專利名稱：：編碼IER5的SiRNA的DNA序列及其載體和應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥基因工程領域，具體地說涉及編碼特異性沉默IER5基因的SiRNA的DNA序列及其載體和應用。技術背景RNA干擾(認Ainterference,RNAi)是指內源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導的細胞內mRNA發(fā)生特異性降解，從而導致靶基因的表達沉默，產(chǎn)生相應的功能表型的缺失現(xiàn)象。RNAi是一種從低等生物到哺乳動物都有的保守的防御機制。雙鏈RNA在細胞內被Dicer切成約19-22nt的小片段干擾RNA(SiRNA)進而形成Si認A-蛋白復合物(SiRNP)，SiRNA通過識別、降解具有同源序列的mRNA最終導致特異性的基因表達沉默(genesilencing)(LiuJY等.J.SectionGenetForeignMedSci，2004:27(1):4-10.〕。因此，RNA干擾技術近年來日益受到人們的重視。SiRNA技術正在逐步應用在基因功能研究、細胞信號轉導途徑分析、冗余基因的確定、藥物開發(fā)中耙標驗證、基因治療、病毒感染、癌癥和顯性遺傳病治療等都有廣泛的用途。目前治療腫瘤的方法主要有三種，分別為外科手術、化療與放射治療，其中放射治療約占這些腫瘤治療的27%左右。細胞的輻射效應與細胞的輻射敏感性和臨床上腫瘤放射治療有關。在臨床上，輻射敏感性已成為提高腫瘤放療效果的一個重要因素，這種輻射敏感性與輻射敏感基因有關。與輻射有關的早期反應基因IER5(ImmediateEarlyResponse5，簡稱為IER5，中文名稱為早期反應基因5)，人的該基因位于1號染色體上lq25.3處，全長2369bp;而鼠的該基因也是位于1號染色體上181.5CM處，長度為2123bp。目前有關IER5的研究主要有IER5基因序列(WilliamsM等.Genomics,1999，55:327-334)、在睡眠與清醒狀態(tài)下在大腦中IER5基因表達(CirelliC等.Brainresearch,2000，885:303-321)、輻射對IER5基因表達的影響(TundeE等.InternationalJournalofradiationoncologybiologyandphysics,2006:1506-1514.;TachiiriS等.InternationalJournalofRadiationOncologyBiologyandPhycics，2006，64:272-279)等。LongXH等研究發(fā)現(xiàn)輻射后IER5基因有高表達現(xiàn)象(LongXH等.IntJMolMed.2007Apr;19(4):607-15)。i兌明IER5有可能與輻射敏感性有關，這種敏感性可用于對耐腫瘤輻射敏感藥物的開發(fā)。
發(fā)明內容本發(fā)明的第一個目的在于提供編碼特異性沉默IER5基因的SiRNA的DNA。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種含有能穩(wěn)定表達上述DNA的載體，優(yōu)選地，載體是Psilencer""3.1-HIhygro-SiRNA。本發(fā)明的第三個目的在于提供含有上述載體的宿主細胞，優(yōu)選地，宿主細胞是HeLa，更優(yōu)選地，宿主細胞是IER5-SiRNA-HeLa，其已于2008年1月11曰保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.2338。本發(fā)明的第四個目的在于提供一種提高腫瘤細胞輻射抗性的組合物，其含有上述編碼SiRNA的DNA、含有上述DNA的載體以及含有該載體的宿主細胞，優(yōu)選地，組合物是藥物組合物。本發(fā)明的第五個目的在于提供上述編碼SiRNA的DNA、含有上述DNA的載體以及含有該載體的宿主細胞在制備提高腫瘤細胞的輻射抗性藥物中的應用，優(yōu)選地腫瘤細胞是宮頸癌細胞。本發(fā)明的第六個目的在于提供上述編碼SiRNA的DNA、含有上述DNA的載體以及含有該載體的宿主細胞在制備治療腫瘤藥物中的應用，優(yōu)選地腫瘤是宮頸癌。為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案。一種編碼特異性沉默IER5基因的SiRNA的DNA，所述DNA的核苷酸序列是選自下列(a)或(b)的核苷酸序列(a)IER5-27:正義鏈5，-GATCCGCCTCATCAGCATCTTCGGTTTCAAGAGAACCGAAGATGCTGATGAGGTTTTTTGGAAA-3'(SEQIDNo.1);反義鏈5，-AGCTTTTCCAAAAAACCTCATCAGCATCTTCGGTTCTCTTGAAACCGAAGATGCTGATGAGGCG-3，(SEQIDNo.2);(b)IER5-16:正義鏈5'-GATCCGCTGCATAAGAACCTCCTGTTCAAGAGACAGGAGGTTCTTATGCAGCTTTTTTGGAAA-3，(SEQIDNo.3);反義鏈5，-AGCTTTTCCAAAAAAGCTGCATAAGAACCTCCTGTCTCTTGAACAGGAGGTTCTTATGCAGCG-3，(SEQIDNo.4)。含有上述DNA的載體，優(yōu)選地是含有上述DNA序列的Psilencer3.l-Hlhygro-SiRNA載體。其按照如下方法構建將特異性沉默IER5基因的編碼SiRNA的DNA序列能夠插入載體中形成發(fā)夾SiRNA插入片段，然后與Psilence^3.l-Hlhygro載體連接，構建得到Psilencer3.1-HIhygro-SiRNA表達載體；所述插入片段包含有21個堿基對的SiRNA作用片段、一個環(huán)(loop)、3'端突出兩個堿基以及在兩端的BamHI和HindIII酶切位點。