專利名稱：用核糖醇發(fā)酵液生物轉(zhuǎn)化制備l-核糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及采用微生物細(xì)胞催化核糖醇發(fā)酵液進(jìn)行生物 轉(zhuǎn)化制備L-核糖的方法。
背景技術(shù)：
L-核糖是D-核糖的手性對(duì)映異構(gòu)體，在自然界和生物體內(nèi)并不存在，是一種價(jià)格極 其昂貴的非天然糖。研究表明，L-核糖本身具有一些特殊的功效，它可以增加腫瘤細(xì)胞的 死亡率、減少腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和延緩惡性腫瘤的生長(zhǎng)，特別地，L-核糖不但本身對(duì)于HIV 病毒具有較好的抑制作用，而且廣泛用于合成具有抗病毒活性的核苷類化合物，如臨床前 研究表明稀有L-核糖的改性核苷衍生物l-(2-氟-5-甲基-e-L-阿拉伯-呋喃糖)尿嘧啶 (L-FMAU)能有效地抗肝炎B (HBV)病毒、e -L-5-氟_2， ， 3，-雙脫氧胞苷(P -L_5FddC)作為抗 病毒劑具有很好的活性，且對(duì)人體細(xì)胞的毒性比相應(yīng)的D-核糖衍生物大大降低。另外，L-核糖的衍生物2-脫氧-L-核糖與腺嘌呤等有機(jī)堿形成的核苷衍生物在癌癥、乙肝等疾病的 治療方面也具有很大的應(yīng)用潛能。
L-核糖的化學(xué)合成研究報(bào)道較多，在合成步驟與收率等方面均有了較大提高，但反應(yīng) 條件和所用試劑仍然要求較高，合成過程涉及大量有機(jī)溶劑的使用對(duì)環(huán)境也有不利的影響， 因而難以適應(yīng)綠色工業(yè)化生產(chǎn)的要求。微生物酶法具有高度的立體選擇性、且具備反應(yīng)條 件溫和、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，以廉價(jià)的糖為原料通過微生物或者它們的酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生 產(chǎn)稀有糖類已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。
目前，國(guó)內(nèi)尚未有采用微生物酶法制備L-核糖的報(bào)道，利用微生物'生物轉(zhuǎn)化法合成L-核糖在國(guó)外已經(jīng)引起廣大研究者的興趣，近十年來陸續(xù)出現(xiàn)相關(guān)的研究報(bào)道。1996年，日 本學(xué)者Shimonishi等從嗜精不動(dòng)桿菌DL-28 (J"'"eto&"w平DL-28)發(fā)酵液中分離純化得 到了L-核糖異構(gòu)酶，此后Ahmed等通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了該酶的反應(yīng)特征，它分別在35 'C和40 。C下表現(xiàn)出最高的穩(wěn)定性和活性，可以催化D-甘露糖、D-來蘇糖、和L-核糖的異 構(gòu)化反應(yīng)，酶催化反應(yīng)為可逆平衡反應(yīng)，其中對(duì)L-核糖的異構(gòu)化具有最高的選擇性。1999 年，Ahmed等進(jìn)一步利用紋膜醋酸桿菌04ceto6fl"er flcW/ IF03281)的靜息細(xì)胞將核糖醇進(jìn) 行微生物氧化反應(yīng)，氧化產(chǎn)物L(fēng)-核酮糖再以嗜精不動(dòng)桿菌DL-28的L-核糖異構(gòu)化酶進(jìn)行微 生物異構(gòu)化制備L-核糖，其中的氧化轉(zhuǎn)化率達(dá)98%，而異構(gòu)化轉(zhuǎn)化率為70%。此外，更經(jīng) 濟(jì)的策略是直接將葡萄糖通過微生物發(fā)酵生成核糖醇，再經(jīng)微生物氧化、微生物異構(gòu)化和 分離提純的過程合成L-核糖。如2002年Kawaguchi等的專利(USA 6348326)報(bào)道了 L-核糖的微生物合成及分離提純，將原料葡萄糖在微生物作用下發(fā)酵制備得到核糖醇，含核糖醇的發(fā)酵液進(jìn)一步通過甲苯處理過的弗氏葡萄糖桿菌(G/wc朋o^c^ /ra&"m')靜息細(xì)胞 催化作用氧化成為L(zhǎng)-核酮糖，L-核酮糖溶液再通過甲苯處理的凝膠纖維單胞菌 (CW/w/omo"asge/Wa)的靜息細(xì)胞催化異構(gòu)化為L(zhǎng)-核糖。