專利名稱：：中國地鼠微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種動(dòng)物DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，具體為一種中國地鼠微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記及其篩選方法。技術(shù)背景微衛(wèi)星(Microsatellite)又稱簡單序列重復(fù)(Simplesequencer印eats，SSR)，是指以少數(shù)幾個(gè)核苷酸(一般為1-6個(gè))經(jīng)多次重復(fù)單位組成的簡單多次串聯(lián)重復(fù)序列，如(CA)、(TG)n等，又被稱為短串聯(lián)重復(fù)序列，簡單序列重復(fù)其長度大多在lOObp以內(nèi)，廣泛分布在真核基因組中。微衛(wèi)星序列兩側(cè)有保守的DNA序列，根據(jù)其兩側(cè)的保守序列涉及引物，可用PCR擴(kuò)增出微衛(wèi)星位點(diǎn)的序列。由于微衛(wèi)星重復(fù)單元的重復(fù)的次數(shù)不同，因而擴(kuò)增出的微衛(wèi)星序列的長度呈現(xiàn)多態(tài)性。由于微衛(wèi)星序列具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性高、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)件、基因定位、遺傳關(guān)系分析、品種鑒定等領(lǐng)域。中國地鼠是源于中國的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。20世紀(jì)40年代末，Schwentker從我國取十對野生原種，僅數(shù)年，其后裔即遍及歐、美、日等國的一些主要實(shí)驗(yàn)室。1919年，我國學(xué)者謝恩增首次將中國地鼠引入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行醫(yī)學(xué)研究，用于肺炎球菌的檢定。其后，科學(xué)工作者相繼發(fā)現(xiàn)中國地鼠對黑熱病和許多致病性細(xì)菌以及病毒都有高度感受性，并且發(fā)現(xiàn)中國地鼠有自發(fā)性糖尿病遺傳傾向，可以建立成糖尿病模型。目前，中國地鼠已為細(xì)胞遺傳學(xué)、輻射遺傳學(xué)、實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤和分子生物學(xué)等許多領(lǐng)域所應(yīng)用，在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)研究中，占有重要的地位。常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳檢測的方法有形態(tài)學(xué)方法、免疫學(xué)方法、生物化學(xué)標(biāo)記方法等，如在國家標(biāo)準(zhǔn)中大小鼠遺傳檢測近交系用生化位點(diǎn)標(biāo)記基因的方法。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，分子遺傳標(biāo)記技術(shù)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳檢測中得以廣泛應(yīng)用，其中包括限制性酶切片段多態(tài)性標(biāo)記(RFLPs)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性標(biāo)記(AFLP)、微衛(wèi)星DNA標(biāo)記(MicrosatelliteDNA)、單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNPs)等。其中微衛(wèi)星DNA標(biāo)記多態(tài)性豐富，均勻分布于哺乳動(dòng)物基因組，檢測技術(shù)成熟，穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，可比性強(qiáng)，已成為目前動(dòng)物遺傳多樣性評估和遺傳監(jiān)測研究的首選標(biāo)記，但是這一源于我國的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源——中國地鼠的基因組等基礎(chǔ)資料報(bào)道甚少，其微衛(wèi)星標(biāo)記以及微衛(wèi)星標(biāo)記在中國地鼠分子遺傳學(xué)分析中的應(yīng)用尚屬空白，成為影響中國地鼠作為疾病模型進(jìn)一步深入研究的因素之一。