含有上述載體的宿主細胞，優(yōu)選地該宿主細胞是HeLa細胞。按照如下方法構建能穩(wěn)定抑制基因IER5表達的HeLa細胞采用陽離子脂質體LipofectamineM2000將上述Psilencer3.1-HIhygro-SiRNA載體導入Hela細胞株中，然后通過潮酶素B進行篩選，挑選單克隆細胞培養(yǎng)并檢測抑制IER5基因的m脂A的水平，得到穩(wěn)定表達SiRNA功能的細胞系。更優(yōu)選地，該宿主細胞是IER5-SiRNA-HeLa，于2008年1月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.2338。一種提高腫瘤細胞輻射抗性的組合物，其含有上述DNA、或含有上述載體、或者含有所述的宿主細胞中的至少一種為活性成分，優(yōu)選地該組合物是藥物組合。該藥物組合物除了上述活性成分外，還含有藥學上可接受的載體或賦形劑。上述DNA、含有上述DNA的載體、或者含有該載體的宿主細胞用于制備提高腫瘤細胞輻射抗性的藥物，優(yōu)選地腫瘤細胞是宮頸癌細胞。上述DNA、含有上述DNA的載體、或者含有該載體的宿主細胞用于制備治療腫瘤的藥物，優(yōu)選地腫瘤是宮頸癌。上述編碼特異性沉默IER5基因的SiRNA的DNA序列的篩選過程為首先在NCBIGeneBank獲得人的IER5全mRNA序列，編號為畫一016545，全長2369bp,其編碼區(qū)序列為(CDS,codingsequence)位于4021385。在相應的SiRNA設計網(wǎng)站(http:〃雨.ambion.com/techlib/misc/siRNA—finder,html)上進行初步設計和篩選。在篩選中設定GC含量不超過50%。耙序列在IER5mRNA中位置太靠前或太靠后都會影響其抑制效果。通過上述網(wǎng)站所設計出的具有SiRNA功能的可能耙序列為(1)1ER5-27-SiRNA-Sequence5'-GCCTCATCAGCATCTTCGGTT-3';3'-TTCGGAGTAGTCGTAGAAGCC-5';(2)IER5-16-SiRNA-Sequence5'-GCTGCATAAGAACCTCCTGTT-3':3'-TTCGACGTATTCTTGGAGGAC-5'。然后根據(jù)耙序列設計出編碼SiRNA的DNA序列，這種DNA序列分別為(1)IER5-27:正義鏈5'-GATCCGCCTCATCAGCATCTTCGGTTTCAAGAGAACCGAAGATGCTGATGAGGTTTTTTGGAAA-3'(SEQIDNo.1);反義鏈5'-AGCTTTTCCAAAAAACCTCATCAGCATCTTCGGTTCTCTTGAAACCGAAGATGCTGATGAGGCG-3'(SEQIDNo.2);(2)IER5-16:正義鏈5'-GATCCGCTGCATAAGAACCTCCTGTTCAAGAGACAGGAGGTTCTTATGCAGCTTTTTTGGAAA-3'(SEQIDNo.3);反義鏈5'-AGCTTTTCCAAAAAAGCTGCATAAGAACCTCCTGTCTCTTGAACAGGAGGTTCTTATGCAGCG-3，(SEQIDNo.4)。本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果(i)、本發(fā)明提供r兩對能有效地抑制IER5基因的表達的編碼SiRNA的DNA序列；(2)構建了能穩(wěn)定表達IER5-27-SiRNA與IER5-16-SiRNA功能的載體；(3)本發(fā)明轉染成功獲得含有抑制IER5基因的SiRNA功能的單克隆細胞系IER5-SiRNA-HeLa;該細胞系屬于單克隆，RNA干擾效率高，能有效抑制IER5基因的表達，同時使具有SiRNA同源序列的基因表達沉默而不影響其它基因的功能，所以該細胞系特異性強，無毒副作用；該細胞系為人類揭示IER5基因的生物學功能及了解該早期反應基因的有關信號轉導途徑等研究提供了實驗細胞，可用于對該基因有關的潛在藥物開發(fā)與其反應連鎖基因的研究，以及宮頸癌的放療與藥物研發(fā)。圖1質粒載體PsilencerTM3.1-H1hygro的結構示意圖。圖2正常HeLa細胞與IER5-SiRNA-HeLa細胞的生長曲線圖。圖3正常Hela細胞與IER5-SiRNA-HeLa細胞輻射敏感性實驗曲線圖。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)實驗條件如Sambrook等人，分子克隆，實驗手冊(第三版)(NewYork:coldSpringharborLaboratorypress,2002)中所述的條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。實施例1:篩選編碼IER5基因的SiRNA的DNA序列利用網(wǎng)絡資源以及軟件對IER5基因進行生物信息學分析，檢索NCBIGeneBank得到IER5基因RNA全序列，選擇編碼區(qū)作為SiRNA設計的靶序列。在相應的SiRNA設計網(wǎng)站(http:〃爾.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)上進行初步設計與篩選，找出具有SiRNA功能的可能耙序列與其對應編碼SiRNA的DNA序列。然后將所選定的正義序列和反義序列與GeneBank(http:〃www.Ncbi.nlm.nih.gov/blast/)中已知同物種的基因序列進行比較，排除那些和其它編碼序列或EST同源的序列，排除反義鏈的5'端連續(xù)8個堿基與其它基因配對的潛在編碼SiRNA的DNA序列。