粗產(chǎn)品溶液經(jīng)蒸發(fā)濃縮，利用陽離 子交換樹脂UBK530，以四柱串聯(lián)的樹脂柱處理，再經(jīng)脫鹽、脫色與結(jié)晶，得到L-核糖， 產(chǎn)品純度達(dá)99%，分離回收率為55.1%，此工藝以葡萄糖為原料制備高價(jià)值L-核糖，具有 較好的工業(yè)化前景，但制備過程涉及有機(jī)溶劑甲苯等的使用對(duì)環(huán)保有一定的影響，且分離 收率不高。
2007年，國(guó)際專利(W0 2007/021879 A2)公開了基因工程菌細(xì)胞催化核糖醇制備L-核糖的新技術(shù)，將洋芹菜中提取的甘露醇脫氫酶基因在大腸桿菌BL21中表達(dá)。當(dāng)核糖醇濃 度為2%時(shí)，用構(gòu)建的工程菌細(xì)胞催化反應(yīng)48h，可將約25%的核糖醇轉(zhuǎn)化成卜核糖。2008 年，Woodyer等的文獻(xiàn)進(jìn)一步報(bào)道重組甘露醇脫氫酶基因的大腸桿菌BL21細(xì)胞催化制備L-核糖的研究結(jié)果反應(yīng)體系中添加5-500uMZnCl2和5g/L的甘油均可提高L-核糖的生產(chǎn)； 在優(yōu)化的條件下，放大至l升發(fā)酵反應(yīng)時(shí)，底物核糖醇(濃度100g/L)在反應(yīng)72h后55% 轉(zhuǎn)化成L-核糖。通過基因工程菌將核糖醇生物轉(zhuǎn)化制備L-核糖的轉(zhuǎn)化率有待于進(jìn)一步提高， 同時(shí)生物轉(zhuǎn)化所需時(shí)間也較長(zhǎng)；此外，由于核糖醇本身原料價(jià)格相對(duì)較高，與以廉價(jià)的葡 萄糖為原料相比，以核糖醇為原料制備L-核糖顯然不經(jīng)濟(jì)。
事實(shí)上，Kawaguchi等以葡萄糖為原料通過三步生物法制備L-核糖時(shí)，L-核酮糖異構(gòu) 化為L(zhǎng)-核糖屬于可逆反應(yīng)，其異構(gòu)化轉(zhuǎn)化率僅為70%。此外，其產(chǎn)品的分離收率也較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用核糖醇發(fā)酵液生物轉(zhuǎn)化制備L-核 糖的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下
用核糖醇發(fā)酵液生物轉(zhuǎn)化制備L-核糖的方法，包括下述步驟
(1) 核糖醇發(fā)酵液的制備以葡萄糖為原料，通過菌種發(fā)酵生產(chǎn)核糖醇，除去菌體，稀釋
至核糖醇含量為5 50 g/L， 121 'C下滅菌15 min;
(2) 弗氏葡萄糖桿菌細(xì)胞催化反應(yīng)酶液的制備將菌種弗氏葡萄糖桿菌(G/"c卵oto"w ^"Otewm'ATCC49207)從斜面轉(zhuǎn)接到種子液中培養(yǎng)18 48 h;
(3) 將步驟(2)制備的弗氏葡萄糖桿菌種子液按1% 20%的體積比接入所述步驟(1)制 備的溶液中，調(diào)節(jié)pH值為4.0 7. 0、在轉(zhuǎn)速為100 500 rpm、通氣流量為0.1 1.5 vvm 的條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化18 48 h;
(4) 將生物轉(zhuǎn)化后的溶液經(jīng)離心分離除菌、活性炭脫色、減壓蒸餾濃縮、色譜分離樹脂柱 層析、層析液濃縮和有機(jī)溶媒結(jié)晶后得到高純度的L-核糖。
