專利名稱：：一種新型的微生物培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般地涉及細菌培養(yǎng)基的配比，該培養(yǎng)基特別是用于轉(zhuǎn)化植物甾醇為雄烯二酮的增殖分枝桿菌屬微生物的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：雄甾4-烯-3，17-雙酮(androst-4-ene-3，17-dione，簡稱雄烯二酮或AD)是甾體激素類藥物不可替代的中間體，對機體起著非常重要的調(diào)節(jié)作用?？梢哉f幾乎所有甾體激素藥物都是以AD作為起始原料進行生產(chǎn)的。如用于生產(chǎn)性激素、孕激素、蛋白同化激素及皮質(zhì)激素，又可用于合成氫化可的松，氧化潑尼松，黃體酮、雌烯醇、地塞米松等100余種藥物，也是直接用于生產(chǎn)抗早孕藥米非司酮和各類計劃生育用藥的必不可少的基本原料。如今AD不斷被一些發(fā)達國家用于開發(fā)和生產(chǎn)新的醫(yī)藥主品，如福美司坦(Formestane或Lentaron)，等及類固醇類激素免疫抗原等，目前全世界范圍內(nèi)，AD的應(yīng)用領(lǐng)域日益拓寬，用AD做原材料生產(chǎn)的醫(yī)藥品種不斷增加。由于化學(xué)全合成雄烯二酮成本較高，國內(nèi)外很多科學(xué)家一直研究如何通過生物發(fā)酵方法得到雄烯二酮。50年代，美國Upjohn公司首先利用側(cè)鏈上有雙鏈的大豆甾醇和麥角留醇為原料生產(chǎn)出雄甾-4-烯-3，17二酮(AD)及雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)并以此作為合成甾體藥物的原料。近年來，由于甾體藥物應(yīng)用量逐年增加，人們的目光又轉(zhuǎn)到在動植物界中含量較多的膽甾醇，谷甾醇，菜油甾醇等，并被認為是具有巨大潛能的甾體激素類藥物的起始原料。20世紀60年代中期，由Sih等首先發(fā)現(xiàn)有些微生物可以選擇性降解切除甾醇的飽和側(cè)鏈而得到AD和ADD，70年代初，日本的有馬啟利用微生物降解膽甾醇生產(chǎn)ADD獲得成功，受到許多制藥公司的高度重視。為了大量生產(chǎn)類固醇激素，研究者試圖使用甾醇為唯一碳源分離微生物和改變甾醇結(jié)構(gòu)用作發(fā)酵的底物，并用能防止甾醇核降解的化學(xué)添加劑來提高類固醇的收得率，這一努力己獲得很大進展(Marsheck等，ApliedMicroobiology，23(1):7277，1972)。此外，埃及國家研究中心生物與天然產(chǎn)品化學(xué)系的和Sallam等研究發(fā)現(xiàn)，利用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)底物培養(yǎng)基pH值5.57.38可提高生物降解AD、ADD的轉(zhuǎn)化率。Upjohn公司在美國專利No.4，293，644中描述了一種通過分枝桿菌(ATCC29472)的突變株從多種類固醇中得到以高產(chǎn)量的雄-4-烯-3，n-二酮(AD)為主，并有少量雄-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)的產(chǎn)物的方法。以后的研究發(fā)現(xiàn)節(jié)桿菌，諾卡氏菌和分枝桿菌等微生物均可用于直接切除甾醇的飽和側(cè)鏈，在一定條件下得到AD和ADD，這使得微生物轉(zhuǎn)化工業(yè)化生產(chǎn)成為可能。由于生物發(fā)酵方法得到AD和ADD過程中主要依靠菌種，那發(fā)酵效果除了與菌種本身密切相關(guān)外，菌種在發(fā)酵過程中所使用的培養(yǎng)基也十分重要。目前常用的培養(yǎng)基主要使用的是糖蜜-Refiner糖蜜(BC糖)，如專利CN03804973中培養(yǎng)分支桿菌就是用得是該種糖蜜，但是甾醇發(fā)酵生產(chǎn)中種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基使用的糖蜜-Refiner糖蜜(BC糖)，是生產(chǎn)甜菜糖廠的廢糖蜜"Refmer'Smolasses"，質(zhì)量很不穩(wěn)定，年年都有變化，其質(zhì)量的好壞直接影響轉(zhuǎn)化率.