能擴(kuò)大基因組的研究者隊(duì)伍，供給研究人員更多的基因組以便于對(duì)照了解病人和健康者之間的個(gè)體差異，從而使基因序列信息更有價(jià)值。目前，所有這些應(yīng)用的障礙在于基因圖高昂的制作成本及有效的準(zhǔn)確度。有關(guān)技術(shù)進(jìn)展Sanger測(cè)序方法的衍生這類方法通過熒光標(biāo)記雙脫氧核苷酸，延用雙脫氧的鏈末端中止法原理，聯(lián)合毛細(xì)管電泳分離技術(shù)獲得基因組信息。該方法自發(fā)明以來，一直具有準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)。盡管這種方法對(duì)完善人類基因組測(cè)序做出了貢獻(xiàn)，但由于其所用材料昂貴、檢測(cè)費(fèi)時(shí)，限制了將其運(yùn)用在1000美元測(cè)序的計(jì)劃中(1,2)。雜交測(cè)序(Sequencingbyhybridization):以雜交原理為基礎(chǔ)的代表技術(shù)即為基因芯片技術(shù)，基因芯片同樣具有潛在的突變檢測(cè)能力。該項(xiàng)技術(shù)依賴于大量的特定探針與標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)配對(duì)與否的雜交信號(hào)強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中耙分子的數(shù)量。正是由于這種單點(diǎn)陣的識(shí)別，阻礙了其在高通量基因測(cè)序中的運(yùn)用。歸結(jié)原因，其一，對(duì)于完成人類長(zhǎng)達(dá)30億對(duì)堿基的基因組測(cè)序來說，基因芯片需要大量天文數(shù)量的探針；其二，基因芯片對(duì)于具有高度重復(fù)序列的樣品是難以測(cè)定的(3,4)。DNA合成法測(cè)序(Sequencingbysynthesis):通過模仿DNA分子復(fù)制過程，用帶標(biāo)記的dNTP代替ddNTP加入到新互補(bǔ)鏈中，來完成信號(hào)的檢測(cè)。近來有報(bào)道，一種基于合成法，運(yùn)用顯微鏡分離檢測(cè)不同標(biāo)記的dNTPs的技術(shù)平臺(tái)被應(yīng)用于芯片中(5)。而聚合酶克隆已成功運(yùn)用在細(xì)菌基因組的再測(cè)序中(6)。另外有新的嘗試將聚合酶克隆交聯(lián)于浸沒在乳液狀中的株?duì)钗⒘Ｉ希跀U(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，每一個(gè)微粒都會(huì)攜帶目的DNA分子的許多拷貝進(jìn)而同時(shí)進(jìn)行測(cè)序(7,8)。若能有機(jī)的結(jié)合這些技術(shù)，將能使基因測(cè)序費(fèi)用大幅度降低成為可能。物理化學(xué)化方法目前，一種新的被稱作納米測(cè)序的方法正在興起，以4種堿基間的物理性質(zhì)差別為基礎(chǔ)，將這種差別轉(zhuǎn)變成為可以檢測(cè)的信號(hào)，從而進(jìn)行測(cè)序。理論上是可以根據(jù)每一種堿基的化學(xué)質(zhì)量、大小、化學(xué)鍵和所帶電荷來識(shí)別單堿基的類型。但該方法可能存在的弊端是，相對(duì)于全基因組來說，其目的單鏈DNA的制備會(huì)比較困難(9，10)。從醫(yī)學(xué)角度看，我們也許不需要測(cè)定出全部基因組中的30億對(duì)堿基的序列，而只需集中在占人類基因組中10%的編碼區(qū)域，即可獲得足夠的生物醫(yī)學(xué)相關(guān)信息?；谶@種考慮，在不久的將來，人們即能在出生時(shí)即獲得個(gè)人的基因組編碼信息而受益一生。就技術(shù)可行性而言，我們認(rèn)為生物芯片的推廣將會(huì)使1000美金測(cè)序計(jì)劃變成現(xiàn)實(shí)。根據(jù)制造集成芯片中的墨菲定律，芯片的密度必將增加到一定水平。當(dāng)一塊基片可以制備為包含了10萬到30萬陣列，而每個(gè)位點(diǎn)能識(shí)別IOOO個(gè)核苷酸，屆時(shí)，IOOO美元測(cè)出全基因序列的計(jì)劃將不會(huì)是夢(mèng)想。當(dāng)然，目前有關(guān)IOOO美金測(cè)序計(jì)劃的研究并沒有觸及到核心問題或者說還沒有找到合適的相關(guān)方法。即便在芯片這個(gè)平臺(tái)中，單堿基延伸法可以完成木部分基因組序列的測(cè)定，但離1000美金測(cè)序的目標(biāo)還很遠(yuǎn)，且無法測(cè)定簡(jiǎn)單重復(fù)序列。據(jù)認(rèn)為測(cè)序技術(shù)上的瓶頸在于使用了"基因擴(kuò)增"的方式來進(jìn)行"讀取DNA"序列，若能繞開"基因擴(kuò)增"的方式讀取"DNA序列"的方法，即可使縮短時(shí)間和減少成本成為可能(ll)。為了加速1000美金測(cè)序計(jì)劃的研究進(jìn)展，2006年10月4日美國(guó)X獎(jiǎng)勵(lì)基因會(huì)設(shè)立了總額為1000萬美金的獎(jiǎng)項(xiàng)，以獎(jiǎng)勵(lì)最終完成此目標(biāo)的研究團(tuán)隊(duì)(12)。