開發(fā)微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記，為純系中國地鼠遺傳檢測及種質(zhì)資源保護(hù)、基因流動(dòng)、群體變異和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等許多工作提供研究手段；且將加速我國實(shí)驗(yàn)用中國地鼠的標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)。而且現(xiàn)有關(guān)于篩選微衛(wèi)星標(biāo)記的方法中，在提取出物種的基因組DNA后，需要將其打碎成各個(gè)基因片段進(jìn)行研究，目前通常的采用的方法是酶切法，其缺陷是對溫度和時(shí)間有一定要求，需要查找適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)。當(dāng)物種的全序列未知時(shí)，如果酶切位點(diǎn)不單一，酶切片段大小就很難控制，并且很難辨別所切割片段是否是自己所需片段；如果酶切位點(diǎn)處于某一類微衛(wèi)星的中間部分，則可能根本釣不出該類微衛(wèi)星。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明為了解決現(xiàn)在未見有關(guān)于中國地鼠微衛(wèi)星標(biāo)記的報(bào)道，以及現(xiàn)有篩選微衛(wèi)星標(biāo)記的方法中大都采用酶切法將物種DNA基因組打碎，存在上述缺陷的問題，提供一種中國地鼠微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記及其篩選方法。本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的中國地鼠微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記，所述微衛(wèi)星標(biāo)記的編號分別為Chm35、Chm93、Chml47、Chm79、Chml20、Chml62、ChmlO、Chml08、Chml15、Chml24、Chml34、Chml4、Chml40、Chm48、Chm54、Chm9、Chm91，上述17個(gè)微衛(wèi)星核苷酸序列及其兩端的引物序列如序列表所記載；微衛(wèi)星核苷酸序列兩端的引物的退火溫度分別為5rC、58°C、58°C、5rC、58°C、58。C、59°C、59°C、59°C、59°C、59°C、59°C、60°C、60°C、59。C、59°C、59。C。引物的退火溫度對PCR擴(kuò)增的結(jié)果有很大影響，如果退火溫度選擇不合理，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。在本發(fā)明所述的退火溫度下，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后的數(shù)據(jù)能為中國地鼠遺傳性的判定提供精確依據(jù)。篩選所述的中國地鼠微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記的方法，包括提取中國地鼠的DNA基因組，本發(fā)明的創(chuàng)新是對中國地鼠的DNA基因組釆用超聲波進(jìn)行打碎，使得超聲后的片段大小在500bp-1000bp之間。該方法只需要很少的時(shí)間，對溫度沒有特定要求，不用查閱酶切位點(diǎn)，而且由于是隨機(jī)切割，不會(huì)完全損害某一類微衛(wèi)星，只要控制功率和時(shí)間，片段大小就基本確定。本發(fā)明首先提取中國地鼠的基因組DNA，4'C冰箱保存?zhèn)溆茫蝗缓罄贸暡ù驍郉NA，電泳回收500-1000bp的DNA片段；構(gòu)建中國地鼠基因組微衛(wèi)星富集文庫，從構(gòu)建的微衛(wèi)星文庫中挑取陽性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行測序，后經(jīng)篩選得到17個(gè)多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星標(biāo)記，根據(jù)微衛(wèi)星重復(fù)序列兩側(cè)的保守側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，根據(jù)檢測數(shù)據(jù)及圖譜確定每個(gè)個(gè)體的基因型；當(dāng)采用多對引物來檢測中國地鼠的遺傳性時(shí)，數(shù)據(jù)更可靠、系統(tǒng)更穩(wěn)定，避免了采用一對引物檢測時(shí)，不能完全反映物種遺傳性的缺陷。本發(fā)明所述的中國地鼠微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記及篩選方法穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，可比性強(qiáng)，操作簡單，為中國地鼠遺傳檢測及種質(zhì)資源保護(hù)、基因流動(dòng)、群體變異和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等許多工作提供了研究手段，且將加速我國實(shí)驗(yàn)用中國地鼠的標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)。