這是一個有待解決的問題(楊英、姜紹通，微生物降解甾醇側(cè)鏈轉(zhuǎn)化雄甾-4-烯-3，17-二酮的研究進展，微生物學(xué)通報，2006年33(6)，145)。分支桿菌(Mycobacteriumsp.)是一種可以使植物甾醇發(fā)酵而得到雄甾-4-烯-3，17二酮(AD)及雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)的重要菌種，其發(fā)酵培養(yǎng)基也主要使用的是Refmer糖蜜，也存在上述問題。
發(fā)明內(nèi)容本專利主要解決利用植物甾醇發(fā)酵得到AD和ADD過程中微生物培養(yǎng)基使用糖蜜造成的問題。通過大量的實驗和研究，我們驚奇的發(fā)現(xiàn)，植物甾醇發(fā)酵得到AD和ADD過程中所使用的微生物在含有玉米漿和無機鹽的培養(yǎng)基中能較好的生存并能將植物甾醇很好的轉(zhuǎn)化為AD(D),減少產(chǎn)物AD(D)含量上的波動，尤其是在針對分支桿菌、諾卡氏菌的培養(yǎng)基中尤為出色。以下的詳細說明幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員實施本發(fā)明。然而，此詳細說明并不解釋為對本發(fā)明范圍的過度限制。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以對在此討論的實施例進行修飾和變化而不背離本發(fā)明范圍的精神。在本發(fā)明中，該營養(yǎng)培養(yǎng)基適用于植物甾醇生物轉(zhuǎn)化為AD和ADD所涉及各種微生物，包括分枝桿菌和諾卡氏菌。本領(lǐng)域中還有許多己知和可用微生物，本發(fā)明并不限制于其中的任何一個。發(fā)酵培養(yǎng)根據(jù)不同階段分為三類培養(yǎng)基，一種是種子培養(yǎng)基，一種是生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基細菌發(fā)酵培養(yǎng)基按其用途可分為孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基三種。孢子培養(yǎng)基是供菌種繁殖孢子的一種常用固體培養(yǎng)基，對這種培養(yǎng)基的要求是能使菌體迅速生長，產(chǎn)生較多優(yōu)質(zhì)的孢子，并要求這種培養(yǎng)基不易引起菌種發(fā)生變異。所以對孢子培養(yǎng)基的基本配制要求是第一，營養(yǎng)不要太豐富(特別是有機氮源)，否則不易產(chǎn)孢子。如灰色鏈霉在葡萄糖一硝酸鹽一其它鹽類的培養(yǎng)基上都能很好地生長和產(chǎn)孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只長菌絲而不長孢子。第二，所用無機鹽的濃度要適量，不然也會影響孢子量和孢子顏色。第三，要注意孢子培養(yǎng)基的pH和濕度。生產(chǎn)上常用的孢子培養(yǎng)基有麩皮培養(yǎng)基、小米培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基、玉米碎屑培養(yǎng)基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食鹽等配制成的瓊脂斜面培養(yǎng)基。大米和小米常用作霉菌孢子培養(yǎng)基，因為它們含氮量少，疏松、表面積大，所以是較好孢子培養(yǎng)基。大米培養(yǎng)基的水分需控制在21%—50%，而曲房空氣濕度需控制在90%—100%。一般該類培養(yǎng)基主要是在實驗室內(nèi)進行菌種傳代使用，不參與工業(yè)化發(fā)酵過程。種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽、生長和大量繁殖菌絲體，并使菌體長得粗壯，成為活力強的"種子"。所以種子培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分要求比較豐富和完全，氮源和維生素的含量也要高些，但總濃度以略稀薄為好，這樣可達到較高的溶解氧，供大量菌體生長繁殖。