1000美金測(cè)序計(jì)劃的研究將推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)的快速發(fā)展和個(gè)體化醫(yī)學(xué)的全面推行。1000美金測(cè)序計(jì)劃的關(guān)鍵技術(shù)，包括高通量與每一被測(cè)序列的長(zhǎng)度達(dá)到上百個(gè)甚至上千個(gè)堿基，基于目前芯片制造技術(shù)已達(dá)到每芯片含100萬個(gè)短序列的密度。因此，如何使單一被測(cè)定序列得到更多的信息，是1000美金測(cè)序計(jì)劃中有待解決的最為現(xiàn)實(shí)的難題。目前，我們正在嘗試on/off分子開關(guān)與芯片失活/激活技術(shù)相結(jié)合，以期達(dá)到每位點(diǎn)識(shí)別100個(gè)堿基的目標(biāo)。如果目標(biāo)可以實(shí)現(xiàn)，那么1000美金測(cè)全基因組序列計(jì)劃將在未來十年內(nèi)完成，毫無疑問，這將不僅為個(gè)體化治療提供強(qiáng)有力的保證，而且為提高人類生存質(zhì)量提供依據(jù)。而我們提出的基于納米級(jí)分子開關(guān)的測(cè)序方案，除了能對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行基因分型外，每一延伸引物尚可一次性識(shí)別幾個(gè)至十個(gè)核苷酸(13,14)。這種堿基步行法用于測(cè)序，與探針雜交法和連接酶介導(dǎo)的測(cè)序方法在效果上相似，均只能得到較短的序列集合，在應(yīng)用于基因組測(cè)序時(shí)將會(huì)無可避免地存在多個(gè)未知序列。因此，若以on/off分子開關(guān)為基礎(chǔ)，偶聯(lián)兩種不同的引物延伸反應(yīng)即部分性鏈終止和替換延伸反應(yīng)于一個(gè)反應(yīng)體系，將使芯片上的一個(gè)延伸弓I物解碼數(shù)百甚至更長(zhǎng)的堿基序列。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，'提供一種利用高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的替換性引物延伸反應(yīng)進(jìn)行序列分析的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種利用高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的替換性引物延伸反應(yīng)進(jìn)行序列分析的方法，包括如下步驟(1)準(zhǔn)備耐3'-5'核酸外切酶消化的引物并對(duì)這些引物可實(shí)際參與反應(yīng)的三末端自由羥基進(jìn)行定量測(cè)定；(2)以單一種類的熒光標(biāo)記的ddNTP與非熒光標(biāo)記的同一種類dNTP為混合底物，在不具有3'-5'核酸外切酶活性DNA聚合酶催化下，進(jìn)行部分性鏈終止引物延伸反應(yīng)；(3)人工合成的耐3'-5'核酸外切酶消化的dNTP在具有3'-5'核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶催化下進(jìn)行的替換性引物延伸反應(yīng)；(4)偶聯(lián)部分性鏈終止引物延伸反應(yīng)和替換性引物延伸反應(yīng)并重復(fù)使用這一偶聯(lián)過程。所述引物為三末端修飾的引物或三末端未修飾的引物。所述三末端修飾的引物為耐3，-5，核酸外切酶消化的修飾。所述具有3'-5'核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶為Vent高保真DNA聚合酶、DeepVent高保真DNA聚合酶、Pfu高保真DNA聚合酶、Sso7d-PfU高保真DNA聚合酶或Kapa高保真DNA聚合酶。所述不具有3'-5'核酸外切酶活性DNA聚合酶為TaqDNA聚,酶、T7測(cè)序酶、Vent—DNA聚合酶、DeepVenfDNA聚合酶。所述人工合成的耐3'-5'核酸外切酶消化的dNTP為硫化修飾的PS-dNTP、環(huán)化修飾的acy-NTP或鎖核酸。所述熒光標(biāo)記的ddNTP與非熒光標(biāo)記的dNTP的濃度比例在待測(cè)序列中單一堿基的最大連續(xù)重復(fù)程度小于10個(gè)時(shí)為1/3至1/30。所述熒光標(biāo)記的ddNTP與非熒光標(biāo)記的dNTP濃度比例在待測(cè)序列中單一堿基的最大連續(xù)重復(fù)程度小于100個(gè)時(shí)為1/31至1/300。所述熒光標(biāo)記的ddNTP與非熒光標(biāo)記的dNTP濃度比例在待測(cè)序列中單一堿基的最大連續(xù)重復(fù)程度小于1000個(gè)時(shí)為1/301至1/3000。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.本發(fā)明為世界上第一個(gè)偶聯(lián)部分性鏈終止延伸反應(yīng)與替換性引物延伸反應(yīng)用于測(cè)序的，這一設(shè)計(jì)是本發(fā)明可行性和具有高通量的基礎(chǔ)。2.