具體實(shí)施方式一、構(gòu)建中國地鼠基因組微衛(wèi)星富集文庫1、DNA提取(1)取中國地鼠尾巴組織，用剪刀剪碎，加入500nl裂解緩沖液，混勻，加入蛋白酶K至終濃度100L，混勻，于5(TC緩慢搖床消化過夜。(2)將溶液冷卻至室溫，加入等體積的Tris飽和酚，緩慢顛轉(zhuǎn)直至兩相混合成乳濁液。4'C13200/rpm離心IOmin，用lml槍頭緩慢將上清液移至另一離心管。(3)加入等體積的Tris飽和酚和氯仿，搖勻后4'C13200/rpm離心IOmin，將上清液移至另一離心管。(4)加入等體積的氯仿?lián)u勻后4°C13200/rpm離心10min，將上清液移至另一離心管。(5)加入1/10倍體積的醋酸鈉(PH5.2)及2倍體積的-2(TC無水乙醇，緩慢顛轉(zhuǎn)離心管，可見白色絮狀沉淀，用槍頭將DNA鉤出轉(zhuǎn)移到另一EP管。(6)剩余沒有沉淀的DNA放入-20'C冰箱中靜止2-3小時(shí)。(7)7(^乙醇洗滌DNA沉淀2次，最后100%乙醇洗滌，于室溫下風(fēng)干DNA(盡量避免完全風(fēng)干，否則很難溶解)。加入TE緩沖液或ddH20后，于4"C緩慢搖動(dòng)溶解儲存于4'C或-20'C備用。2、超聲波打碎基因組DNA(1)用純水清洗變幅竿頭，把離心管放入冰水混合物中，先用1%的鹽酸，再用O.1M的NaOH，接著用純水分別超聲一次2s，20%的功率，超聲2s，間隔ls。(2)準(zhǔn)備多個(gè)樣品備份以做梯度，分別超聲6s、8s、10s、12s把探頭伸入上述提取出的中國地鼠DNA溶液中，探頭應(yīng)在整個(gè)管子的中心，以使每個(gè)點(diǎn)的超聲波強(qiáng)度相等，從而使超聲后的DNA片段長度更集中。(3)電泳，看超聲后片段大小是否在500bp-1000bp之間。(4)將超聲后DNA放入65'C的溫水浴中，逐漸冷卻。3、DNA末端補(bǔ)平將超聲后的中國地鼠DNA溶液放入65°C水浴中緩慢冷卻，以使超聲過程中分開的雙鏈復(fù)性。由于超聲會(huì)造成DNA鏈的斷裂而形成粘末端，為了不影響DNA與接頭的連接，需要對其進(jìn)行末端補(bǔ)平從而形成平末端。把盛有上述混合液的EP管放入37'C水浴中溫浴lh。所用的補(bǔ)平體系如下表l所示，成分(composition)用量Oil)DNA320dNTP(lOmM)610XT4DNA聚合酶緩沖液40T4DNA聚合酶(7.9u4il)2ddH2032總體積4004、沉淀濃縮DNA和膠回收(1)向上述體系中加入40nl3M的NaAc和lm1-2(TC的無水乙醇，放入-2(TC冰箱中靜置30min;(2)離心，13000rpm，10min，(室溫，有利于DNA沉淀)，棄上清；(3)向沉淀中加入70%的乙醇，顛倒數(shù)次；(4)13000rpm，4'C離心5min;(5)棄上清，離心機(jī)甩一下，吸去上清，室溫靜置15min，以使酒精揮發(fā)干凈；(6)向管中加入60^UddH20溶解，3nl上樣電泳；(7)配置2%的瓊脂糖凝膠；(8)4'C恒溫電泳3h;(9)紫外下切500bplkbp的片段，稱重；(10)QIAquick試劑盒回收DNA。5、定量加linker關(guān)于linker與insert比例的計(jì)算方法5Q0x:=跳130bp2.5k在MgZ+和ATP存在下，T4DNA連接酶能催化載體分子的粘性末端與外源DNA的相同粘性末端連接成重組DNA分子。按照接頭與回收DNA100:l的比例，在10nl的反應(yīng)體系中加入回收DNA片段；將堿基互補(bǔ)的寡核苷酸A和磷酸化的寡核苷酸B等摩爾混合，98'C變性1min,60'C退火結(jié)合2min，冷卻至室溫形成具有平末端的接頭。采用雙鏈接頭2pl(5(^M)、10xT4DNA連接緩沖液lpl、T4連接酶Gu/pl)(購自Promega公司)1^1、總體積10p的體系，在14。C條件下連接16小時(shí)，70°C滅活15min。接頭序列為SNXForward5，-CTMGGCCTTGCTAGCAGMGC-3'SNXReverse3，-AAMGATTCCGGAACGATCGTCTTCGp-5，正向鏈的5'端帶生物素標(biāo)記，反向鏈的5'端帶磷酸根。6、雜交考慮到堿基互補(bǔ)配對和重復(fù)序列拷貝數(shù)起始堿基順序的差異，將同類重復(fù)兼并為一種重復(fù)代表，2-3堿基重復(fù)可以兼并為以下14種類型，14種探針如下表2:1.5，-biotin-ATAGAATAT(AT)12-3，；2.5，-biotin-ATAGAATAT(AG)12-3，3.5，-biotin-ATAGAATAT(AC)12-3，4.5，-biotin-ATAGAATAT(GC)12-3，5.5，-biotin陽ATAGAATAT(AAT)8-3'6.5，-biotin-ATAGAATAT(AAG)8-3，7.5，-biotin-ATAGAATAT(ACG)8-3'8.5，-biotin-ATAGAATAT(AAC)8-3，9.5，陽biotin-ATAGAATAT(ACT)8-3，10.5'扁biotin-ATAGAATAT(ATC)8-3，11.5，-biotin-ATAGAATAT(AGC)8-3，12.5，-biotin-ATAGAATAT(GCC)8-3，13.5'-biotin-ATAGAATAT(AGG)8-3，14.5，-biotin-ATAGAATAT(ACC)8-3，把上述DNA在96。