排除任何一段連續(xù)14個堿基與其它基因配對的潛在編碼SiRNA的DNA序列。最終獲得3對編碼SiRNA的DNA序列。根據(jù)它們在網(wǎng)絡設計結果中排列的順序進行命名，分別命名為SiRNA-12(其序列見序列表SEQIDNo.5(正義鏈)和SEQIDNo.6(反義鏈))、SiRNA-16(其序列見序列表:SEQIDNo.3(正義鏈)和SEQIDNo.4(反義鏈))、SiRNA-27(其序列見序列表SEQIDNo.1(正義鏈)和反義鏈SEQIDNo.2(反義鏈)。其中編碼SiRNA-12的DNA序列如下(1)正義鏈5'-GATCCGCAGATGGAGTTCAAGCTGTTCAAGAGACAGCTTGAACTCCATCTGCTTTTTTGGAAA-3'(SEQIDNo.5)(2)反義鏈5'-AGCTTTTCCAAAAAAGCAGATGGAGTTCAAGCTGTCTCTTGAACAGCTTGAACTCCATCTGCG-3'(SEQIDNo.6)其對應的SiRNA耙序列為5'-GCAGATGGAGTTCAAGCTGTT-3'3,-TTCGTCTACCTCAAGTTCGAC-5'陰性對照的DNA序列為(1)正義鏈5'-GATCCCACTACCGTTGTTATAGGTGTTCAAGAGACACCTATAACAACGGTAGTTTTTTTGGAAA-3';(2)反義鏈3，-GGTGATGGCAACAATATCCACACGTTCTCTGTGGATATTGTTGCCATCAAAAAAACCTTTTCGA-5'。實施例2:構建帶有編碼特異性沉默IER5基因的SiRNA的DNA的載體下面以編碼IER5-27Si腿的DNA序列、編碼IER5-16SiRNA的DNA序列、編碼IER5-12SiRNA的DNA序列為例，說明該載體的構建方法，包括如下步驟1、合成Si脂A的DNA序列將實施例1中所述的IER5-27Si脂A、IER5-16SiRNA、IER5-12SiRNA3對編碼SiRNA的DNA序列送到Invitrogen公司合成。2、退火將Invitrogen公司合成的正義鏈與反義鏈序列退火為互補雙鏈。(1)溶解將上述合成的正義鏈和反義鏈分別用雙蒸水溶解，使其終濃度為lug/ul;(2)在0.2ml的EP管屮加入下列樣品，組成10ul反應體系正義鏈0.4ul反義鏈0.4ul退火緩沖液9.2ul(3)退火將編號分別為IER5-12TB、IER5-16TB、IER5-27TB的0.2mlEP管(每管含10ul上述(2)中樣品)在9(TC加熱3分鐘，然后在37。C，60分鐘進行退火。3、酶切(1)試劑Psilencer3.1-HIhygro(0.363ug/ul)，購自Ambion公司Hindni及其緩沖液NEBuffer2，購自NEB公司BamHI及其緩沖液NEBuffer2BamHI購自NEB公司BSA雙蒸水(2)第一次酶切載體①構建100ul反應體系Psilencer3.l-Hlhygro10ulBSAlulHindIII酶切緩沖液10ulHindIII2ul雙蒸水77ul②將上述成分加入1.5mlEP管中，混合后離心。在37。C中酶切4小時，反應終止后置于-2(TC中保存?zhèn)溆?。③純化采用博大泰克公司的純化試劑盒，具體操作如下。1)將上述反應液移入一干凈1.5mlEP管中，向該管中加入500ul混合液PB;2)將混合液移入離心吸附柱，并套入2ml收集管中；10000rpm離心lmin;離心后倒掉收集管中的液體(可將過柱液重復上柱離心，提高DNA回收率)；3)加入600ul漂洗液PW，10000rpm離心lmin;離心后倒掉收集管中的液體；4)室溫下，將離心吸附柱在13000rpm離心2min;5)將離心吸附柱放入干凈的離心管中；加入50ul，6(TC的雙蒸水到中央吸附膜上；靜放2min，溶解DNA。以10000rpm離心lmin。再將過柱洗脫液重加到吸附膜上。以13000rpm離心lmin(洗脫DNA到蒸餾水中)。6)將離心管內已提純的DNA放入-2(TC冰箱內保存，并用1%瓊脂糖電泳檢測其純度。(3)第二次酶切載體①構建100ul反應體系HindIII酶切純化后產(chǎn)物40ulBSA(1%)lulBamHI緩沖液10ulBamHI2ul雙蒸水47ul將上述成分加到1.5mlEP管中，混合均勻，離心。在37。C下BamHI酶切4小時，反應終止后置于-2(TC保存。②純化用步驟(2)中③的方法進行純化。4.(1)將退火產(chǎn)物稀釋10倍取lul退火產(chǎn)物加9ul雙蒸水，分別標注為12.10X、16.10X、27.10(2)加樣①取3支0.2mlEP管，分別標注12.Lig、16.lig、27.Lig;取1支0.2mlEP管，標注對照。②向標注為12.Lig、16.lig、27.Lig的3個0.2mlEP管內加入下列物質:上述(1)稀釋過的退火產(chǎn)物lul經(jīng)酶切純化后的載體lulIOX連接緩沖液lulT4DNA連接酶(Promega)lul雙蒸水6ul③向用于做對照的0.2mlEP管內加入下列物質1XPCRBufferlul經(jīng)酶切后純化的載體lulIOX連接緩沖液lulT4DNA連接酶lul雙蒸水6ul④將加好的樣品放到14-37°C(16。C左右)中靜置8h，反應終止后置于-20°。冰箱中保存。5.轉化(1)前期操作在冰上用DH5a感受態(tài)細胞(購自博大泰克公司產(chǎn)品)。①將冰上融化的感受態(tài)細胞50ul和上述連接產(chǎn)物(目的DNA)3-5ul—起混合，輕輕地混勻。②將其冰浴30min(最好全插在碎冰上)。③在42'C水浴中熱激90s。④快速冰浴2-3min使細胞冷卻。⑤向每個EP管中加入500ulLB培養(yǎng)基(不含抗生素)，并混勻。⑥置于恒溫震蕩器(培英牌THZ-C恒溫震蕩器)200轉/分鐘，37°C，培養(yǎng)lh，使細菌復蘇。