熒光標(biāo)記的ddNTP只被用于中間反應(yīng)過程，當(dāng)信號(hào)(堿基識(shí)別)獲取后，利用高保真DNA聚合酶的3'-5'校正功能清除了新合成鏈中不能延伸的堿基，使其3'端得以活化，可繼續(xù)另一反應(yīng)過程。3.此外，耐3'-5'核酸外切酶消化的dNTP與具有3'-5'核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶結(jié)合所進(jìn)行的替換性引物延伸反應(yīng)，能清除熒光ddNTP，減少背景噪音，并使反應(yīng)同步化。4.該方法采用熒光ddNTP成熟技術(shù)替換目前合成法測(cè)序中使用的熒光dNTP非成熟技術(shù)，結(jié)合替換性引物延伸反應(yīng)使經(jīng)典的鏈終止測(cè)序法與合成測(cè)序法兩種看似不相容的技術(shù)偶聯(lián)到一個(gè)反應(yīng)體系中。5.該方法與多種技術(shù)平臺(tái)相容，特別適宜于基于芯片的序列分析。5圖1為本發(fā)明的方法工作原理示意圖。圖2為本發(fā)明與芯片技術(shù)相容示意圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明方法的關(guān)鍵為對(duì)需要延伸的耐3'-5'核酸外切酶消化的引物進(jìn)行部分失活與重新激活的循環(huán)反應(yīng)。如圖1所示。準(zhǔn)備耐3'-5'核酸外切酶消化的引物并對(duì)這些引物可實(shí)際參與反應(yīng)的三末端自由羥基進(jìn)行定量測(cè)定；(對(duì)三末端自由羥基進(jìn)行定量測(cè)定是指運(yùn)用不具有3'-5'核酸外切酶活性DNA聚合酶介導(dǎo)以熒光標(biāo)記的ddNTP為底物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)和隨后利用3'-5'核酸外切酶切除引物三末端新加上的帶熒光的堿基。)通過對(duì)待延伸引物(耐3'-5'核酸外切酶消化的引物)以單一種類的熒光標(biāo)記的ddNTP與非熒光標(biāo)記的同一種類dNTP為混合底物，在不具有3'-5'核酸外切酶活性DNA聚合酶催化下，進(jìn)行部分性鏈終止引物延伸反應(yīng)，通過ddNTP與dNTP混合底物中的ddNTP連接到新生DNA鏈的3'末端使延伸反應(yīng)終止。(ddNTP為雙脫氧核糖核苷酸)(熒光標(biāo)記的ddNTP與非熒光標(biāo)記的dNTP混合物為ddATP/dATP或ddTTP/dTTP或ddCTP/dCTP或ddGTP/dGTP)該反應(yīng)由測(cè)序酶如T7測(cè)序酶所介導(dǎo)(也可以采用無校正作用的TaqDNA聚合酶或Vent—DNA聚合酶或DeepVenfDNA聚合酶所介導(dǎo))。由于ddNTP與dNTP混合底物中的dNTP并不導(dǎo)致延伸反應(yīng)的終止，因此，根據(jù)待測(cè)序列中單一堿基的連續(xù)重復(fù)程度可調(diào)整ddNTP/dNTP的比例，通常為1/10至1/1000之間當(dāng)待測(cè)序列中單一堿基的最大連續(xù)重復(fù)程度小于10個(gè)時(shí)，這一比例為1/3至1/30;當(dāng)待測(cè)序列中單一堿基的最大連續(xù)重復(fù)程度小于IOO個(gè)時(shí)，這一比例為1/31至1/300;當(dāng)待測(cè)序列中單一堿基的最大連續(xù)重復(fù)程度小于1000個(gè)時(shí)，這一比例為1/301至1/3000。但是，當(dāng)待測(cè)序列中特定區(qū)域的單一堿基的連續(xù)重復(fù)程度大于1000個(gè)時(shí)，本發(fā)明的測(cè)序結(jié)果會(huì)出現(xiàn)誤差。在部分性鏈終止引物延伸反應(yīng)之后，通過多次洗滌去除殘留在反應(yīng)體系中的ddNTP熒光信號(hào)，當(dāng)使用芯片測(cè)序時(shí)，可向芯片加入不含ddNTP和dNTP的一倍濃度PCR反應(yīng)緩沖液，孵育30秒至一分鐘。重復(fù)清洗2-5次。然后通過熒光掃描裝置檢測(cè)待延伸引物上的熒光信號(hào)強(qiáng)度。當(dāng)一種堿基的反應(yīng)完成，清洗完成和檢測(cè)完成之后，新生DNA分子的3'末端處于兩種狀態(tài)，其中一部分三末端含有ddNTP殘基而無可延伸的3'末端自由羥基;另一部分則含有dNTP殘基而擁有可延伸的3'末端羥基。因此，為使新生鏈在使用另一種ddNTP/dNTP混合底物時(shí)具有足夠的數(shù)量且數(shù)量基本恒定的待延伸羥基，并清除和減少另一新堿基檢測(cè)時(shí)的背景熒光信號(hào)，本方法通過引入替換性引物延伸反應(yīng)達(dá)到上述目的。替換性引物延伸反應(yīng)由具有3'-5'核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶催化下進(jìn)行。具有3'-5'核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶可以選用Vent高保真DNA聚合酶(也可以選用DeepVent高保真DNA聚合酶、Pfo高保真DNA聚合酶、Sso7d-Pfii高保真DNA聚合酶或Kapa高保真DNA聚合酶)。