C變性10min，迅速冰浴5min，分裝，分別加入Tm值相近的探針，以DNA16pl;HB緩沖液52)il(20xSSC);探針(luM)各2jil，ddH202化1:總體積100W的雜交體系，分別放入低于Tm值2。C的水浴中雜交6h以上，間隔搖動(dòng)；降低2'C重復(fù)雜交一次。7告隹,、田果(1)把上述雜交過的lOOnlDNA加入到盛磁珠的管中，加入20(Hi1HB雜交緩沖液，43'C搖床上搖動(dòng)3h，間隔震動(dòng)；(2)將離心管放在磁力架上lmin，用移液器吸棄HBbuffer;(3)加入200(jl2XSSC和0.ly。的SDS溶液，室溫下靜置5min，然后放在磁力架上lmin，棄上清；按照上述步驟并依次在45。C、60°C、9(TC重復(fù)三次。8、PCR擴(kuò)增把兩次雜交富集洗脫下來的單鏈DNA做PCR，采用5(V1反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)體系如下DNA34^1dNTP(10mM)5(J10xTaq聚合酶緩沖液5jtlTaqDNA聚合酶(5u/pl)1^1MgCl2(25mM)%U上游引物(10pM)0.4plddH200.6pl擴(kuò)增程序?yàn)?4'C預(yù)變性5min;94'C變性30s，62'C退火30s,72'C延伸45s,35個(gè)循環(huán)后72'C補(bǔ)齊7min，獲得雙鏈目的片段。PCR反應(yīng)結(jié)束后取3pl反應(yīng)液在2W瓊脂糖凝膠中電泳檢測。QIAGen試劑盒切膠回收純化PCR產(chǎn)物。電泳檢測結(jié)果。Qiaquick試劑盒膠回收，步驟同上。9、插入片段與載體的連接(1)外源DNA與載體的比例根據(jù)外源片段和載體的分子量大小，計(jì)算連接體系中需要加入的各DNA片段的含量，一般插入片段DNA分子摩爾數(shù)載體DNA分子摩爾數(shù)-38:l，(2)連接反應(yīng)體系(10nl)如下表3所示，成分(composition)用量(nl)回收DNA32XT4■LigationBuffer5pGEM-Tvector(50ng/nl)0.5PromegaTDNA連接酶(3u/jil)1ddH200.5終體積10(3)在PCR儀中4C連接過夜，然后70'C酶滅活15min。10、電轉(zhuǎn)化與涂板(1)從-80'C冰箱中取出感受態(tài)大腸桿菌放在冰上解凍；(2)將3(Hil解凍的感受態(tài)大腸桿菌轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，小心混勻和洗凈的電擊杯一起放在冰上預(yù)冷；(3)取3yl純化后的質(zhì)粒于預(yù)冷過的離心管中，小心混勻，冰上放置；(4)打開轉(zhuǎn)化儀，調(diào)至Manual，電壓調(diào)至2.lkv;(5)將上述混合物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷過的電擊杯中，輕輕混勻，使混合物均勻進(jìn)入電擊杯底部，一定要避免氣泡產(chǎn)生；(6)將電擊杯推入電轉(zhuǎn)化儀，按下piilse鍵，聽到短暫的蜂鳴聲，轉(zhuǎn)化時(shí)間為4.91113，然后向電擊杯中迅速加入lml的SOC液體培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞混勻后轉(zhuǎn)移到一滅過菌的EP管中；(7)37'C,120rpm復(fù)蘇lh(保菌見詳細(xì));(8)在超凈臺中取20nl復(fù)蘇后的菌液與180iil的S0C混合，在超凈臺中把涂布器用酒精燈燒一下，將上述混合物均勻涂布在涂有8(V1X-Gal,80filS0C，20^1IPTG的培養(yǎng)基上；(9)37t:溫箱中培養(yǎng)14h;(10)克隆培養(yǎng)到適當(dāng)大小后，挑取2X96個(gè)克隆于2個(gè)96孔板中，230rpm37'C培養(yǎng)過夜。二、含微衛(wèi)星序列的陽性克隆的篩選、測序及微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)1、質(zhì)粒提取(1)將菌液轉(zhuǎn)入深孔板中，室溫1000g離心lmin，棄上清；(2)向沉淀中加入200pl冰預(yù)冷的溶液I(溶液中己經(jīng)加入Rnase)重懸沉淀，室溫放置10min:(3)然后加入新鮮制備的溶液II200nl(0.4MNaOH，2Y。