種子培養(yǎng)基的成分要考慮在微生物代謝過程中能維持穩(wěn)定的pH，其組成還要根據(jù)不同菌種的生理特征而定。一般種子培養(yǎng)基都用營養(yǎng)豐富而完全的天然有機氮源，因為有些氨基酸能刺激孢子發(fā)芽。但無機氮源容易利用，有利于菌體迅速生長，所以在種子培養(yǎng)基中常包括有機及無機氮源。種子培養(yǎng)基的成分最好能較接近發(fā)酵培養(yǎng)基，這樣可使種子進入發(fā)酵培養(yǎng)基后能迅速適應(yīng)，快速生長。發(fā)酵培養(yǎng)基是供菌種生長、繁殖和合成產(chǎn)物之用。它既要使種子接種后能迅速生長，達到一定的菌絲濃度，又要使長好的菌體能迅速合成需產(chǎn)物。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除有菌體生長所必需的元素和化合物外，還要有產(chǎn)物所需的特定元素、前體和促進劑等。但若因生長和生物合成產(chǎn)物需要的總的碳源、氮源、磷源等的濃度太高，或生長和合成兩階段各需的最佳條件要求不同時，則可考慮培養(yǎng)基用分批補料來加以滿足。發(fā)酵培養(yǎng)基也可以叫做生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基或發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基。本發(fā)明中的培養(yǎng)基主要涉及種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，孢子培養(yǎng)基也可以使用與類似或相同的培養(yǎng)基配比對孢子進行培養(yǎng)。一般地，用于轉(zhuǎn)化植物甾醇為雄烯二酮的細菌營養(yǎng)培養(yǎng)基中應(yīng)該含有可同化的氮和碳，并在其中維持足夠補給量的無菌空氣，例如通過將培養(yǎng)基的大表面暴露于空氣中或使充足量的空氣通過培養(yǎng)基以支持深層生長。如果需要，可以加入磷酸鹽，鎂和/或亞鐵離子作為促生長因子；還可加入緩沖液以確保生長在基本中性的pH。開始時，消泡劑可能是有益的。當用于誘導(dǎo)發(fā)酵的是分離的細胞或酶而不是完整和生長的微生物時，不需要營養(yǎng)物質(zhì)的存在；但是無論是何種情形，培養(yǎng)基通常主要為含水的。在此使用的術(shù)語"植物甾醇"包括所有的甾醇并且沒有限制，例如谷甾醇，萊油甾醇，豆甾醇，菜籽甾醇(包括二氫菜籽甾醇)，鏈甾醇，chalinosterol，多孔甾醇，穿貝海綿甾醇，麥角甾醇，糞甾醇，科迪甾醇(codisterol)，異巖藻甾醇(isorucosterol)，巖藻甾醇，桐甾醇，神經(jīng)甾醇(nervisterol),7-烯膽甾烷醇，星魚甾醇，菠菜甾醇，chondrillasterol，peposterol，燕麥甾醇，異燕麥甾醇，fecosterol，Pollinastasterol，膽甾醇以及它們的所有天然或合成形式和衍生物，包括異構(gòu)體.并且包括它們所有的氫化對應(yīng)物("植物甾垸醇(Phytostanols)")。植物甾垸醇包括所有飽和或氫化的植物甾醇以及它們的所有天然或合成形式和衍生物，包括異構(gòu)體。當在說明書全文中存在疑問時，需要了解的是術(shù)語"植物甾醇"可包含植物甾醇和植物甾烷醇兩者。用于本發(fā)明生物轉(zhuǎn)化的甾醇和甾垸醇(stanols)可以通過許多種天然來源獲得。例如，它們可以從植物油(包括水生植物)的加工中獲得，所述植物油如玉米油和其它植物油，麥胚芽油，大豆提取物，大米提取物，米糠，菜籽油，向日葵油，芝麻油。它們也可以衍生自真菌，例如麥角甾醇。因此，本發(fā)明并不限于甾醇的任何一個來源.美國專利4,420，427中公開了使用溶劑如甲醇從植物油渣中制備甾醇。或者，植物甾醇和植物甾垸醇可以來自林業(yè)加工副產(chǎn)品妥爾油樹脂(talloilpitch)或制漿皂(pulpingsoap)，如美國專利5，770,749中所述，在此引入作為參考。本專利中AD(D)的意思是AD和/或ADD。