在替換性引物延伸反應(yīng)中，不耐3'-5'核酸外切酶消化的ddNTP和dNTP殘基被清除，而耐3'-5'核酸外切酶消化的dNTP則被整合進(jìn)新合成的DNA分子中，這一反應(yīng)的結(jié)果是耐3，-5，核酸外切酶消化的dNTP替換了新生DNA分子三末端不耐3，-5，核酸外切酶消化的ddNTP和dNTP殘基，從而使反應(yīng)體系同步化，激活了那些因ddNTP摻入而失活的三末端。隨著熒光標(biāo)記的ddNTP被消化，反應(yīng)體系中的原有熒光信號(hào)便可用物理的漂洗方式予以清除，漂洗仍使用不含熒光ddNTP的一倍濃度PCR反應(yīng)緩沖液，一般漂洗2-5次，每次30秒至一分鐘。然后，依次進(jìn)行另一種堿基的反應(yīng)。四種堿基的反應(yīng)順序是固定的，可選用其16種排列中的特定一種排列作為程序。上述部分性鏈終止引物延伸反應(yīng)和替換性引物延伸反應(yīng)的不斷循環(huán)，和依次分別對(duì)構(gòu)成DNA的四種組分A、T、C、G進(jìn)行反應(yīng)，通過引物的失活過程獲得待測(cè)定堿基的性質(zhì)和數(shù)量；通過替換性引物延伸反應(yīng)使失活的部分引物得以重新激活，從而使該反應(yīng)能得以循環(huán)進(jìn)行。從信號(hào)獲取的角度，部分性鏈終止為直接解碼或測(cè)序的反應(yīng)過程。這一步與Sanger's測(cè)序原理一致，均可能出現(xiàn)延伸產(chǎn)物所帶熒光顏色的區(qū)別和同一種引物中延伸產(chǎn)物長(zhǎng)度不一。在Sanger's酶法測(cè)序中，不同長(zhǎng)度產(chǎn)物通過電泳進(jìn)行辨認(rèn)，但在芯片測(cè)序反應(yīng)時(shí)，由于延伸反應(yīng)在固相面進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物不可能電泳。在這里，延伸產(chǎn)物的長(zhǎng)度由所檢測(cè)到的熒光信號(hào)的強(qiáng)度所反映。例如，當(dāng)ddNTP/dNTP的比例為1/1000時(shí)，單一種堿基的不同長(zhǎng)度重復(fù)序列的延伸產(chǎn)物的熒光信號(hào)強(qiáng)度在重復(fù)數(shù)小于32時(shí)基本上以1/1000為量子化單位變化(表二)。對(duì)芯片測(cè)序反應(yīng)而言，信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)化可通過兩方面所達(dá)到。首先，如圖2所示，通過對(duì)芯片進(jìn)行以100%熒光標(biāo)記的ddNTP為底物的單堿基延伸反應(yīng)，以獲取飽和或最大熒光強(qiáng)度，作為100%參考值。另外，可通過選取信號(hào)強(qiáng)度相近且頻率出現(xiàn)最高的低信號(hào)作為一個(gè)堿基延伸反應(yīng)的基本量子化信號(hào)的平均值，當(dāng)使用ddNTP/dNTP為1/1000時(shí)，這一基本量子化信號(hào)的平均值接近于飽和式最大熒光強(qiáng)度即100%參考值的1/1000。Sanger's酶法測(cè)序由于要求電泳，無法直接應(yīng)用于芯片測(cè)序。另外，Sanger's酶法測(cè)序可讀長(zhǎng)度一般僅為400-800堿基，后一點(diǎn)是由于末端終止法測(cè)序反應(yīng)過程中可用于延伸反應(yīng)的含3'末端羥基不斷消耗的原因。與Sanger's酶法測(cè)序相比，雖然目前的循環(huán)合成法測(cè)序在理論上具有一定的優(yōu)點(diǎn)，但因引入多種新的化合物，新生鏈的延長(zhǎng)長(zhǎng)度受到極大限制，僅為10-100堿基之間，其實(shí)際應(yīng)用受到限制。有鑒于此，本發(fā)明結(jié)合Sanger's聚合酶介導(dǎo)的末端終止法，使用了ddNTP/dNTP混合底物，應(yīng)用于部分性鏈終止引物延伸反應(yīng)中。同時(shí)，本發(fā)明結(jié)合了鏈合成測(cè)序法對(duì)待測(cè)序列每一種堿基分步進(jìn)行反應(yīng)的原理，通過發(fā)明由耐3'-5'核酸外切酶消化的dNTP與具有3'-5'核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶所介導(dǎo)的替換性引物延伸反應(yīng)，使Sanger's酶法末端終止測(cè)序和鏈合成循環(huán)反應(yīng)測(cè)序這兩種偶聯(lián)為一個(gè)反應(yīng)體系。部分性鏈終止引物延伸反應(yīng)與替換性引物延伸反應(yīng)的不斷循環(huán)，和依次分別對(duì)構(gòu)成DNA的四種組分A、T、C、G進(jìn)行反應(yīng)及循環(huán)，可使新生鏈的長(zhǎng)度達(dá)到及超過Sanger's酶法末端終止測(cè)序。如圖2所顯示，熒光信號(hào)強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)化之一為通過單堿基延伸反應(yīng)所得到測(cè)序微芯片在含四種混合的熒光標(biāo)記ddNTP和待測(cè)模板反應(yīng)液中孵育，使得芯片上每一個(gè)與相應(yīng)模板結(jié)合的引物都延伸一個(gè)堿基，檢測(cè)其信號(hào)強(qiáng)度作為參考當(dāng)量100%。