⑦鋪板將上述EP管內容物混勻(離心后去一部分上清，余下約60nl，可涂小LB瓊脂培養(yǎng)板；lOOul，可涂大LB瓊脂培養(yǎng)板)。取lOOul已轉化的感受態(tài)細胞加到含相應抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)板(直徑約60mm)，用玻璃鋪板器將細胞均勻涂開，待板子上液體吸收后倒置該培養(yǎng)板，再將其置于37°C，培養(yǎng)16h。(2)挑菌培養(yǎng)16h后會發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)板的LB瓊脂上出現(xiàn)多個直徑約1mm左右的白色菌群斑點。用移液器的槍頭挑出后溶于lOul水中(挑周圍噬菌體少的菌斑)，本實驗有27號、16號、12兮與對照4個LB瓊脂培養(yǎng)板。每板上菌斑取10-20個10ul水中，用于PCR模板，電泳檢測有無所需要的條帶。(3)PCR實驗①PCR實驗體系H206.6ul10XPCRBufferluldNTP0.8ul上游引物0.2ul(ml3f通用序列GTTTTCCCAGTCACGAC)下游引物0.2ul(對應于各個編碼SiRNA的DNA序列的反義鏈)Tag酶(Promega)0.2ul模板(挑出溶在水中的菌)lul②PCR實驗條件1)32個循環(huán)，10ul體系/樣品2)反應條件94。C變性5min,94°C/20s，退火溫度59°C/20s，延伸72°C/30s，32個循環(huán)，最后72。C7min;(4)電泳檢測①配瓊脂糖凝膠②將PCR實驗后的樣品5ul與3ulLoadingbuffer混合，加于膠孔中，最后在新膠孔中加入5ul的marker。③60-100v電壓下進行電泳。④紫外燈下觀察條帶。成功第一次挑菌的樣品27-1至27-13;第二次挑菌的樣品16-2、16-3。5.搖菌(1)將PCR用去lul后所余下的9ul樣品加到含有5000ulLB培養(yǎng)基(含氨芐抗生素)中，搖菌過夜，37°C，200轉/分恒溫震蕩器中。(2)第二天若培養(yǎng)基變混濁，說明搖菌成功。(3)將搖好的菌存到1.5mlEP管中，加入甘油(甘油與菌液比例為l:1)，混合后放在-2(TC冰箱中待測序。6.測序將樣品送給測序公司7.提取待轉染的質粒DNA若測序成功，采用提取DNA試劑盒，按照試劑盒的說明對樣品進行處理(1)10000rpm離心5min，去上清。(2)加入250ul溶液I，充分混合，轉移到l.5mlEP管中。(3)加入250ul溶液I1，輕輕倒轉4次(放置時間t《5min)。(4)加10ul堿性P酶，輕輕倒轉4次，室溫放置5min。(5)加入350ul溶液in，立即倒轉混勻4次。(6)室溫下13000rpm離心10min，過吸附柱純化。(7)將離心后的上清移入吸附柱內，采用離心機最大轉速室溫離心lmin，棄上清液。(8)加入750ul溶液IV(使用前加入35ul95%的乙醇)，采用離心機最大轉速，離心lmin，棄上清液。(9)加入750ul溶液IV，再洗一次吸附柱，采用離心機最大轉速，離心lmin，棄上清液。(10)將吸附柱移入一干凈的1.5mlEP管中，加入100ul無核酸酶的水，在室溫采用離心機最大轉速離心2min，回收質粒DNA，即帶有特異性沉默IER5基因的SiRNA功能的載體——Psilencer3.1_H1hygro-SiRNA，共構建了3個帶有SiRNA序列的載體，包括IER5-27-SiRNA，然后放在-2(TC冰箱中保存?zhèn)溆?。實施?:檢測所構建的載體將實施例2所構建的質粒載體送到北京Irwitrogen公司進行測序分析。質粒測序的結果如下(1)樣品編號16-2(16表示該質粒來源于編碼IER5-16Si脂A的DNA序列，2表示由該序列構建的第2號樣品)質粒的測序結果見SEQIDNo.7所示，編碼IER5-16SiRNA的DNA序列正確插入了質粒載體。(2)樣品編號27-8(27表示該質粒來源于編碼IER5-27SiRNA的DNA序列，8表示由該序列構建的第8號樣品)質粒的測序結果見SEQIDNo.8所示，所得質粒載體序列中含有正確的編碼IER5-27SiRNA的DNA序列。(3)樣品編號27-12(27表示該質粒來源于編碼IER5-27SiRNA的DNA序列，12表示由該序列構建的第12號樣品)質粒的測序結果見SEQIDNo.9所示，所得質粒載體的序列中含有正確的IER5-27編碼SiRNA的DNA序列。(4)樣品編號27-10(27表示該質粒來源于IER5-27編碼SiRNA的DNA序列，10表示由該序列構建的第10號樣品)質粒的測序結果見SEQIDNo.10所示，所得質粒載體的序列中含有正確的編碼IER5-27SiRNA的DNA序列。測序結果表明由IER5-12-SiRNA構建的載體，經(jīng)過測序得知未帶有編碼IER5-12SiRNA的DNA序列或者說與IER5-12-SiRNA的DNA序列不吻合。而含有編碼IER5-27SiRNA的DNA序列與編碼IER5-16SiRNA的DNA序列的Psilencer3.1-HIhygro-SiRNA表達載體結果正確，說明獲得了含有編碼IER5-27-SiRNA和1ER5-16-Si腿的DNA序列的Psilencer3.1-HIhygro-SiRNA表達載體(見圖1)。實施例4:轉染HeLa細胞將實施例2所得到的帶有編碼IER5-27-SiRNA、IER5-16-SiRNA、IER5-12-SiRNA的DNA序列的六種載體轉染人正常Hela細胞建立單克隆細胞系'(l)在實驗前一天將Hela細胞(人的宮頸癌細胞，購自軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所)用胰酶消化到6孔板上，密度在2X105左右。