優(yōu)選的是所述步驟(1)為以葡萄糖為原料，選高滲酵母球頭三型孢菌 (7yic力o印oro/7W'oksoe^c印/ a7^sATCC 16958)為出發(fā)菌株，經(jīng)斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)后， 在溫度25 45°C， pH為4 7的條件下發(fā)酵80 160 h，葡萄糖完全消耗后，通過離心除 去菌體，稀釋至核糖醇含量為5 50 g/L， 121 °〇下滅菌15 min。所述步驟(2)為將所述菌種弗氏葡萄糖桿菌從斜面轉(zhuǎn)接到種子液中培養(yǎng)18 48 h， 所述種子培養(yǎng)基組成為甘油10 25 g/L、玉米漿粉10 25 g/L、葡萄糖10 30 g/L、 NaCl 1 15 g/L、核糖醇O. 5 5 g/L、 ZnCl2 1 10 umol/L和FeCl3 1 1Oumol/L，種子罐 的培養(yǎng)溫度為25 35 。C，通氣量為0.5 1.5 vvm，轉(zhuǎn)速為100 500 rpm。
所述步驟(4)中所述色譜分離樹脂為Ca型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。
所述Ca型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂可以選英國(guó)產(chǎn)PUROLITE PCR642鈣型離子交換樹脂， 或國(guó)產(chǎn)001X7型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂經(jīng)0.5 mol/L的CaCl2水溶液轉(zhuǎn)成Ca型，或D001型強(qiáng) 酸性陽離子交換樹脂經(jīng)O. 5 mol/L的CaCl2水溶液轉(zhuǎn)成Ca型。
本發(fā)明的方法以廉價(jià)的葡萄糖為原料制備高價(jià)的L-核糖，其原料利用率高、收率高、
生產(chǎn)成本較低、無需用有機(jī)溶劑(如甲苯)處理弗氏葡萄糖桿菌細(xì)胞，無有機(jī)溶劑造成的 環(huán)境污染，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，本發(fā)明還提出了用Ca型陽離子交換樹脂進(jìn)行分離純化L-核糖 醇的工藝，分離純化工藝簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，可獲得高收率的L-核糖產(chǎn)品，為L(zhǎng)-核糖的工業(yè) 化生產(chǎn)提供一種實(shí)用的新途徑。


圖1為本發(fā)明的方法制備的L-核糖的紅外光譜分析圖； 圖2為本發(fā)明的方法制備的L-核糖的質(zhì)譜圖3為L(zhǎng)-核糖的質(zhì)譜碎片解析示意圖；(電離方式大氣壓化學(xué)電離APCI) 圖4為L(zhǎng)-核糖的質(zhì)譜碎片解析示意圖；(電離方式大氣壓化學(xué)電離APCI)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例1
用核糖醇發(fā)酵液生物轉(zhuǎn)化制備L-核糖的方法，包括下述步驟
(1)核糖醇發(fā)酵液的制備 斜面培養(yǎng)
選高滲酵母球頭三型孢菌(rric/ os; oro/7oiotesoeobce; / aJj^ATCC 16958)為出發(fā)菌 株，進(jìn)行斜面培養(yǎng)，30 。C恒溫培養(yǎng)四天；其中斜面培養(yǎng)基組成為葡萄糖20 g/L、瓊脂 15 g/L、 土豆塊300 g/L (通過加熱煮成土豆泥)；
種子培養(yǎng)
將斜面培養(yǎng)后的高滲酵母球頭三型孢菌種接入種子培養(yǎng)液中培養(yǎng)36 h，種子培養(yǎng)基組 成為葡萄糖200 g/L、酵母膏30 g/L，種子培養(yǎng)采用有氧培養(yǎng)，使用500 mL三角搖瓶， 裝液量為100 mL，培養(yǎng)溫度為30 °C，搖床轉(zhuǎn)速為180 rpm;
發(fā)酵培養(yǎng)
將種子培養(yǎng)液按5%的體積比轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)采用50 L發(fā)酵罐，裝液量為 30 L，其中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖IOO g/L、酵母膏100 g/L， NaCl 5 g/L、 MgS04 5 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30 °C， pH為5.0，發(fā)酵過程通氣量為lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速為350 rpm，發(fā)酵99 h葡萄糖完全消耗。液相色譜分析核糖醇含量為35 g/L,發(fā)^液經(jīng)離心分離除去 菌體后再稀釋至核糖醇含量為15 g/L， 121 。C下滅菌15 min;