然后，芯片移入含有3'-5'核酸外切酶的反應(yīng)液中孵育，讓芯片回歸初始狀態(tài)，并檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度是否接近于零。這一步用于實(shí)驗(yàn)儀器的校準(zhǔn)，并檢測(cè)了高保真DNA聚合酶的工作效率。單堿基延伸芯片技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用。與普通測(cè)序所用引物不同的是，本發(fā)明應(yīng)用于芯片技術(shù)平臺(tái)時(shí)，其芯片上的引物3'末端須經(jīng)過修飾而具有耐3'-5'核酸外切酶消化的特性。如圖2所舉例，在選定的特定引物點(diǎn)，向芯片加入含ddATP/dATP的混合反應(yīng)液進(jìn)行孵育時(shí)，其中ddATP為綠色熒光標(biāo)記而dATP為非熒光標(biāo)記，若待測(cè)模板在此處序列含兩個(gè)T堿基，新合成的DNA序列則可相應(yīng)延伸兩個(gè)A堿基。部分性鏈終止引物延伸反應(yīng)完成后，向芯片上加入不含ddNTP和dNTP的一倍濃度PCR反應(yīng)緩沖液，重復(fù)清洗2-5次，通過多次洗滌去除殘留在反應(yīng)體系中的背景熒光信號(hào)及多余模板。然后檢測(cè)其信號(hào)強(qiáng)度，以判斷序列當(dāng)前位置腺嘌呤的個(gè)數(shù)。假定芯片該點(diǎn)含有約10000個(gè)引物，需要延伸2個(gè)腺嘌呤，而ddATP/dATP的濃度比為1/100，當(dāng)引物延伸第一個(gè)A堿基時(shí)，大約有9900個(gè)dATP進(jìn)入新合成的DNA分子(10000x99/100)，同時(shí)約有100個(gè)引物3'末端被引入綠色熒光標(biāo)記的ddATP(10000x1/100)。由于ddATP的3'末端不含自由羥基而反應(yīng)終止，因此當(dāng)延伸第二個(gè)A堿基時(shí)只有剩余的9卯0個(gè)引物可以繼續(xù)延伸，其中又有99個(gè)引物被引入綠色熒光標(biāo)記的ddATP(9900x1/100)，此時(shí)模板序列的T堿基己完成復(fù)制過程但反應(yīng)液中缺乏其它三種堿基導(dǎo)致該點(diǎn)的反應(yīng)無法繼續(xù)進(jìn)行，其綠色熒光強(qiáng)度與該步反應(yīng)過程中整合進(jìn)新生DNA鏈中的熒光ddATP直接相關(guān)，根據(jù)檢測(cè)所得到的綠色熒光的強(qiáng)度，即可判斷A堿基延伸數(shù)目為2。然后，向芯片加入含3'-5'核酸外切酶活性高保真DNA聚合酶與耐3'-5'核酸外切酶消化修飾的特異腺嘌呤的緩沖液及待測(cè)模板進(jìn)行孵育，綠色熒光標(biāo)記的ddATP與非熒光標(biāo)記的dATP被消化，引物3'端末端位置被引入耐3'-5'核酸外切酶消化的修飾腺嘌呤，完成修飾的特異腺嘌呤替換延伸反應(yīng)。至此，綠色熒光標(biāo)記ddATP以及普通dATP被消化，并與多余模板一同被物理漂洗除去，而引物3'末端位置只存在被引入的耐3'-5'核酸外切酶消化的修飾腺嘌呤。漂洗后熒光檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度降至背景噪音水平，至此A堿基延伸反應(yīng)結(jié)束，該點(diǎn)成功引物延伸了2個(gè)A堿基，同時(shí)該點(diǎn)所有引物重新回復(fù)到具有3'末端自由羥基和進(jìn)入可延伸狀態(tài)。A堿基的延伸反應(yīng)結(jié)束后，向芯片加入含ddTTP/dTTP的混合反應(yīng)液及待測(cè)模板進(jìn)行孵育，其中ddTTP為紅色熒光標(biāo)記而dTTP為非熒光標(biāo)記，圖2例中待測(cè)模板在此處序列僅含一個(gè)A堿基，新合成的DNA序列則可相應(yīng)延伸一個(gè)T堿基，并因反應(yīng)液中缺乏引物繼續(xù)延伸所需的其它三種堿基導(dǎo)致反應(yīng)終止。向芯片上加入漂洗液，去除背景熒光信號(hào)后，檢測(cè)其信號(hào)強(qiáng)度，判斷序列當(dāng)前位置dTTP的個(gè)數(shù)。同樣當(dāng)芯片該點(diǎn)含有10000個(gè)引物，需要延伸一個(gè)T堿基，而ddTTP/dTTP的濃度比為1/100，在當(dāng)引物延伸時(shí)，則大約有9900個(gè)dTTP進(jìn)入新合成的DNA分子(10000x99/100)，和同時(shí)約有100個(gè)引物3'末端被引入紅色熒光標(biāo)記的ddTTP(10000x1/100)。此時(shí)由于引物3，末端無法從反應(yīng)液中獲取延伸所需其它三種堿基導(dǎo)致該點(diǎn)的反應(yīng)結(jié)束。其紅色熒光強(qiáng)度約為單堿基延伸反應(yīng)過程中所得到的飽和熒光強(qiáng)度的1%，通過檢測(cè)紅色熒光的強(qiáng)度，可判斷T堿基延伸數(shù)目為1。