專(zhuān)利名稱(chēng)：一種牛卵母細(xì)胞體外成熟無(wú)血清培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種牛卵母細(xì)胞體外成熟無(wú)血清培養(yǎng)基。
技術(shù)背景動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是一種應(yīng)用最為廣泛的體外培養(yǎng)技術(shù)，該技術(shù)起源于19世紀(jì)。1885年科 學(xué)家把雞胚的神經(jīng)板在溫?zé)岬柠}水中成功地維持存活了若干天，是首次體外培養(yǎng)的嘗試。隨 著抗菌素、合成培養(yǎng)液、胰蛋白酶處理技術(shù)的發(fā)展以及器皿的改進(jìn)，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)得到 了飛速的發(fā)展。培養(yǎng)液的選擇和配制是體外培養(yǎng)技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 一般培養(yǎng)液由2部分 組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清。基礎(chǔ)培養(yǎng)基 自行配制或用現(xiàn)成的化學(xué)合成培養(yǎng)基，常用的化學(xué)合成培養(yǎng)基有Eagle (包括 BME、 MEM、 DME等)、FIO、 F12、 TCM199、 RPMI1640、 EBSS、 HBSS等等。這些化學(xué) 合成培養(yǎng)基具有適當(dāng)?shù)臐B透壓、能源、氨基酸、維生素、微量元素及緩沖pH值，可以滿(mǎn)足 許多類(lèi)型培養(yǎng)細(xì)胞的最基本的需要，它雖可維持細(xì)胞一段時(shí)間的存活，但由于缺乏細(xì)胞有絲 分裂所必需的各種激素和生長(zhǎng)因子，細(xì)胞不能在這類(lèi)相當(dāng)于平衡鹽溶液的體系中進(jìn)行分裂。 要想使細(xì)胞進(jìn)一步增生、生長(zhǎng)必須添加血清。血清可以提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的各種激素和生長(zhǎng)因子，目前已成為維持細(xì)胞有絲分裂不可缺 少的物質(zhì)。常用的血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、人血清和馬血清等。培養(yǎng)基中 血清的濃度范圍為5 20 %，以IO %濃度最為常用。但血清有一系列缺點(diǎn)，特別是它的易 變性和非限定性，給實(shí)驗(yàn)工作帶來(lái)了難以精確定量和難以重復(fù)等困難。因此，盡管它的應(yīng)用 已有相當(dāng)長(zhǎng)久的歷史，但決不是理想的培養(yǎng)基成分。20世紀(jì)60年代利伯曼和奧維等首先進(jìn)行了無(wú)血清培養(yǎng)的嘗試，經(jīng)山根、佐藤春太郎等 科學(xué)家的研發(fā)， 一些無(wú)血清培養(yǎng)基(又稱(chēng)無(wú)血清限定培養(yǎng)基或簡(jiǎn)稱(chēng)限定培養(yǎng)基)已經(jīng)在一些 細(xì)胞培養(yǎng)中開(kāi)始使用。這類(lèi)培養(yǎng)基主要以各種激素(如胰島素、各種前列腺素、生長(zhǎng)激素等)、 生長(zhǎng)因子(如表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生 長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、MSA等)、維生素、載 體蛋白如轉(zhuǎn)鐵蛋白(銅藍(lán)蛋白等)、微量元素(鎘、硒等)、乙醇胺以及貼壁與展開(kāi)因子(如昆 布氨酸、纖維網(wǎng)素等)取代含血清培養(yǎng)基中的血清部分。這樣，不但排除了血清的干擾，而 且，還可以在更接近體內(nèi)的條件下維持細(xì)胞的功能和活力。山根等發(fā)現(xiàn)，不同組織學(xué)類(lèi)型的 細(xì)胞所需要的活性物質(zhì)完全不同，而不同動(dòng)物的同一組織學(xué)類(lèi)型的細(xì)胞所需要的活性物質(zhì)則 極為類(lèi)似，僅在量上有所區(qū)別。據(jù)此，他們提出"組織定型專(zhuān)一培養(yǎng)基"的概念，以圖設(shè)計(jì)出專(zhuān)一地適用于各種細(xì)胞類(lèi)型的無(wú)血清培養(yǎng)基?？梢灶A(yù)料，由于無(wú)血清培養(yǎng)基的發(fā)展，許多有 關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)的生物學(xué)研究工作將由定性研究進(jìn)展到定量研究。隨著奶牛業(yè)的發(fā)展，牛的胚胎工程也發(fā)展迅速，體外大規(guī)模生產(chǎn)胚胎成為可能。但是體 外生產(chǎn)的胚胎，胎牛體形偏大，常常造成難產(chǎn)，給生產(chǎn)造成巨大的損失，嚴(yán)重制約著牛胚胎 體外生產(chǎn)和胚胎移植的產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步向前發(fā)展。大量研究表明，培養(yǎng)液內(nèi)添加血清是造成牛胎 兒肥大綜合癥的主要因素之一。 