(2) 弗氏葡萄糖桿菌細(xì)胞催化反應(yīng)酶液的制備
斜面培養(yǎng)-
將菌種弗氏葡萄糖桿菌(G/wco"o6a"w/rafewrZ ATCC 49207)為出發(fā)菌株，進(jìn)行斜面培養(yǎng)， 30 。C 恒溫培養(yǎng)四天；斜面培養(yǎng)基為山梨糖50g/L，酵母浸粉10.0g/L,蛋白胨IO.O g/L,瓊脂粉，pH值為6.0。
生物酶反應(yīng)種子液培養(yǎng)-
將弗氏葡萄糖桿菌從斜面轉(zhuǎn)接到500 mL搖瓶中，種子液裝液量為100 mL，在30 'C、 搖床轉(zhuǎn)速180 rpm條件下培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接至裝有種子液的7_L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵罐裝液 量為5 L，在30 °C、通氣量為1 vvin、轉(zhuǎn)速200 rpra條件下培養(yǎng)24 h后備用，其中種子 培養(yǎng)基的組成為(g/U:甘油15、玉米漿粉15、葡萄糖20、 NaCl 5、核糖醇2，此外添 力口 ZnCl2 10 umoI/L, FeCl3 5umol/L;
(3) 生物細(xì)胞催化酶反應(yīng)
將步驟(1)制得的核糖醇發(fā)酵稀釋液裝入50L發(fā)酵罐中，裝液量為30L，并在121 °C 下滅菌15 min，將步驟(2)培養(yǎng)好的5L弗氏葡萄糖桿菌酶反應(yīng)種子液全部轉(zhuǎn)入30L上述 核糖醇稀釋液中，在30 °C、轉(zhuǎn)速350 rpm、控制pH值為5.0、通氣量為lvvm的條件下生 物轉(zhuǎn)化30 h，核糖醇完全轉(zhuǎn)化，生物轉(zhuǎn)化液中含L-核糖和L-核酮糖，其中液相色譜分析 核糖醇濃度為7. 43 g/L。
(4) L-核糖分離純化及結(jié)構(gòu)確證
將步驟(3)的反應(yīng)液經(jīng)離心分離(5000 g， 10min)除去菌體后，添加千分之三的活 性炭(質(zhì)量比)，在60 'C下進(jìn)行攪拌脫色lh，過濾除去活性炭后減壓濃縮至原體積的10%。 取濃縮液置于鈣型強(qiáng)酸性陽離子樹脂交換柱中進(jìn)行分離(PUROLITE PCR642鈣型離子交換樹 脂)，樹脂柱長(zhǎng)為4 m，柱內(nèi)徑為16 cm，去離子水洗脫流速為2 L/h，將含L-核糖的洗脫液 收集，減壓濃縮成糖漿，添加3質(zhì)量倍的無水乙醇及少量L-核糖晶種，在4 'C下放置24h 后析出L-核糖晶體，晶體經(jīng)冷乙醇洗滌干燥后測(cè)定其純度為99%，產(chǎn)品比旋光度為 [a]^=+18.5，紅外光譜(圖1)及質(zhì)譜分析(圖2、圖3、圖4)進(jìn)一步確證結(jié)構(gòu)(其中m/z: 149.1為準(zhǔn)分子離子峰[M-， m/z:131. 1為[\1-^120]- ， m/z:113. 1為[M_2H20]-)。 實(shí)施例2
(1)核糖醇發(fā)酵液的制備i
將高滲酵母球頭三型孢菌(:Tri'c力05^oro/70iVes oeobcep/ a7A ATCC 16958)菌種接入 裝有2.0 L種子培養(yǎng)液的7-L發(fā)酵罐中，在30 °C、通氣量為lvvm、轉(zhuǎn)速200 rpm的條件 下培養(yǎng)48 h，然后將2 L種子液轉(zhuǎn)接入裝有30 L發(fā)酵液的50 L發(fā)酵罐進(jìn)行核糖醇的發(fā)酵 制備，其中發(fā)酵液組成為葡萄糖質(zhì)量百分含量為10%，酵母膏質(zhì)量百分含量為2%、 NaCl 含量為0.5 g/L、 MgS04含量為0.5 g/L,及泡敵3 mL。發(fā)酵條件為攪拌轉(zhuǎn)速350 rpm、 溫度30 'C、空氣流量為lvvm，發(fā)酵至葡萄糖完全消耗即終止，液相色譜分析其中核糖醇(2) L-核糖的制備反應(yīng)