的SDS比例是1比1)輕輕顛倒混勻數(shù)次室溫下不超過5min;(4)然后各加入20(Vl冰預(yù)冷的溶液m,輕輕顛倒數(shù)次混勻，冰浴30min，4'C1300g離心20min收集上清；(5)向上清液中加入80%體積160^1的異丙醇，搖勻，離心1300rpra,20'C離心20min;(6)加入75%的酒精200^1,混勻，13000rpm，4'C，5min,棄上清，室溫下蒸發(fā)掉痕量酒精，用40plddH20溶解沉淀。2、測序(1)將上述準(zhǔn)備好的模板和384MIX按適當(dāng)比例混合在一起，封上膠墊，用滾軸壓緊，漩渦震蕩器上混勻，1000rpm4TC離心1分鐘。(2)PCR儀上進(jìn)行測序反應(yīng)。擴(kuò)增程序如下94'C預(yù)變性5min:95'C變性15s，50'C退火15s，60'C延伸lmin30s,共35個(gè)循環(huán)。(3)在熱循環(huán)后，待溫度降到10'C以下時(shí)，將PCR板取出，4'C離心，近1000rpm時(shí)停止，將PCR板取出甩一下；(4)向每孔中加入15nl的95。/6乙醇乙酸銨混合液；(5)封膠膜，在旋渦震蕩器上震蕩混勻，然后放入-2(TC冰箱中靜置20miii;(6)將PCR板取出，配平放入離心機(jī)，4°C，4300rpm離心30min;(7)離心后甩出孔中液體倒扣在吸水紙上，倒甩(待離心機(jī)轉(zhuǎn)到300rpm時(shí)按下STOP鍵,轉(zhuǎn)速不能過大，時(shí)間不能過長)；(8)將384PCR板取出，用連續(xù)加樣器向每孔加入75W的乙醇33nl;(9)封白膜，4。C，4300rpm，離心15min;(10)離心后將384PCR板取出，甩出孔中液體，倒扣在吸水紙上，倒甩，(待離心機(jī)轉(zhuǎn)到300rpm時(shí)，按下STOP鍵，時(shí)間不能過長，轉(zhuǎn)速不能太大)；(11)將PCR板取出，放入抽屜中避光靜置30min，至乙醇揮發(fā)干凈；(12)向每孔中加入甲酰胺溶液8pl，封膠膜；(13)放入離心機(jī)離心，等DNA完全溶解于甲酰胺后，上機(jī)測序，用phred/phrep/consed等軟件進(jìn)行拼接處理，篩選出135個(gè)含有微衛(wèi)星序列，然后又隨機(jī)挑選出40個(gè)含有微衛(wèi)星序列，用primer3.0設(shè)計(jì)引物。3、篩選具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物先用單個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR,后用混合DNA的PCR,用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)觀察多態(tài)性；根據(jù)PAGE結(jié)果，選取多態(tài)性好的引物并在正向鏈的5'端進(jìn)行藍(lán)色(FAM)熒光標(biāo)記。隨機(jī)選取48個(gè)個(gè)體，提取DNA并進(jìn)行定量，模板濃度稀釋為10ng/nl做PCR，上機(jī)熒光掃描，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理最終篩選出17對引物。經(jīng)過富集文庫構(gòu)建與對引物多態(tài)性的篩選，得到17對多態(tài)性較高的微衛(wèi)星引物，現(xiàn)對其引物序列，退火溫度，觀察雜合度與期望雜合度，多態(tài)信息含量等參數(shù)總結(jié)如下表4所示:表4<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>三、利用上述得到的中國地鼠微衛(wèi)星DNA標(biāo)記分析中國地鼠SYB1的遺傳相似性1、材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心培育的中國地鼠SYB1群體，隨機(jī)取24只地鼠作為研究對象，取尾巴組織作為實(shí)驗(yàn)材料。1.2基因組DNA的提取用常規(guī)酚氯仿方法提取中國地鼠基因組DNA，提取方法同前。1.3微衛(wèi)星PCR反應(yīng)所用微衛(wèi)星引物序列和退火溫度見表5。PCR反應(yīng)總體積為10pl，其中模板DNAl.Opl，上下游引物各1.0pl，10xbuffer0.^1，dNTP0.7^1，rTaq酶0.0^1，ddH205.42^1。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4。C5min，94°C30s，退火45s(根據(jù)不同引物采用不同的退火溫度，具體溫度見表24)，72°C45s，共35個(gè)循環(huán)，最后72'C20min。在每次PCR擴(kuò)增時(shí)，均設(shè)一個(gè)陰性對照，以ddH20為模板，其他條件均相同，以確定每次PCR過程中均不存在由于外源性DNA污染所產(chǎn)生的不真實(shí)的電泳條帶。取2til的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加2^上樣緩沖液混勻后，在2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，電泳緩沖液為lxTBE，電壓180V，電泳時(shí)間約為15min。