(2)將4ug質粒溶到90ulOpti-MEM(無血清)培養(yǎng)基中。對于實施例2中的6種質粒1、2、3、4、5、6(6號為對照組)，所需要加入的體積分別為29.6ul、28.6ul、22.9ul、20.Oul、20.Oul、20.0ul與20ul。(3)將12ulLipofectamineM2000試劑加入到Opti-MEM(無血清)培養(yǎng)基中。(4)將上述步驟(2)、(3)中的液體輕輕混合，最好同點滴入與微微輕彈混合的方法，放置15-20min(共180ul)。在期間，將實驗前一天鋪板的6孔板的細胞進行換液，換成Opti-MEM(無血清)培養(yǎng)基(每孔量為lml)。(5)將步驟(4)中的混合液輕輕地滴加到6孔板中，放回培養(yǎng)箱放置6h，之后向每個孔中換液，換成lml含血清的DMEM培養(yǎng)基。(6)第二天觀察細胞狀態(tài)，若長滿則需要傳代。到第三天消化并接種在25cm2培養(yǎng)瓶中，用含有潮酶素和血清的DMEM培養(yǎng)基進行篩選12-15天(加入潮酶素的量可以采用依次遞增的辦法，在前兩次潮酶素的量為10ul，后三次為20ul，最后加到30lil進行篩選)，再挑選出已形成的陽性單克隆。若培養(yǎng)皿內有細胞生長的空間，可不消化，直接在培養(yǎng)皿內篩選細胞。(7)最后對各個型號轉染成功的單克隆細胞進行培養(yǎng)，并保存。實施例5:檢測SiRNA對Hela細胞中IER5基因的抑制效果細胞轉染成功后，通過檢測轉染細胞的mRNA水平，了解各個SiRNA片段對細胞中的IER5基因的抑制效果。具體操作如下(1)轉染細胞的總mRNA的提?、俎D染細胞常規(guī)培養(yǎng)達到生長期時收集，在超凈臺中消化下細胞，轉入離心管，棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗再離心后加入適量的Trizol。②將混合液轉移到DEPC處理過的1.5ml離心管中(若不馬上提取，可放入-70。C冰箱中凍存)。③按lmlTrizol加入0.2ml氯仿的比例加入氯仿，用手迅速劇烈搖動15s，室溫放置2-3min，然后4。C，12000rgf，離心15min。④將上清轉移到另一個新的1.5ml離心管屮(離心后溶液分層，分成底層酚-氯仿、中間層和上層水相，RNA僅存在水相中)。⑤按lmlTrizol加入0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，混合均勻，室溫放置10min。⑥離心4°C，12000rgf，離心10min。⑦小心棄去上清，加入lml75%乙醇。⑧離心4°C，7500rgf，離心5min。小心棄去75%乙醇，超凈臺吹干10min⑩RNA溶于16-20ulDEPC水中，使RNA完全溶解。(2)總mRNA濃度分析與純度鑒定從上述(1)提取的RNA中各吸取lul，稀釋至100ul后，利用紫外光光度計分別測定其在260nm、280nm波長處的吸光度(OD26。、OD28。)。兩者比值在1.8-2.0之間時，說明提取的RNA純度較好，符合下一步實驗要求。(3)逆轉錄合成cDNA鏈以2ug總RNA為模板轉錄cDNA。逆轉錄體系為20ul。具體操作依據(jù)反轉錄試劑盒(Invitrogen公司)的說明書。(4)RealTimePCR測試IER5的SiRNA轉染hela細胞的抑制效果測試IER5基因mRNA水平采用7300real-timePCRsystem儀器，反應循環(huán)次數(shù)為40次，反應體系為20ul，反應條件為50.0TV2min(主要是通過UNG酶消化測試樣品中殘留的RNA)、95.0°C/10min(主要用于UNG酶滅活與使摸板變性)、95.0。C/15s、60.0。C/lmin(退火與延伸溫度都是60。C，總時間為lmin)。測試數(shù)據(jù)的處理為該儀器自有的7300systemSDSsoftware。設計了測試引物，其人的引物序列如表l如示，其中P-actin為內參基因。表1real-timePCR測試的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>檢測轉染細胞1號、2號、3號、4號、5號以及陰性對照序列轉染的6號細胞m認A水平，此外對照組的數(shù)據(jù)為該儀器測試actin的參考測量值，該實驗獨立測試三批樣品，其測試結果如表2。表2:轉染細胞系的IER5基因mRNA表達結果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>將6號細胞的mRNA值定為定為1，則轉染細胞l號、2號、3號、4號、5號的mRNA值就分別為2—1。824、2i2站、2—14392、2—97。s、2—9115。結果(見表3)可以看出這6種細胞中，IER5的mRNA水平表達最高的是對照組6號，相對于對照組6號，1-5號細胞中的IER5的mRNA水平表達都有顯著性的下降，其中，表達量最低的是2號，其次是3號、l號、4號、5號。其中1號、2號、3號、5號來源于IER5-27-SiRNA;而4號來自于IER5-16-SiRNA，6號為陰性對照組，來源于隨機設計的一個沒有干擾作用與人基因組無關的小分子(不會影響IER5基因的表達)。陰性對照序列如下1)正義鏈5，-GATCCCACTACCGTTGTTATAGGTGTTCAAGAGACACCTATAACAACGGTAGTTTTTTTGGAAA-3'2)反義鎮(zhèn)3，-GGTGATGGCAACAATATCCACACGTTCTCTGTGGATATTGTTGCCATCAAAAAAACCTTTTCGA-5'該實驗結果說明上述設計的編碼IER5基因SiRNA的DNA序列以及由此構建的質粒對IER5基因均有抑制表達的作用，抑制效果最好的屬于2號轉染細胞系，命名為IER5-SiRNA-HeLa。