首先將弗氏葡萄糖桿菌從斜面轉(zhuǎn)接到500mL搖瓶中，種子液裝液量為100mL,在30 °C、 搖床轉(zhuǎn)速180 rpm條件下培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接至裝有種子液的7L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵罐裝液 量為5 L，在30 °C、轉(zhuǎn)速200 rpm條件下培養(yǎng)24 h后備用。其中種子培養(yǎng)基的組成為(g/L): 甘油15、玉米漿粉15、葡萄糖20、 NaCl 5、核糖醇2，此外添加ZnCl2 10 umol/L， FeCl3 5umol/L。然后，將除去菌體的核糖醇發(fā)酵液稀釋至含核糖醇濃度為15 g/L后裝入50L發(fā) 酵罐中，裝液量為30L，并在121 'C下滅菌15 min。最后將培養(yǎng)好的5L弗氏葡萄糖桿菌 酶反應(yīng)種子液全部轉(zhuǎn)入30L上述核糖醇稀釋液中，在30 °C、轉(zhuǎn)速350 rpm、控制pH值為 5.0、通氣量為lwm的條件下生物轉(zhuǎn)化30h，核糖醇完全轉(zhuǎn)化，生物轉(zhuǎn)化液中含L-核糖和 L-核酮糖，其中液相色譜分析核糖醇濃度為7.43 g/L;
(3) L-核糖分離純化及結(jié)構(gòu)確證
將上述(2)步的反應(yīng)液經(jīng)離心分離(5000 g， 10min)除去菌體后，添加千分之三(質(zhì) 量含量)的活性炭在60 'C下進(jìn)行攪拌脫色1 h，過濾除去活性炭后減壓濃縮至原體積的 10%。取濃縮液置于強(qiáng)酸性型陽離子樹脂交換柱中進(jìn)分離(PUROLITE PCR642鈣型離子交換 樹脂)，樹脂柱長(zhǎng)為4 m，柱內(nèi)徑為16 cm，去離子水洗脫流速為2 L/h。將含L-核糖的洗脫 液收集，減壓濃縮成糖漿，添加3倍的無水乙醇及少量L-核糖晶種，在4 'C下放置24 h 后析出L-核糖晶體，晶體經(jīng)冷乙醇洗滌干燥后測(cè)定其純度為99%。 實(shí)施例3
用核糖醇發(fā)酵液生物轉(zhuǎn)化制備L-核糖的方法，包括下述步驟
(1) 核糖醇發(fā)酵液的制備
斜面培養(yǎng)
選高滲酵母球頭三型孢菌(7^'c/ os/ oro/7W'ofesoeobc印/ ah'sATCC 16958)為出發(fā)菌 株，進(jìn)行斜面培養(yǎng)，25i:恒溫培養(yǎng)四天；其中斜面培養(yǎng)基組成為葡萄糖20g/L、瓊脂15 g/L、 土豆塊300 g/L (通過加熱煮成土豆泥)；
種子培養(yǎng)
將斜面培養(yǎng)后的高滲酵母球頭三型孢菌種接入種子培養(yǎng)液中培養(yǎng)36 h，種子培養(yǎng)基組 成為葡萄糖200 g/L、酵母膏30 g/L，種子培養(yǎng)采用有氧培養(yǎng)，使用500 raL三角搖瓶， 裝液量為100 mL，培養(yǎng)溫度為30 °C,搖床轉(zhuǎn)速為180 rpm;
發(fā)酵培養(yǎng)
將種子培養(yǎng)液按5%的體積比轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)采用50 L發(fā)酵罐，裝液量為 30 L，其中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖IOO g/L、酵母膏100 g/L, NaCl 5 g/L、 MgS04 5 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)溫度為25 °C， pH為4.0，發(fā)酵過程通氣量為lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速為350 rpra， 發(fā)酵160 h葡萄糖完全消耗。液相色譜分析核糖醇含量，發(fā)酵液經(jīng)離心分離除去菌體后再 稀釋至核糖醇含量為5 g/L， 121 。C下滅菌15 min;
(2) 弗氏葡萄糖桿菌細(xì)胞催化反應(yīng)酶液的制備斜面培養(yǎng)-