然后，向芯片加入含3'-5'核酸外切酶活性高保真DNA聚合酶與耐3'-5'核酸外切酶消化修飾的特異dTTP緩沖液及待測(cè)模板進(jìn)行孵育，紅色熒光標(biāo)記的ddTTP與非熒光標(biāo)記的dTTP被消化，耐3'-5'核酸外切酶消化修飾的特異dTTP替換延伸，引物3'端末端位置被引入耐3'-5'外切酶消化的修飾dTTP，這時(shí)引物3'末端位置只存在被引入的耐3'-5'核酸外切酶消化的修飾dTTP，漂洗后使紅色熒光檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度降至背景噪音水平。至此T堿基反應(yīng)結(jié)束。T堿基延伸反應(yīng)結(jié)束后，向芯片加入含ddCTP/dCTP的混合反應(yīng)液和待測(cè)模板進(jìn)行孵育，其中ddCTP為藍(lán)熒光標(biāo)記而dCTP為非熒光標(biāo)記，圖2例中待測(cè)模板在此處序列不含堿基G，新合成的DNA序列則無C堿基延伸。通過相應(yīng)漂洗之后檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，其熒光強(qiáng)度表現(xiàn)為背景噪音而無特定峰值，可判斷此引物點(diǎn)在此次反應(yīng)中無C堿基延伸。雖然芯片中該引物點(diǎn)在上一步含ddCTP/dCTP混合反應(yīng)液中不存在引物延伸，但仍需向芯片加入含3'-5'核酸外切酶活性高保真DNA聚合酶與耐3'-5'核酸外切酶消化修飾的特異dCTP的緩沖液進(jìn)行孵育以使芯片上其它有延伸反應(yīng)的引物點(diǎn)進(jìn)行替換延伸，并完成相應(yīng)漂洗過程。C堿基延伸反應(yīng)結(jié)束后，向芯片加入含ddGTP/dGTP的混合反應(yīng)液和待測(cè)模板進(jìn)行孵育，其中ddGTP為熒光標(biāo)記而dGTP為非熒光標(biāo)記，當(dāng)待測(cè)模板在此處序列含1個(gè)C堿基，新合成的DNA序列則可相應(yīng)延伸1個(gè)G堿基，并因反應(yīng)液中缺乏引物繼續(xù)延伸所需的其它三種堿基導(dǎo)致反應(yīng)終止。部分性鏈終止反應(yīng)完成后，通過漂洗去除背景熒光信號(hào)，檢測(cè)其信號(hào)強(qiáng)度，判斷序列當(dāng)前位置dGTP的個(gè)數(shù)。然后，向芯片加入含3'-5'核酸外切酶活性高保真DNA聚合酶與耐3'-5'核酸外切酶消化修飾的特異dGTP的緩沖液進(jìn)行孵育，熒光標(biāo)記的ddGTP與非熒光標(biāo)記的dGTP被消化，耐3'-5'核酸外切酶消化修飾的特異dGTP替換延伸，引物3，端末端位置被引入耐3'-5'核酸外切酶消化的修飾dGTP,，并完成相應(yīng)漂洗過程。至此G堿基延伸反應(yīng)結(jié)束。綜上所述，通過分析熒光信號(hào)的種類和強(qiáng)度，可得到引物3'末端引入堿基的種類和數(shù)目在反應(yīng)中參與延伸的部分ddNTP，其熒光種類解碼新加入堿基種類，熒光強(qiáng)度解碼新加入堿基的數(shù)量。就例圖2中的代表性引物點(diǎn)而言，經(jīng)過連續(xù)四步反應(yīng)即一個(gè)測(cè)序循環(huán)，引物3，末端被引入AATG，巧妙的完成一段序列的測(cè)序任務(wù)。該方法通過不斷針對(duì)每一種堿基分別進(jìn)行反應(yīng)且連續(xù)循環(huán)，使引物不斷延伸，待測(cè)模板上的序列隨之不斷被解碼，因此，本發(fā)明可以為長(zhǎng)序列模板測(cè)序。下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1遺傳性乳腺癌相關(guān)基因(Brca-1)部分測(cè)序引物設(shè)計(jì)與信號(hào)分析Brca-l為一種與遺傳性乳腺癌發(fā)生相關(guān)的基因，其fe基因庫中的編號(hào)為(NM—065379.3)，含有8個(gè)外顯子。本應(yīng)用例以Brca-l的外顯子1，2和3為例，說明本發(fā)明在實(shí)際序列測(cè)定中的應(yīng)用步驟。(1)準(zhǔn)備相應(yīng)的耐3'-5'核酸外切酶消化的引物并對(duì)這些引物可實(shí)際參與反應(yīng)的三末端自由羥基進(jìn)行定量測(cè)定。目標(biāo)基因的測(cè)序可分為基因組序列測(cè)定和編碼序列測(cè)定。本例以芯片平臺(tái)對(duì)目標(biāo)序列Brca-l的前三個(gè)外顯子編碼序列進(jìn)行測(cè)序設(shè)計(jì)。從Genbank中的表格輸出選項(xiàng)可直接得到相應(yīng)的外顯子和外顯子兩端的內(nèi)含子序列，先合成三末端硫化修飾與五末端氨基修飾的測(cè)序引物(見表l)。測(cè)序引物(濃度在80nM到50pM之間)通過其五末端的氨基基團(tuán)與環(huán)氧化處理的芯片玻璃涂層形成共價(jià)結(jié)合，以含有150mM磷酸鈉的緩沖液(pH=8.0)點(diǎn)樣。室溫下空氣干燥過夜，65。C烘干30分鐘，在含有0.1%SDS，5%乙醇和雙蒸水的熱混合液中沖洗約1分鐘即可應(yīng)用。