在本發(fā)明中的發(fā)酵過程，可以將溶解于適宜溶劑中的或乳化形式的底物(植物甾醇組合物)和微生物培養(yǎng)物一起加入生物反應(yīng)器中。進行發(fā)酵直到達到最大底物轉(zhuǎn)化，即植物甾醇轉(zhuǎn)化為AD(D)。只要能促進植物甾醇底物在溶劑中混合，從而最優(yōu)化微生物培養(yǎng)物對底物的利用率，可以使用任何乳化劑。例如包括但并不局限于聚二醇的脂肪酸酯或乙烯氧基加成化合物和商品名為Tegin，Tween和Span的乳化劑?；蛘?，可以使用增溶劑溶解植物甾醇組合物以形成澄清溶液，從而提供與在生物轉(zhuǎn)化中所用微生物良好的接觸。所選的適宜的增溶劑包括二醇(glycol)類和硅氧垸類增溶劑，它們能使高濃度的植物甾醇被溶解于營養(yǎng)培養(yǎng)基中。這將使其與微生物良好接觸，減少發(fā)酵時間，并得到最終產(chǎn)物的相對高收率。優(yōu)選先前已知的增溶劑例如向日葵油、大豆油。這種適用于植物甾醇生物轉(zhuǎn)化為AD和ADD所涉及細菌的培養(yǎng)基，其包含玉米漿和無機鹽。而無機鹽為優(yōu)選硝酸鈉和磷酸銨，更優(yōu)選磷酸銨硝酸鈉為10:40-99。上述培養(yǎng)基優(yōu)選含有葡萄糖的種子培養(yǎng)基。上述所有培養(yǎng)基可以加入磷酸鹽、鎂和/或亞鐵離子、緩沖液，其中的一種或多種。上述所有培養(yǎng)基，其每升培養(yǎng)基含有玉米漿5-50ml。上述培養(yǎng)基，其每升培養(yǎng)基含有無機鹽4-10g。上述所有培養(yǎng)基，其每升發(fā)酵培養(yǎng)基含有葡萄糖5-15g。上述所有培養(yǎng)基，其每升培養(yǎng)基含有玉米漿5-50ml，無機鹽4-10g，葡萄糖5-15g。上述所有培養(yǎng)基，其特征在于使用這種培養(yǎng)基的細菌屬于分枝桿菌屬(Mycobacterium)或諾卡氏菌屬(Nocardia)，優(yōu)選分枝桿菌屬(Mycobacterium)。上述培養(yǎng)基如是種子培養(yǎng)基，則含有葡萄糖；上述培養(yǎng)基如是發(fā)酵培養(yǎng)基，則可以不含葡萄糖。在發(fā)酵方法中，優(yōu)選溫度維持在大約20-37°C的范圍內(nèi)，更優(yōu)選25-35'C。發(fā)酵期間pH的檢測顯示pH能在起始時大約7.0到收獲時大約4.5的范圍內(nèi)變化.發(fā)酵或轉(zhuǎn)化過程一旦完成，即用本領(lǐng)域已知和常規(guī)的方法回收AD(D)。具體實施例方式以下的實施例代表實驗室試驗.然而，每個都能使用已知的工業(yè)技術(shù)擴展用于工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用以實施本發(fā)明。以下的實施例中菌種中提到的NRRL是美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心(AgriculturalResearchServiceCultureCollection)的縮寫，該中心是國際菌種保藏機構(gòu)之一。下述實施例中的植物甾醇是從市場上購買的含量大于95%的產(chǎn)品。實施例1實施例1-a菌種分枝桿菌Mycobacteriumfortuitum.NRRLB-8153。取10個不同批號的玉米衆(zhòng)按照按照本實施例中的數(shù)量和工藝分別進行進行發(fā)酵。除玉米漿外其他的物料均為同一批物料。種子培養(yǎng)階段種子培養(yǎng)基(每升)40ml玉米漿5.2gNaN03，0.8gNH4H2P04653g葡萄糖其余為無菌水培養(yǎng)基量200ml/燒瓶接種物量每200ml新培養(yǎng)基接種來自瓊脂斜面的3m御胞懸液容器1000ml錐形瓶攪拌振蕩器(l"throw)200rpm溫度30°C生長時間72小時培養(yǎng)注解如果在底部有黃色細胞沉淀形成則表示為良好的培養(yǎng)物生物方法在培養(yǎng)基中制備用于生物轉(zhuǎn)化的接種物。從瓊脂料面(在玻璃試管中培養(yǎng))接種錐形瓶，在無菌條件下進行接種，移取無菌水(5mL)到瓊脂抖面上.用移液管末端輕輕刮下細菌培養(yǎng)物.然后移取該混懸培養(yǎng)物并放入錐形瓶中.在旋轉(zhuǎn)振蕩器上進行細菌增殖(200卬m,l"throw,30度)。