將菌種弗氏葡萄糖桿菌(G/wco"o&c欣/rafewm'ATCC 49207)為出發(fā)菌株，進(jìn)行斜面培養(yǎng)， 30 。C 恒溫培養(yǎng)四天；斜面培養(yǎng)基為山梨糖50g/L，酵母浸粉10.0g/L，蛋白胨IO.O g/L，瓊脂粉，pH值為6.0。
生物酶反應(yīng)種子液培養(yǎng)-
將弗氏葡萄糖桿菌從斜面轉(zhuǎn)接到500 mL搖瓶中，種子液裝液量為100 mL，在30 。C、 搖床轉(zhuǎn)速180 rpm條件下培養(yǎng)48 h后轉(zhuǎn)接至裝有種子液的7L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵罐裝液 量為5 L，在35°。、通氣量為1.5 vvm、轉(zhuǎn)速500 rpm條件下培養(yǎng)48h后備用，其中種子培 養(yǎng)基的組成為(g/L):甘油25、玉米漿粉IO、葡萄糖30、 NaCl 15、核糖醇0.5，此外添 力口 ZnCl2 1 umol/L， FeCl3 10umol/L; (3)生物細(xì)胞催化酶反應(yīng)
將步驟(1)制得的核糖醇發(fā)酵液稀釋液裝入50L發(fā)酵罐中，裝液量為30L，并在121 °C 下滅菌15 min，將步驟(2)培養(yǎng)好的0.3 L弗氏葡萄糖桿菌酶反應(yīng)種子液全部轉(zhuǎn)入30L 上述核糖醇稀釋液中，在30 °C、轉(zhuǎn)速500 rpm、控制pH值為4.0、通氣量為0. lvvm的條 件下生物轉(zhuǎn)化48h，核糖醇完全轉(zhuǎn)化，生物轉(zhuǎn)化液中含L-核糖和L-核酮糖； (4) L-核糖分離純化及結(jié)構(gòu)確證
將上述(3)步的反應(yīng)液經(jīng)離心分離(5000 g， 10 min)除去菌體后，添加千分之三的 活性炭(質(zhì)量比)，在60 'C下進(jìn)行攪拌脫色1 h，過濾除去活性炭后減壓濃縮至原體積的 10%。取濃縮液置于國(guó)產(chǎn)001X7型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂經(jīng)0. 5 mol/L的CaCl2水溶液轉(zhuǎn) 成Ca型進(jìn)行分離，樹脂柱長(zhǎng)為4 m,柱內(nèi)徑為16 cm，去離子水洗脫流速為2 L/h，將含L-核糖的洗脫液收集，減壓濃縮成糖漿，添加2質(zhì)量倍的無水乙醇及少量L-核糖晶種，在4 °C 下放置24 h后析出L-核糖晶體，晶體經(jīng)冷乙醇洗漆干燥后測(cè)定其純度。 實(shí)施例4
用核糖醇發(fā)酵液生物轉(zhuǎn)化制備L-核糖的方法，包括下述步驟
(1)核糖醇發(fā)酵液的制備 斜面培養(yǎng)
選高滲酵母球頭三型孢菌(7>ic/ os; o/w7az'Gfesoec/oce/ / a^^ATCC 16958)為出發(fā)菌 株，進(jìn)行斜面培養(yǎng)，35 'C恒溫培養(yǎng)四天；其中斜面培養(yǎng)基組成為葡萄糖20 g/L、瓊脂 15 g/L、 土豆塊300 g/L (通過加熱煮成土豆泥)；
種子培養(yǎng)
將斜面培養(yǎng)后的高滲酵母球頭三型孢菌種接入種子培養(yǎng)液中培養(yǎng)36 h,種子培養(yǎng)基組 成為葡萄糖200 g/L、酵母膏30 g/L，種子培養(yǎng)采用有氧培養(yǎng)，使用500 mL三角搖瓶， 裝液量為100 mL，培養(yǎng)溫度為30 °C，搖床轉(zhuǎn)速為180 rpm;
發(fā)酵培養(yǎng)
將種子培養(yǎng)液按5%的體積比轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)采用50 L發(fā)酵罐，裝液量為30 L，其中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖200 g/L、酵母膏100 g/L， NaCl 5 g/L、 MgS04 5 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)溫度為45 。C， pH為7.0，發(fā)酵過程通氣量為lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速為350 rpm, 發(fā)酵80h葡萄糖完全消耗。液相色譜分析核糖醇含量為65 g/L，發(fā)酵液經(jīng)離心分離除去菌 體后再稀釋至核糖醇含量為50g/L, 121 。C下滅菌15 min; (2)弗氏葡萄糖桿菌細(xì)胞催化反應(yīng)酶液的制備