利用可進(jìn)行原位PCR的PCR儀對(duì)芯片進(jìn)行單堿基延伸與延伸堿基的切除反應(yīng)應(yīng)用100^1含四種熒光標(biāo)記的ddNTP與待測(cè)序模板對(duì)待延伸引物進(jìn)行單堿基延伸，以所得到的熒光強(qiáng)度定量待延伸引物三末端可實(shí)際參與反應(yīng)的9三末端自由羥基數(shù)，之后通過將芯片與含3'-5'核酸外切活性的核酸酶共孵育而達(dá)到切除帶熒光的單堿基。(2)以不具有3'-5，核酸外切酶活性DNA聚合酶介導(dǎo)，以單一種類的熒光標(biāo)記的ddNTP與非熒光標(biāo)記的同一種類dNTP為混合底物及待測(cè)模板的反應(yīng)混合液中進(jìn)行部分性鏈終止引物延伸反應(yīng)。在本例的反應(yīng)中，所用ddNTP/dNTP混合底物為ddATP/dATP混合底物，其比例采用1/100，引物延伸由T7測(cè)序酶介導(dǎo)，反應(yīng)溫度和時(shí)間分別控制52攝氏度至64攝氏度之間和在30秒鐘至90秒鐘之間。這一歩在原理上與Sanger's末端終止法測(cè)序相似，區(qū)別在于本實(shí)驗(yàn)不采用含有四種ddNTP和四種dNTP的公共混合底物，而是分別采用ddATP/dATP;ddTTP/dTTP;ddCTP/dCTP和ddGTP/dGTP四類不同的混合底物。Sanger's末端終止法測(cè)序目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和基因組測(cè)序等眾多領(lǐng)域。部分性鏈終止引物延伸反應(yīng)完成后，向芯片上加入不含ddNTP和dNTP的一倍濃度PCR反應(yīng)緩沖液，重復(fù)清洗2-5次，通過多次洗滌去除殘留在反應(yīng)體系中的背景熒光信號(hào)及多余模板。然后檢測(cè)其信號(hào)強(qiáng)度，以判斷序列當(dāng)前位置腺嘌呤的個(gè)數(shù)。(3)人工合成的耐3'-5'核酸外切酶消化的dNTP在具有3'-5'核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶催化下進(jìn)行的替換性引物延伸反應(yīng)。在本例中的替換性引物延伸反應(yīng)中，采用硫化修飾的PS-dATP底物，其使用濃度為20(HiMdATP，反應(yīng)由具有3'-5'核酸外切酶活性Pfu高保真DNA聚合酶所介導(dǎo)，引物延伸反應(yīng)溫度和時(shí)間分別控制52攝氏度至64攝氏度之間和在30秒鐘至90秒鐘之間。(4)偶聯(lián)部分性鏈終止引物延伸反應(yīng)和替換性引物延伸反應(yīng)并重復(fù)使用這一偶聯(lián)過程。如表1所示，本例顯示了每一循環(huán)都分別針對(duì)每一特定種類的堿基A，T，C，G進(jìn)行部分性鏈終止引物延伸反應(yīng)和替換性引物延伸反應(yīng)。通過不斷重復(fù)這種循環(huán)過程，以解碼更長(zhǎng)序列。此循環(huán)過程為本發(fā)明用于序列分析的基礎(chǔ)，由部分性鏈終止引物延伸反應(yīng)和替換性引物延伸反應(yīng)兩個(gè)偶聯(lián)反應(yīng)不斷循環(huán)來完成測(cè)序任務(wù)。在部分性鏈終止引物延伸反應(yīng)完成后，替換性引物延伸則相對(duì)應(yīng)的分別使用濃度為200pMdATP，200pMdTTP，200pMdCTP,200nMdGTP以完成替換性引物延伸反應(yīng)。通過上述四個(gè)步驟，本例在表1的最后一行中給出了野生型序列。表l、朋CA/外顯子模板制備引物測(cè)序引物12ATGGCAGATGTTGCACTGAGGAAAATAAATTACCAAATTTTCAGCTGTTCAACATACAAAAGCATACCACTGGCCAGCGCCGAAAGCGACCGAGGACCAACCTCGGAGGGTAPl:ATGGCAGATGTTGCACT^P2:CAAATTCCACATTTCAGIP3:CTGTTCAACATACAAAG4P4:TCTGGAGCGCATCGTIP5:CGCCGAAAGCGACCGAGT￡P(guān)6:CTCGGAGGGTATTTATGI10測(cè)序反應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>說明測(cè)序引物中的黑體加下劃線標(biāo)記的堿基為硫化修飾者。此表中所列熒光強(qiáng)度來源于部分性鏈終止反應(yīng)使用ddNTP/dNTP比例為1:100。不同ddNTP/dNTP的比例濃度其意義不同，例如1:IO所得信號(hào)強(qiáng)度較強(qiáng)，對(duì)單一堿基的成串長(zhǎng)序列衰減較快，而l:100或l:1000所得信號(hào)強(qiáng)度相應(yīng)變?nèi)?，但?duì)單一堿基的成串長(zhǎng)序列衰減較慢。事實(shí)上，當(dāng)這一比例為l:0(即僅使用四種混合的ddNTP)時(shí)，只能延伸一個(gè)堿基；而當(dāng)這一比例為0:1(即僅使用四種混合的dNTP)時(shí)，則延伸反應(yīng)可連續(xù)進(jìn)行。