將其在2008年1月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物巾心，保藏編號為CGMCCNo.2338。實施例6:IER5-SiRNA-HeLa細胞對輻射的敏感性利用姬姆薩(Giemsa)染色法計算不同劑量Y射線對正常HeLa細胞與轉染HeLa細胞的集落克隆形成率。(l)將對數(shù)期的這兩種細胞(正常Hela細胞與實施例5中IER5-SiRNA-HeLa細胞(CGMCCNo.2338))按照2Gy、4Gy的輻射劑量(將未照射細胞作為對照組)進行Y射線照射。各個劑量點與細胞個數(shù)如表3所示。表3細胞輻射敏感性實驗方案樣品類型細胞與DMEM培養(yǎng)基的體積(單位ml)細胞個數(shù)輻射Hela細胞IER5-SiRNA-HeLa細胞(CGMCCNo.2338)0.5Gy+0.2ml0.5Gy+0.2ml0.22000,5Gy0.5Gy+0.4ml0.5Gy+0.4ml0.44000.5GylGy+0.2mllGy+0.2ml0.2200lGy1Gy+0.4mllGy+0.4ml0.4400lGy2Gy+0.4ml2Gy+0.4ml0.44002Gy2Gy+0.8ml2Gy+0.8ml0.88002Gy4Gy+lml4Gy+lml110004Gy<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>照射后的細胞與未照射細胞立即接種一定數(shù)量的細胞于60mm直徑的培養(yǎng)皿(添加DMEM培養(yǎng)基至3ral)，每個劑量組3個皿，置于37。C，5%0)2孵箱中培養(yǎng)12天。(2)采用PBS洗2次，甲醇固定10-15min，用吉姆薩(Giemsa)染色過夜；待處理、涼干后進行培養(yǎng)皿的底部圖象掃描，變成b卿為后綴的圖像文件；(3)利用人工進行細胞克隆數(shù)計數(shù)(計數(shù)條件為大于50個細胞的單克隆)，計算出細胞存活率。對每種細胞，該細胞輻射敏感性實驗獨立進行各3次。(4)對細胞集落計數(shù)結果進行數(shù)學統(tǒng)計處理，結果如圖2所示。根據(jù)多種劑量的輻射后細胞集落克隆形成率發(fā)現(xiàn)IER5-SiRNA-HeLaCGMCCNo.2338細胞集落克隆形成率明顯高于正常的Hela細胞，說明抑制IER5基因的表達可提高細胞的輻射抗性，誘導增加IER5基因的表達會提高細胞輻射的敏感性。實施例7輻射對Hela和IER5-SiRNA-HeLa細胞增殖的影響1.細胞培養(yǎng)'在C02細胞培養(yǎng)箱內采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)正常Hela細胞與實施例5巾的IER5-SiRNA-HeLaCGMCCNo.2338細胞。細胞生長面積接近細胞培養(yǎng)瓶90%時，將培養(yǎng)瓶放到超凈臺上進行操作。2.接種細胞與細胞計數(shù)首先棄去培養(yǎng)基，采用胰酶消化，再加入3ml的DMEM培養(yǎng)基終止胰酶對細胞的消化。10000rpm離心3mirv之后在超凈臺中棄去上清，再加入5ml的培養(yǎng)基，用刻度吸管吹打均勻后取0.3ml進行細胞濃度的計數(shù)。采用計數(shù)板在顯微鏡上進行。根據(jù)計數(shù)得出的細胞濃度算出15000個細胞對應的體積量。如果第一次計數(shù)得出的細胞濃度很大，可采用細胞再次稀釋與計數(shù)的的辦法，再算出15000個細胞對應的體積量，用于后續(xù)的實驗。采用滅菌的移液器將15000個細胞的體積量加在6孔板的各個孔內。對于每種細胞，設立未照射組、2Gy輻射組、4Gy輻射組，每次實驗每組要鋪兩塊六孔板，共做3次獨立實驗。在鋪板后第2天進行輻射組的細胞照射，在照射后次曰開始進行每天固定時間的細胞計數(shù)。首先在超凈臺內用滅菌的移液器將6孔板中一個孔的培養(yǎng)基吸出，加入0.5ml的胰酶進行消化。待完全消化后加DMEM培養(yǎng)基至2ml，混合均勻后取0.3ral進行顯微鏡下計數(shù)，同時將該6孔板重新放回培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。通過對0.3ml的細胞濃度的計數(shù)與計算，再根據(jù)一孔細胞總體積(2ml)算出該孔中細胞的總數(shù)。每天對一種細胞的一類實驗要做兩個孔的細胞計數(shù)。這樣連續(xù)6天對6孔板內的細胞分別進行計數(shù)與每孔內的總細胞數(shù)的計算。3.對細胞增殖數(shù)據(jù)的處理對于人正常Hela細胞與IER5-SiRNA-HeLaCGMCCNo.2338細胞增殖數(shù)據(jù)進行雙因素的統(tǒng)計分析，結果如圖3所示。從圖3可看出，兩者之間具有顯著性差異，IER5-Si脂A-HeLaCGMCCNo.2338細胞生長明顯比HeLa生長快，即使在2Gy、4Gy的Y射線輻射下，也具有這種特性。這一特性暗示IER5基因具有減緩HeLa生長的作用，IER5基閔表達抑制可增強細胞的增殖能力。