一些印跡基因調(diào)控著胎兒的體重，如Igf2,H19和Igf2r等 基因，而血清對(duì)印跡基因正常表達(dá)有著不利影響。在早期胚胎發(fā)育中發(fā)現(xiàn)，這些基因在無(wú)血 清培養(yǎng)胚胎的mRNA豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于含血清培養(yǎng)的胚胎，可見(jiàn)血清影響了這些基因的正常轉(zhuǎn)錄。 所以用含有血清培養(yǎng)基生產(chǎn)的胚胎，移植后出生的個(gè)體往往是體重偏大。此外，血清中一些 成份不利于胚胎基因的正常表達(dá)，進(jìn)而影響胚胎進(jìn)一步發(fā)育，造成體外胚生產(chǎn)牛胎妊娠率和 產(chǎn)犢率低。盡管血清可以提供體外卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但它的副作用也是不 容忽視的。用含有血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)卵母細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)脂滴增多，線粒體數(shù)量下降，嚴(yán) 重地影響受精后胚胎的脂肪和能量新陳代謝，干擾了胚胎發(fā)育過(guò)程基因正常表達(dá)，致使胚胎 的質(zhì)量下降，所以用含有血清培養(yǎng)液生產(chǎn)的胚胎，其妊娠率和產(chǎn)犢率有所降低。'另外在一些特定實(shí)驗(yàn)情況下，如需觀察一種生長(zhǎng)因子對(duì)某種細(xì)胞的作用，這時(shí)很難排除 血清中生長(zhǎng)因子的干擾作用。血清含有蛋白成分誘導(dǎo)細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中分泌某種物質(zhì)(抗體、 生長(zhǎng)因子)，這些產(chǎn)物和血清內(nèi)的蛋白成分影響了卵母細(xì)胞的正常生長(zhǎng)發(fā)育。總之，無(wú)血清培養(yǎng)劑這一新技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)方面應(yīng)用的前途是無(wú)限廣闊的，它不僅有 利于探討和闡明細(xì)胞體外培養(yǎng)生理、生化和成分生物合成等一系列問(wèn)題，而且一些生產(chǎn)中問(wèn) 題得以解決，將可以為防病治病做出很大的貢獻(xiàn)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)血清對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的缺陷，提供一種牛卵母細(xì)胞體外成熟無(wú)血清培 養(yǎng)基IVMBM-I，不僅有利于闡明培養(yǎng)基成分對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育的作用，也能克服目前牛胚胎 生物工程中存在的一些問(wèn)題。一種牛卵母細(xì)胞體外成熟無(wú)血清培養(yǎng)基IVMBM-I ，包括TCM199培養(yǎng)基、卵母細(xì)胞成 熟的激素和抗菌藥，其特征在于還添加有如下成分Sodium pyruvate, Taurine, Insulin, Selenium, BSA， HEPES， TGF-a, L-Glutamine和EGF，且不含有血清。'上述添力口成分的濃度為 0.91 Sodium pyruvate, 5mM Taurine, 51(ag/ml Insulin, 5nM Selenium, lmg/tnl BSA， 5mM HEPES， lOng/ml TGF-a， lmmol/ml L-Gutamine和10ng/ml EGF。所述卵母細(xì)胞成熟的激素為10pg/ml FSH (Follicle-stimulating Hormone)和l^g/ml LH(Luteinizing Hormone) ， 1 jiig/ml Estradiol 。所述抗菌藥為0.0625g Penicillium和0.05g Streptomycin。Sodium pyruvate是細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的碳源，同時(shí)作為能量被卵母細(xì)胞利用，提高卵母細(xì)胞 整體發(fā)育水平。另外，丙酮酸可生成丙氨酸，因?yàn)樗梢耘c氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)相結(jié)合，故在氮代 謝方面也起著重要的作用。添加L-Glutamine能促進(jìn)各種氨基酸進(jìn)入細(xì)胞膜，它所含的氨基是核酸中嘌呤和嘧啶的 來(lái)源，也是能量和碳的來(lái)源，參與蛋白質(zhì)和核酸代謝，卵母細(xì)胞需要L-Glutamine來(lái)合成核 酸和蛋白質(zhì)，促進(jìn)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂。EGF是一種多肽的生長(zhǎng)因子。