斜面培養(yǎng)
將菌種弗氏葡萄糖桿菌(G/wco"o6"c敏/ra/ewm' ATCC 49207)為出發(fā)菌株，進(jìn)行斜面培養(yǎng)， 30 °C恒溫培養(yǎng)四天；斜面培養(yǎng)基為山梨糖50g/L，酵母浸粉10.0g/L，蛋白胨IO.O g/L，瓊脂粉，pH值為6.0。
生物酶反應(yīng)種子液培養(yǎng) -
將弗氏葡萄糖桿菌從斜面轉(zhuǎn)接到500 mL搖瓶中，種子液裝液量為100mL，在25"C、搖
床轉(zhuǎn)速100 rpm條件下培養(yǎng)18 h后轉(zhuǎn)接至裝有種子液的7L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵罐裝液量 為5 L，在25°C、通氣量為0. 5 vvm、轉(zhuǎn)速100 rpm條件下培養(yǎng)18h后備用，其中種子培 養(yǎng)基的組成為(g/L):甘油10、玉米漿粉25、葡萄糖10、 NaCl 1、核糖醇5，此外添加 ZnCl2 5 umol/L, FeCl3 lumol/L; (3)生物細(xì)胞催化酶反應(yīng)
將步驟(1)制得的核糖醇發(fā)酵液稀釋液裝入50L發(fā)酵罐中，裝液量為30L，并在121 °C 下滅菌15 min，將步驟(2)步培養(yǎng)好的6 L弗氏葡萄糖桿菌酶反應(yīng)種子液全部轉(zhuǎn)入30L 上述核糖醇稀釋液中，在30 。C、轉(zhuǎn)速IOO rpm、控制pH值為7.0、通氣量為1. 5vvm的條 件下生物轉(zhuǎn)化18 h，核糖醇完全轉(zhuǎn)化，生物轉(zhuǎn)化液中含L-核糖和L-核酮糖； (4) L-核糖分離純化及結(jié)構(gòu)確證
將步驟(3)的反應(yīng)液經(jīng)離心分離(5000 g， 10min)除去菌體后，添加千分之三的活 性炭(質(zhì)量比)，在60 t:下進(jìn)行攪拌脫色lh，過濾除去活性炭后減壓濃縮至原體積的10%。 取濃縮液置于D001型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂經(jīng)0. 5 mol/L的CaCl2水溶液轉(zhuǎn)成Ca型進(jìn)行 分離，樹脂柱長(zhǎng)為4 m，柱內(nèi)徑為16 cm，去離子水洗脫流速為2 L/h。將含L-核糖的洗脫 液收集，減壓濃縮成糖漿，添加4質(zhì)量倍的無水乙醇及少量L-核糖晶種，在4 。C下放置 24 h后析出L-核糖晶體，晶體經(jīng)冷乙醇洗滌干燥后測(cè)定其純度。
各實(shí)施例中核糖醇發(fā)酵液的制備還可以選用7Wc/2仍o/7oro"wVfes wa&Vfo,
附egflc/n'〃em7'i1, 7Wc/zospoTO"o/cfes 5/ "Aw/ato等菌發(fā)酵葡萄糖制備得至!j 。
權(quán)利要求
1.用核糖醇發(fā)酵液生物轉(zhuǎn)化制備L-核糖的方法，其特征是包括下述步驟(1)核糖醇發(fā)酵液的制備以葡萄糖為原料，通過菌種發(fā)酵生產(chǎn)核糖醇，除去菌體，稀釋至核糖醇含量為5～50g/L，滅菌；(2)弗氏葡萄糖桿菌細(xì)胞催化反應(yīng)酶液的制備將菌種弗氏葡萄糖桿菌(GluconobacterfrateurriATCC 49207)從斜面轉(zhuǎn)接到種子液中培養(yǎng)18～48h；(3)將步驟(2)制備的弗氏葡萄糖桿菌種子液按1％～20％的體積比接入所述步驟(1)制備的溶液中，調(diào)節(jié)pH值為4.0～7.0、在轉(zhuǎn)速為100～500rpm、通氣流量為0.1～1.5vvm的條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化18～48h；(4)將生物轉(zhuǎn)化后的溶液經(jīng)離心分離除菌、活性炭脫色、減壓蒸餾濃縮、色譜分離樹脂柱層析、層析液濃縮和有機(jī)溶媒結(jié)晶后得到高純度的L-核糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用核糖醇發(fā)酵液生物轉(zhuǎn)化制備L-核糖的方法，其特征是所 