1.4毛細(xì)管電泳取水平電泳有條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，進(jìn)行STR掃描，即毛細(xì)管電泳。純化的步驟如下(1)根據(jù)水平電泳的結(jié)果，移取35^1PCR反應(yīng)產(chǎn)物至一新的384孔板中；(2)每孔加入95%的乙醇乙酸銨混合液(30:1)，乙醇乙酸銨混合物與PCR產(chǎn)物的比例約為3:1，使乙醇的終濃度為70%，混勻放在-2(TC冰箱中冷卻20min;(3)4300rpm，4°C，離心30min;棄上清，倒扣在吸水紙上放入離心機(jī)倒甩至500卬m;(4)每孔加入33^70%的乙醇，混勻，4300rpm，4'C離心15min,倒扣在吸水紙上放入離心機(jī)倒甩至500rpm;(5)避光晾干，約20min。加入有內(nèi)標(biāo)GeneScanTM-500LIZTM(AppliedBiosystems，Inc.)的loadingbuffer(去離子甲酰銨)8^1，上機(jī)熒光掃描。21表5編號微衛(wèi)星引物序列退火溫度(。c)Chm35F:AGGCTGCTTCCTAAACCCAT951R:CTGGGAAGGCTGAACTCAAGChm93F:TCTGTGTGTCTGTGAATGCG58R:GGATGTAAGATGGCTCCGAAChml47F:CATCTGGGCTTTCAATGGAT58R:GCTCCCTAAATAACCCCCAAChm79F:AGGGGAGATCTTGGGTCAGT51R:AACATGGAGGAGCACAAACCChml20F:GATAGGAGGGAGCAAAAGGG58R:CCTGAGAGCCTCAGAGCAGTChml62F:TCTTCCCTTCACAACCCAAG58R:AGCAGTGCCCTTTGAAACATChmlOF:GGCTGGTGATTTCAATGGTT59R:GTTCTTAATGGATCTACCCTGGGACCChml24F:CAGATGCCCAAACTCTCTCC59R:GTTCTTGTCACCCCATGGACTACACC1.5數(shù)據(jù)處理1、熒光掃描結(jié)果用GeneMarkerV1.6(AppliedBiosystems，Inc.)進(jìn)行基因型判讀，用microchecker(VanOoseterhautetal.2004)，MStools(Park,S.D.E.，2001)檢査數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，用popgene計(jì)算SYBl個(gè)體間遺傳相似性。2、中國地鼠SYB1的遺傳相似性分析用p叩gene軟件計(jì)算SYB124個(gè)樣本間的Nei氏遺傳相似性，詳見表6，由表可知，24個(gè)樣本間的平均遺傳相似性為0.9195，遺傳距離為0.0805,進(jìn)一步說明該群體的遺傳形狀得到純化。此外，用上述方法還可以進(jìn)行中國地鼠品種分析、遺傳關(guān)系分析及標(biāo)記輔助育種等，重復(fù)性好，是一種比較可靠有效的分子標(biāo)記。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>序列表<110>山西醫(yī)科大學(xué)<120〉中國地鼠微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記及其篩選方法〈160>17<210>1〈211>903〈212〉DNA<213>中國地鼠(Cricetulusgriseus)〈220〉〈221>重復(fù)單元〈222>354…391〈400>1gctctcttgtgcatgaatttaccaaaactcaaaaaaatttctccaacaccgtcataccca60ttttctggaggtatagactgatctccacaaaaagtgaggaggtttgcctctttctagata120ggacaatgaagcttgctgttgcaacggggatgatgatgacc犯aaaaggggagagccagt180tggtgaatatgtaagaaaagtgtgaaggggcagccag卿gggatgggctggagtgttcei240ggctaaatatcaatttaggcaggctgcttcctaaacccatggctagtgttttatcactct300cctacctgttggcttgctgtcccctcctgaactctggtagcaaaatcaaaaaagtgtgtg360tgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtatgtgtgtaacaaatgcatgtgg鄉(xiāng)tca420caggataacacccaaggtcagttctctctaggatctggggcttgagttcagccttcccag480actgcacaggcacctctatcctatccactaagccataacgttggtctctag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