在培養(yǎng)72小時后，此種子培養(yǎng)物即可轉(zhuǎn)移至生物反應(yīng)器中。在接種前對種子培養(yǎng)物長期儲存是不可取的。在操作中，還可以針對種子進行二級乃至三級培養(yǎng)，將種子培養(yǎng)好，當進入發(fā)酵培養(yǎng)基后發(fā)酵的時間可以適當延長，以獲得更好的生物'轉(zhuǎn)化率。甾體發(fā)酵培養(yǎng)基(每升)40ml玉米漿5.2gNaN03，0.8gNH4H2P04其余為無菌水底物30.0g植物甾醇(3.0%)乳化劑250ml向日葵油(25%)在使用前一天，必需量的玉米漿與水(100ml)混合并在錐形瓶中滅菌(12rC持續(xù)20分鐘)。在燒瓶或燒杯中混合水(500ml)和培養(yǎng)基組分(除植物甾醇和向日葵油以外)。用lMNaOH溶液(40g/LNaOH)調(diào)培養(yǎng)基的pH值至8.0，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至生物反應(yīng)器中，隨后加熱至60-70。C。在燒杯中稱重植物甾醇(30g)，加入向日葵油(250ml)，加熱邊攪拌混合物，直至油變澄清，將油中澄清的黃色植物甾醇溶液倒入生物反應(yīng)器中已加熱的液體培養(yǎng)基中(60-7(TC)，補無菌水至1L,無需攪拌。將發(fā)酵罐滅菌(12rC持續(xù)30分鐘)，然后冷卻至30。C。使用上述培養(yǎng)基3L。在發(fā)酵罐中使用分枝桿菌進行的生物轉(zhuǎn)化-在帶有有效底部攪拌的不鎊鋼發(fā)酵罐中進行生物轉(zhuǎn)化實驗。所用發(fā)酵罐的主要參數(shù)為發(fā)酵罐總體積10升，工作體積3升，接種物量0.4L，接種物培養(yǎng)時間72小時，通氣量0.3L/L/min，攪拌300rpm。將發(fā)酵罐中培養(yǎng)基的溫度調(diào)至3(TC，在無菌條件下加入接種物。整個過程在3(TC進行。從此階段開始到最后都監(jiān)測該過程的pH值和無菌度。40小時以后開始監(jiān)測底物(植物甾醇)和產(chǎn)物AD(D)。此過程中生物轉(zhuǎn)化混合物的pH值通常在lpH單位內(nèi)變化并未校正。通過分析(HPLC)2小時內(nèi)當泡沫層中的產(chǎn)物AD和ADD的總含量達到不變時，被認為已經(jīng)完成生物轉(zhuǎn)化，此是AD和ADD的總含量是表1中的含量。HPLC測定AD(D)與植物甾醇的比例發(fā)酵液用l，2-二氯乙垸抽提，減壓濃縮后稀釋適當倍數(shù)，10000r/min離心除去可能的不溶物，然后高壓液相層析色譜柱Alltima(4.6mm(內(nèi)徑)x250mm)5pm。流動相石油醚乙酸乙酯=6:4，流速1.0mL/min，溫度室溫，檢測波長240nm。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注表l中的批號是指不同的玉米漿批號。含量是指使用該玉米漿作為培養(yǎng)基發(fā)酵植物甾醇得到的AD和ADD的總含量。實施例l-b本實施例中的培養(yǎng)基以取10個不同批號Refiner糖蜜代替玉米槳,按照與實施例l-a中菌種、培養(yǎng)基的配比和工藝分別進行發(fā)酵。除玉米漿外其他的物料與實施例l-a均中為同一批物料。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注表2中的批號是指不同的Refmer糖蜜批號。含量是指使用該Refmer糖蜜作為培養(yǎng)基發(fā)酵植物甾醇得到的AD和ADD的總含量。本實施例中將Refiner糖蜜采取10個不同批號的產(chǎn)品，玉米漿也采用10個不同批號的產(chǎn)品。實施例2實施例2-a菌種分枝桿菌MycobacteriumspNRRL—B3683取10個不同批號的玉米漿按照按照本實施例中的數(shù)量和工藝分別進行發(fā)酵。除玉米漿外其他的物料均為同一批物料。