序列表〈110>首都醫(yī)科大學中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所〈120〉編碼IER5的SiRNA的DNA序列及其載體和應用<160>11〈170>Patentlnversion3.3〈210〉1<211>64〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉編碼IER5基因的SiRNA的DNA序列<■〉1gatccgcctcatcagcatcttcggtttcaagagaaccgaa.gatgctgatgaggttttttg60g朋a64<210〉2〈211〉64<212〉醒〈213〉人工序列<220〉〈223〉編碼IER5基因的SiRNA的DNA序列的反義鏈<400〉2agcttttccaaaaaacctcatcagcatcttcggttctcttgaaaccgaagatgctgatga60ggcg64〈210><211>〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉〈400>363DNA人工序列編碼IER5基因的SiRNA的DNA序列3gatccgctgcataagaacctcctgttcaagagacaggaggttcttatgcagcttttttgg6063〈210〉<211〉〈212〉<213〉<220〉〈223〉〈400>463■人工序列編碼IER5基因的SiRNA的DNA序列的反義鏈4agcttttccaaaaaagctgcataagaacctcctgtctcttgaacaggaggttcttatgca60gcg63<210〉5<211〉63〈212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<223>編碼IER5基因的SiRNA的DNA序列〈400〉5gatccgcagatggagttcaagctgttcaagagacagcttgaactccatctgcttttttgg60aaa63〈210>6<211>63〈212>腦A〈213〉人工序列<220〉<223>編碼IER5基因的SiRNA的DNA序列的反義鏈〈400〉6agcttttccaaaaaagcagatggagttcaagctgtctcttgaacagcttgaactccatct60gcg63<210>7〈211〉1200〈212〉DNA<213>人工序列<220〉〈223〉IER5-16插入載體的序列〈400〉7tatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatgtctttggattt60gggaatcttataagttctgtatgagaccactcggatccgctgcataagaacctcctgttc120aagagacagaggttcttatgcagcttttttggaaaagcttggcgtaatcctggtcataac180tggttcctgggggaaattggtatccgctcacaattccacacaacatacgaaccggaagca240ta朋gtgg33agcctggggtggctaatgggtgagctaactcacattaattgggttgcgct300cactggccgctttccagtccggaaacctggcctggcagctgcattaatgaatcggccaac360gcgcgg卿gaggcggtttgggtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgg420tgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggt480tatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaagggcagcaaaagg540ccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacg600鄧catcaca3aaatcgacgctcaagtcagaagtggcgaaacccgacaggactataaagat660accaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgctta720ccggatacctgtxcggctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgct780gtaagtatctccagttcggtgtaggtcggtcgctccagctgggctgtggggcacgaaccc840ccgttcagcccgacgctgcgcttatccggtaactatcgtcttgagtcacccggtaagaac900gactatcgccactggcagcagcactgtacagatagcagagcgagtatgtagcgtgctacg960agtctgagtgtggctactacgctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgct1020gagccagtactcgggaaagagtgtagctcctggatcggcaacaacacaccgctggtgacg1080gtgggttttgttgcggacagcgatatccgcccgacaagacttcacgagatccctggacca1140tccagggctggactctgtacgcgacctcgcttagaggtgatgtctcgcgatgtcgtacca1200〈210〉8〈211〉993〈212〉薩<213〉人工序列<220〉<223〉IER5-27插入質粒載體的序列〈400〉8tttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatgtctttggatttgg60<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>agagaaccgaagatgctgatgaggttttttggaaaagcttggcgtaatcatggtcatagc180tgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagCCgg鄉(xiāng)C3240taaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgct300cactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaac360gcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgc420tgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggt480tatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaagg540ccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacg600agtatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagat660accaggcgtttccccctgaaatctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgctta720ccggatacctgtcccgcctt740〈210〉10<211〉660〈212〉DNA<213〉人工序列〈220〉〈223〉IER5-27-SiRNA插入質粒載體后序列<400〉10tttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatgtctttggatttgg60gaatcttataagttctgtatgagaccactcggatccgcctcatcagcatcttcggtttca120agagaaccgaagatgctgatgaggttttttggaaaagcttggcgtaatcatggtcatagc180tgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagca240taaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgct300cactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggcca.ac360gcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgc420tgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggt480tatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaagg540ccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacg600agtatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagat660權利要求1、一種編碼特異性沉默IER5基因的SiRNA的DNA，其特征在于所述DNA的核苷酸序列是選自下列(a)或(b)的核苷酸序列(a)IER5-27正義鏈5’-GATCCGCCTCATCAGCATCTTCGGTTTCAAGAGAACCGAAGATGCTGATGAGGTTTTTTGGAAA-3’；反義鏈5’-AGCTTTTCCAAAAAACCTCATCAGCATCTTCGGTTCTCTTGAAACCGAAGATGCTGATGAGGCG-3’；(b)IER5-16正義鏈5’-GATCCGCTGCATAAGAACCTCCTGTTCAAGAGACAGGAGGTTCTTATGCAGCTTTTTTGGAAA-3’；反義鏈5’-AGCTTTTCCAAAAAAGCTGCATAAGAACCTCCTGTCTCTTGAACAGGAGGTTCTTATGCAGCG-3’。2、含有權利要求1所述DNA的載體。3、按照權利要求2所述的載體，其特征在于該載體是Psilencer3.1-H1hygro-Si醒。4、含有權利要求2或3所述載體的宿主細胞。5、按照權利要求4所述的宿主細胞，其特征在于所述的宿主細胞是1ER5-Si謹-HeLa，其保藏編號為CGMCCNo.2338。6、一種提高腫瘤細胞輻射抗性的藥物組合物，其特征在于含有權利要求1所述的DNA、或權利要求2或3所述的載體、或者權利要求4或5所述的宿主細胞中的至少一種。7、權利要求1所述的DNA在制備提高腫瘤細胞的輻射抗性藥物中的應用。8、按照權利要求7所述的應用，其特征在于所述的腫瘤是宮頸癌。9、權利要求1所述的DNA在制備治療宮頸癌藥物中的應用。10、權利要求4或5所述的宿主細胞在制備治療宮頸癌藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種編碼能特異性沉默IER5基因的SiRNA的DNA序列及其載體，以及在制備提高腫瘤細胞的輻射抗性藥物和治療宮頸癌藥物中的應用。其DNA序列分別命名為IER5-27和IER5-16。并將這兩對DNA序列克隆到Psilencer^TM3.1-H1hygro載體上，以及轉染獲得單克隆細胞系IER5-SiRNA-HeLa。本發(fā)明可有效地抑制IER5基因的表達；本發(fā)明的細胞系屬于單克隆，RNA干擾效率高，能有效抑制IER5基因的表達，該細胞系特異性強，無毒副作用；可用于對該基因有關的潛在藥物開發(fā)與其反應連鎖基因的研究，以及宮頸癌的放療與藥物研發(fā)。文檔編號C12N15/11GK101275133SQ20081005773公開日2008年10月1日申請日期2008年2月14日優(yōu)先權日2008年2月14日發(fā)明者丁庫克,茶喬,周平坤,威安,張士猛,徐勤枝,李延玲,楊川杰,沈晶晶,袁增強,趙增強,淳郝,馬斌榮申請人:首都醫(yī)科大學;中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所