促進(jìn)低分子量化合物從細(xì)胞外主動(dòng)運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，改善細(xì) 胞發(fā)育環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞的核、質(zhì)成熟。BSA是一種清蛋白，參與卵母細(xì)胞的蛋白代謝，為細(xì)胞成熟提供N源。HEPES穩(wěn)定培養(yǎng)液的酸堿度。Insilin促進(jìn)卵母周?chē)念w粒細(xì)胞增生、分化和雌二醇的分泌，增強(qiáng)顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞 物質(zhì)和信息的交流。TGF-a是一種細(xì)胞因子，促進(jìn)顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)，參與細(xì)胞代謝調(diào)控，促進(jìn)DNA的合成， 在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起著重要作用。Taurine具有抗氧化作用，提高細(xì)胞的活力，誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生新的遺傳物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。 Selenium參與清除細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化物，防止產(chǎn)生自由基，具有抗氧化作用，防止細(xì)胞凋亡。本發(fā)明通過(guò)添加上述成分替代常規(guī)用血清，并通過(guò)體外成熟、體外受精以及體外發(fā)育實(shí) 驗(yàn)證明上述成分的添加能完全替代血清在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中所起的作用，避免了血清中一 些成分對(duì)卵母細(xì)胞的不利影響。針對(duì)含有血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)卵母細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)脂滴增多，線粒體數(shù)量下降的情況， 在本發(fā)明無(wú)血清培養(yǎng)基中，我們添加向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)離子的轉(zhuǎn)鐵蛋白(TGF-a)，調(diào)節(jié)葡萄糖攝取 量的胰島素(Insulin)和作為脂類(lèi)和其他生長(zhǎng)因子的載體的蛋白質(zhì)(BSA)，改善卵母細(xì)胞內(nèi)能 量和脂肪代謝代謝，減少胞質(zhì)內(nèi)脂滴形成，提高線粒體的數(shù)量，促進(jìn)卵母細(xì)胞正常生長(zhǎng)發(fā)育。我們用上述功能清楚的試劑代替血清，使一些印跡基因正常表達(dá)，減少胎兒肥大綜合癥 的發(fā)生，避免奶牛生產(chǎn)中難產(chǎn)問(wèn)題，有助于體外胚胎生產(chǎn)向產(chǎn)業(yè)化方向進(jìn)一步發(fā)展。總之，這種無(wú)血清培養(yǎng)基能為卵母細(xì)胞提供一個(gè)營(yíng)養(yǎng)成分完全且平衡的環(huán)境。上述添加 成分均為標(biāo)準(zhǔn)試劑，其成分含量標(biāo)準(zhǔn)均能較好的控制，可達(dá)到生物潔凈要求，質(zhì)量穩(wěn)定，具有 很好的重復(fù)性，而血清是動(dòng)物試劑能造成疾病傳播，特別對(duì)胚胎基因的表達(dá)有著嚴(yán)重的影響，因此本發(fā)明培養(yǎng)基能精確定量，又能克服血清對(duì)胚胎發(fā)育的不利影響。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。1. 主要儀器設(shè)備C02培養(yǎng)箱、恒溫臺(tái)、視體顯微鏡、水浴鍋、恒溫箱、超凈臺(tái)、天平、容量瓶。2. 牛卵母細(xì)胞體外成熟從屠宰場(chǎng)收集卵巢。用加有雙抗25'C生理鹽水，在3小時(shí)之內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。用注射器 抽取卵巢上2-7mm大的卵泡，在體視解剖鏡下挑選包有幾層顆粒細(xì)胞、胞質(zhì)均勻一致的卵母 細(xì)胞復(fù)合體(COCs)用于體外成熟培養(yǎng)，在體外成熟24小時(shí)，以排出極體為成熟標(biāo)志。IVMBM- I培養(yǎng)液組成TCM199+10(xg/ml FSH (Follicle-stimulating Hormone)十l嗎/ml LH(Luteinizing Hormone)+l|ag/ml Estradiol十0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin,添力口成分 有0.91 Sodium pyruvate,5mM Taurine, 51嗎/ml Insulin,lmg/mlBSA, 5mM HEPES， 10ng/ml TGF-a, lmmol/ml L-Glutamine禾卩10ng/ml EGF禾口 5nM Selenium 。