種子培養(yǎng)階段種子培養(yǎng)基(每升)10ml玉米漿8.7gNaN03，0.3gNH4H2P0415g葡萄糖Na2HP04和NaH2P04的緩沖液調(diào)pH至7.0其余為無菌水培養(yǎng)基量200ml/燒瓶接種物量每200ml新培養(yǎng)基接種來自瓊脂斜面的3ml細胞懸液容器1000ml錐形瓶攪拌振蕩器(l''throw)200rpm溫度30°C生長時間72小時培養(yǎng)甾體發(fā)酵培養(yǎng)基(每升)10ml玉米漿8.7gNaN03，0.6gNH4H2P04Na2HP04和NaH2P04的緩沖液調(diào)pH至7.0其余為無菌水底物20.0g植物甾醇(2.0%)乳化劑200ml大豆油(20X)發(fā)酵方法同實施例1-a表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注表3中的批號是指不同的玉米漿批號。含量是指使用該玉米漿作為培養(yǎng)基發(fā)酵植物甾醇得到的AD和ADD的總含量。實施例2-b本實施例中的培養(yǎng)基以取10個不同批號Refmer糖蜜代替玉米漿,按照與實施例2-a中菌種、培養(yǎng)基的配比和工藝分別進行進行發(fā)酵。除玉米漿外其他的物料與實施例2-a均中為同一批物料。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注表4中的批號是指不同的Refiner糖蜜批號。含量是指使用該Refmer糖蜜作為培養(yǎng)基發(fā)酵植物甾醇得到的AD和ADD的總含量。本實施例中將Refiner糖蜜采取10個不同批號的產(chǎn)品，玉米漿也采用10個不同批號的產(chǎn)品。實施例3實施例3-a菌種分枝桿菌MycobacteriumspNRRL—B3805取10個不同批號的玉米漿按照按照本實施例中的數(shù)量和工藝分別進行進行發(fā)酵。除玉米漿外其他的物料均為同一批物料。種子培養(yǎng)階段種子培養(yǎng)基(每升)25ml玉米漿4gNaN03，lgNH4H2P04lgFeCl215g葡萄糖Na2HP04和NaH2P04的緩沖液調(diào)pH至7.0其余為無菌水培養(yǎng)基量200ml/燒瓶接種物量每200ml新培養(yǎng)基接種來自瓊脂斜面的3ml細胞懸液容器1000ml錐形瓶攪拌振蕩器(l，'throw)200rpm溫度30°C生長時間:72小時培養(yǎng)甾體發(fā)酵培養(yǎng)基(每升)25ml玉米漿4gNaN03，lgNH4H2P04lgFeCl2Na2HP04和NaH2P04的緩沖液調(diào)pH至7.0其余為無菌水底物35.0g植物甾醇(3.5%)乳化劑300ml向日葵油(30X)發(fā)酵方法同實施例1-a表5\^號含^\12345678910平均數(shù)±標準差A(yù)D+ADD(%)82.585.683.984.886.183.385.984.282.384.184.27±1.34注表5中的批號是指不同的玉米衆(zhòng)批號。含量是指使用該玉米漿作為培養(yǎng)基發(fā)酵植物甾醇10得到的AD和ADD的總含量。實施例3-b本實施例中的培養(yǎng)基以取10個不同批號Refiner糖蜜代替玉米漿,按照與實施例3-a中菌種、培養(yǎng)基的配比和工藝分別進行進行發(fā)酵。除玉米漿外其他的物料與實施例3-a均中為同一批物料。發(fā)酵方法同實施例l-a表6<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注表6中的批號是指不同的Refiner糖蜜批號。含量是指使用該Refmer糖蜜作為培養(yǎng)基發(fā)酵植物甾醇得到的AD和ADD的總含量。本實施例中將Refmer糖蜜采取10個不同批號的產(chǎn)品，玉米漿也采用10個不同批號的產(chǎn)品。實施例4實施例4-a菌種諾卡氏菌Nocardia.alienaMCI-0710(JP54067098,JP54067099中介紹)取10個不同批號的玉米漿按照按照本實施例中的數(shù)量和工藝分別進行進行發(fā)酵。除玉米漿外其他的物料均為同一批物料。