述步驟(1)為以葡萄糖為原料，選高滲酵母球頭三型孢菌( oe^c印力a7A ATCC 16958)為出發(fā)菌株，經(jīng)斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)后，在溫度25 45'C， pH為4 7的條件下發(fā)酵80 160h，葡萄糖完全消耗后，通過離心除去菌體，稀釋至核糖 醇含量為5 50 g/L， 121 。C下滅菌15 min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用核糖醇發(fā)酵液生物轉(zhuǎn)化制備L-核糖的方法，其特征是所 述步驟(2)為將所述菌種弗氏葡萄糖桿菌從斜面轉(zhuǎn)接到種子液中培養(yǎng)18 48 h，所述 種子培養(yǎng)基組成為甘油10 25g/L、玉米漿粉10 25 g/L、葡萄糖10 30 g/L、 NaCl l 15 g/L、核糖醇O. 5 5 g/L、 ZnCl2 1 10umol/L和FeCl3 1 10umol/L，種子罐的培養(yǎng)溫 度為25 35 °C，通氣量為0.5 1.5 vvm，轉(zhuǎn)速為100 500 rpm。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用核糖醇發(fā)酵液生物轉(zhuǎn)化制備L-核糖的方法，其特征是所述 步驟(4)中所述色譜分離樹脂為Ca型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用核糖醇發(fā)酵液生物轉(zhuǎn)化制備L-核糖的方法，其特征是所 述Ca型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂為英國(guó)產(chǎn)PUROLITE PCR642鈣型離子交換樹脂，或國(guó)產(chǎn)OOl X7型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂經(jīng)0.5mol/L的CaCl2水溶液轉(zhuǎn)成Ca型，或D001型強(qiáng)酸性陽 離子交換樹脂經(jīng)0. 5 mol/L的CaCl2水溶液轉(zhuǎn)成Ca型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用核糖醇發(fā)酵液生物轉(zhuǎn)化制備L-核糖的方法，包括下述步驟(1)核糖醇發(fā)酵液的制備；(2)弗氏葡萄糖桿菌細(xì)胞催化反應(yīng)酶液的制備將菌種弗氏葡萄糖桿菌(Gluconobacter frateurri ATCC 49207)從斜面轉(zhuǎn)接到種子液中培養(yǎng)18～48h；(3)將步驟(2)制備的弗氏葡萄糖桿菌種子液接入所述步驟(1)制備的溶液中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化；(4)經(jīng)離心分離除菌、活性炭脫色、減壓蒸餾濃縮、色譜分離樹脂柱層析、層析液濃縮和有機(jī)溶媒結(jié)晶后得到高純度的L-核糖。本發(fā)明其原料利用率高、收率高、生產(chǎn)成本較低、無需用有機(jī)溶劑處理弗氏葡萄糖桿菌細(xì)胞，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。
文檔編號(hào)C12R1/01GK101294176SQ200810053529
公開日2008年10月29日 申請(qǐng)日期2008年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月16日
發(fā)明者萬屹東, 元英進(jìn), 吉 尤, 李良智, 偉 王, 芮新生 申請(qǐng)人:常茂生物化學(xué)工程股份有限公司;天津大學(xué)