對(duì)照組培養(yǎng)液(TCM199+血清)TCM199+10%FCS(Fetal Calf Se腿)+10pg/ml FSH (Follicle-stimulating Hormone)+ ljag/ml LH(Luteinizing Hormone)+l|_ig/ml Estradiol十(X0625g Penicillium+0.05g Streptomycin表1.應(yīng)用IVMBM-1培養(yǎng)液牛卵母細(xì)胞體外成熟的效果培養(yǎng)液 重復(fù)次數(shù) 卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞復(fù)合體數(shù) 成熟率％IVMBM- I 8 729 80.4%(586/729)a對(duì)照組(TCM199+血清) 8 947 82.3% (780/947)a注1.在同一列內(nèi)有不同上標(biāo)字母的差異顯著(PO.005)3. 成熟的卵母細(xì)胞體外受精受精液是BO液，精子濃度為到1.5xl(^個(gè)/ml。受精20小時(shí)，然后移入CRlaa液中發(fā)育 培養(yǎng)。CRlaa液為CRl +l%NEAA(Non-essential Amino Acids) +1%EAA (Essential Amino Acids) +4mg/ml FAF-BSA(Fatty Acid Free-Bovine Serum Albumin)。在第3天檢查卵裂率，在第7天 記錄囊胚表2.成熟的卵母細(xì)胞受精及其胚胎體外發(fā)育效果培養(yǎng)液重復(fù)次數(shù)成熟的卵母細(xì)胞數(shù)嘗 橫 《囊胚率％IVMBM- I643680.5%(351/436)a30.9%(135/436)a對(duì)照組(TCM199+血清)652981.9%(433/529)a31.8%(168/529)a注1.在同一列內(nèi)有不同上標(biāo)字母的差異顯著(P<0.005)總之，通過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明IVMBM-1能使牛卵母細(xì)胞體外成熟達(dá)到80%以 上，與對(duì)照組(含血清的培養(yǎng)劑)沒(méi)有顯著的差異。成熟的卵母細(xì)胞體外受精后，卵裂率和 囊胚率與含血清組沒(méi)有顯著差異，表明IVMBM- I培養(yǎng)基用于牛卵母細(xì)胞體外成熟是可行的。
權(quán)利要求
1、一種牛卵母細(xì)胞體外成熟無(wú)血清培養(yǎng)基IVMBM-I，包括TCM199培養(yǎng)基、卵母細(xì)胞成熟的激素和抗菌藥，其特征在于還添加有如下成分Sodium pyruvate，Taurine，Insulin，Selenium，BSA，HEPES，TGF-a，L-Glutamine和EGF，且不含有血清。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛卵母細(xì)胞體外成熟無(wú)血清培養(yǎng)基IVMBM- I ，所述添加成 分的濃度為0. 91 Sodium pyruvate, 5mM Taurine, 51jig/ml Insulin, 5nM Selenium, lmg/ml BSA， 5raM HEPES， 10ng/ml TGF-a， lmmol/ml L-Glutamine和10ng/ml EGF。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛卵母細(xì)胞體外成熟無(wú)血清培養(yǎng)基IVMBM-I ，所述卵母細(xì) 胞成熟的激素為10嗎/mlFSH和l|ag/mlLH， Vg/ml Estradiol。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛卵母細(xì)胞體外成熟無(wú)血清培養(yǎng)基IVMBM- I ，所述抗菌藥 為0.0625g Penicillium和0.05g Streptomycin。
全文摘要
本發(fā)明涉及“一種牛卵母細(xì)胞體外成熟無(wú)血清培養(yǎng)基”，屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。一種牛卵母細(xì)胞體外成熟無(wú)血清培養(yǎng)基IVMBM-I，包括TCM199培養(yǎng)基、卵母細(xì)胞成熟的激素和抗菌藥，其特征在于還添加有如下成分Sodium pyruvate，Taurine，Insulin，Selenium，BSA，HEPES，TGF-a，L-Glutamine和EGF，且不含有血清。本發(fā)明通過(guò)添加上述成分替代常規(guī)用血清，并通過(guò)體外成熟、體外受精以及體外發(fā)育實(shí)驗(yàn)證明上述成分的添加能完全替代血清在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中所起的作用，避免了血清中一些成分對(duì)卵母細(xì)胞的不利影響，且能精確定量，具有很好的重復(fù)性。
文檔編號(hào)C12N5/075GK101225373SQ200810056639
公開(kāi)日2008年7月23日 申請(qǐng)日期2008年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月23日
發(fā)明者吳亦芳, 晶 安, 張向利, 張家新, 張紅霞, 海 王, 王玉忠, 趙孟彬 申請(qǐng)人:北京錦繡大地農(nóng)業(yè)股份有限公司