種子培養(yǎng)階段種子培養(yǎng)基(每升)50ml玉米漿9.9gNaN03，lgNH4H2P040.3gMgCl212g葡萄糖Na2HP04和NaH2P04的緩沖液調(diào)pH至7.0其余為無菌水培養(yǎng)基量200ml/燒瓶接種物量每200ml新培養(yǎng)基接種來自瓊脂斜面的3ml細胞懸液容器1000ml錐形瓶攪拌振蕩器(l"throw)200rpm溫度30°C生長時間72小時培養(yǎng)甾體發(fā)酵培養(yǎng)基(每升)50ml玉米漿lgNH4H2P040.3gMgCI2Na2HP04和NaH2P04的緩沖液調(diào)pH至7.0其余為無菌水底物35.0g植物甾醇(3.5%)乳化劑300ml向日葵油(30X)發(fā)酵方法同實施例l-a表7<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注表7中的批號是指不同的玉米漿批號。含量是指使用該玉米漿作為培養(yǎng)基發(fā)酵植物甾醇得到的AD和ADD的總含量。實施例4-b本實施例中的培養(yǎng)基以取10個不同批號Refmer糖蜜代替玉米漿,按照與實施例4-a中菌種、培養(yǎng)基的配比和工藝分別進行進行發(fā)酵。除玉米漿外其他的物料與實施例4-a均中為同一批物料。發(fā)酵方法同實施例l-a表8<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注表8中的批號是指不同的Refiner糖蜜批號。含量是指使用該Refiner糖蜜作為培養(yǎng)基發(fā)酵植物甾醇得到的AD和ADD的總含量。本實施例中將Refiner糖蜜采取10個不同批號的產(chǎn)品，玉米漿也采用10個不同批號的產(chǎn)品。以上的4個實施例證明了使用玉米漿作為培養(yǎng)基對植物甾醇進行發(fā)酵得到AD(D)的收率更加穩(wěn)定，平均收率也更高。權(quán)利要求1.一種適用于植物甾醇生物轉(zhuǎn)化為AD和ADD所涉及細菌的培養(yǎng)基，其包含玉米漿和無機鹽。2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于無機鹽為硝酸鈉和磷酸銨。3.如權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于無機鹽中磷酸銨硝酸鈉為10:40-99。4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于是含有葡萄糖的種子培養(yǎng)基。5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基可以加入磷酸鹽、鎂和/或亞鐵離子、緩沖液，其中的一種或多種。6.如權(quán)利要求1至5中任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于每升培養(yǎng)基含有玉米漿5-50ml。7.如權(quán)利要求1至6中任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于每升培養(yǎng)基含有無機鹽4-10g。8.如權(quán)利要求1至7中任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于每升培養(yǎng)基含有玉米漿5-50ml，無機鹽4-10g。9.如權(quán)利要求1至8中任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于使用這種培養(yǎng)基的細菌屬于分枝桿菌屬或諾卡氏菌屬。10.如權(quán)利要求1至9中任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于使用這種培養(yǎng)基的細菌屬于分枝桿菌屬。全文摘要本發(fā)明提供了一種新型微生物培養(yǎng)基，用于采用節(jié)桿菌、分枝桿菌或諾卡式菌將植物甾醇生物轉(zhuǎn)化為AD和ADD的發(fā)酵過程中，含有玉米漿和無機鹽，優(yōu)選每升含有玉米漿5～50ml。采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基可以提高生物發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率。文檔編號C12N1/20GK101659928SQ200810054279公開日2010年3月3日申請日期2008年8月25日優(yōu)先權(quán)日2008年8月25日發(fā)明者亮孫,靜李,李金祿申請人:天津金耀集團有限公司