表2、ddNTP/dNTP不同比例測(cè)定成串堿基時(shí)針對(duì)單一堿基的每一步中摻入新生DNA鏈中的熒光ddNTP的總熒光強(qiáng)度(以純ddNTP為底物的單堿基延伸熒光強(qiáng)度為1)成串長(zhǎng)度(堿基個(gè)純ddNTP1/101/1001/1000純dNTP數(shù))1l細(xì)0.1000.0100.001O扁20.1900.0200.002O細(xì)30.2710.0300.003O扁40.3440.0390.0040.00050.4100.0490.0050.00060.4690.0590.006o扁70.5220.0680.0070.00080.5700.0770.0080.00090.6130.0860.009o扁100.6510.0960.0100.000110.6860.1050.0110.000120.7180.1140.012o扁130.7460.1220.013o扁140.7710.1310.0140.000150.7940.1400.015o細(xì)160.8150.1490.016o扁170.8330.1570.017o扁180.8500.1650.0180.000190.8650.1740.019o扁200.8780.1820.0200.000210.8910.1900.021o細(xì)220.9020.1980.0220.000230.9110.2060.023o扁240.9200.2140.024o扁250.9280.2220.0250.000260.9350.2300.0260.000270.9420.2380.0270.00028O駕0.2450.028o扁290.9530.2530.029o細(xì)300.9580.2600.030o細(xì)310.9620.2680.031o扁320.9660.2750.0320.000330.9690.2820.0320.000340.9720.2890.0330.000350.9750,2970.0340.00014表1中測(cè)序引物中的黑體加下劃線標(biāo)記的堿基為硫化修飾堿基。此表中所列熒光強(qiáng)度來源于部分性鏈終止引物延伸反應(yīng)使用ddNTf/dNTP比例為1:100。不同ddNTP/dNTP的比例濃度其意爻不同，例如l:IO所得信號(hào)強(qiáng)'度較強(qiáng)，對(duì)單一堿基的成串長(zhǎng)序列衰減較快，而1:100或h1000所得信號(hào)強(qiáng)度相應(yīng)變?nèi)?，但?duì)單一堿基的成串長(zhǎng)序列衰減較慢。事實(shí)上，當(dāng)這一比例為h0(即僅使用四種混合的ddNTP)時(shí)，只能延伸一個(gè)堿基；而當(dāng)這一比例為0:1(即僅使用四種混合的dNTP)時(shí)，則延伸反應(yīng)可連續(xù)進(jìn)行。這一根據(jù)ddNTP/dNTP的比例濃度獲取不同強(qiáng)度熒光信號(hào)和熒光信號(hào)強(qiáng)度在測(cè)序過程中隨單一堿基的成串長(zhǎng)序列衰減的情況在表2中有詳細(xì)反映。參考文獻(xiàn)(1)LanderES,LintonLM,BirrenB,etal.人類基因組的測(cè)序與序列分析(Initialsequencingandanalysisofthehumangenome).自然，Nature,2001,409(6822):860.(2)VenterJC,AdamsMD,MyersEW，etal.人類基因組序列(Thesequenceofthehumangenome).科學(xué)，Science,2001,291:1304-1351.(3)PreparataFP,OliverJS.利用半簡(jiǎn)并堿基的雜交法DNA測(cè)序(DNASequencingbyHybridizationUsingSemi-DegenerateBases).計(jì)算機(jī)生物學(xué)，ComputBiol,2004,11(4):753-765.(4)PrinceJA,FeukL,HowellWM，etal.利用基因位點(diǎn)特異性雜交原理的子彈和精確的單堿基多態(tài)性分析設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)與方法領(lǐng)(J試(Robustandaccuratesinglenucleotidepolymorphismgenotypingbydynamicallele-specifichybridization(DASH):designcriteriaandassayvalidation).基因組研究，GenomeRes,2001,11:152(5)KimDH.,H.K.Oh,J丄Eou，H丄Seo,S.K.Kim,etal.魚類彈狀病毒的全序列一種海洋魚類的致病原(Completenucleotidesequenceofthehir咖erhabdovirus,apathogenofmarinefish).病毒研究，VirusRes,2005,107:1-9.(6)ShendureJ,MitraRD,VarmaC,etal.高級(jí)測(cè)序技術(shù)方法與目標(biāo)(Advancedsequencingtechnologies:methodsandgoals).自然-基因?qū)W綜述，NatureReviewsGenetics,2004,5,335-344.(7)MaiguliesM，EgholmM,AltmanWE,etal.微制造高密度皮升反應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