專(zhuān)利名稱(chēng)：：轉(zhuǎn)基因獲得抗真菌病害切花非洲菊的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種重要花卉植物的抗病性育種技術(shù)方法，尤其是整合了來(lái)源不同的兩種基因?qū)Ψ侵蘧者M(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，從根本上解決了非洲菊主栽地區(qū)真菌病害危害嚴(yán)重的難題。本技術(shù)屬于生物技術(shù)育種領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：非洲菊("/^eraj'a歷eso/7力'Bolus)，又名扶郎花，為菊科菊木族大丁草屬多年生宿根草本花卉，世界著名五大鮮切花之一，起源于南非德蘭士瓦地區(qū)。非洲菊約有42個(gè)種，主要分布于南非、馬達(dá)加斯加、印度、中國(guó)、蒙古、日本、南美和澳大利亞，因其花色豐富、形態(tài)優(yōu)美，深受世界人民喜愛(ài)。如今，非洲菊已成為重要的貿(mào)易商品，并與月季、菊花、康乃馨和郁金香成為世界著名的觀賞植物種類(lèi)。全世界30國(guó)家和地區(qū)廣泛栽培，國(guó)內(nèi)十多個(gè)省市均有栽培，面積約為800公頃，云南栽培面積為296公頃。隨著非洲菊種植面積的擴(kuò)大，真菌病害在其主要種植區(qū)均有普遍發(fā)生，且危害日趨嚴(yán)重，昆明地區(qū)一般發(fā)病率為10%-30%，重者達(dá)70%-80%。其中較為明顯的有白粉病、斑點(diǎn)病、疫病、根腐病等，真菌病害發(fā)生嚴(yán)重影響了非洲菊鮮切花的產(chǎn)量及品質(zhì)。由于污染環(huán)境、成本高、成效有限等因素，物理或化學(xué)土壤滅菌和使用內(nèi)吸殺菌劑均不能滿(mǎn)足花卉生產(chǎn)的要求。轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)的發(fā)展為其提供了新的解決途徑。真菌細(xì)胞壁主要由幾丁質(zhì)和e-i,3-葡聚糖組成，幾丁質(zhì)存在于真菌細(xì)胞壁的內(nèi)部，葡聚糖則在細(xì)胞內(nèi)、外部均有，內(nèi)部與幾丁質(zhì)形成復(fù)合物。通過(guò)對(duì)幾丁質(zhì)酶基因(Chitinasegene)和P-1，3_葡聚糖酶基因(e-1，3-glucanasegene)在植物中的轉(zhuǎn)化能有效抵抗真菌病害造成的危害。幾丁質(zhì)酶及e-i，3-葡聚糖酶均分為三類(lèi)，其中I類(lèi)對(duì)真菌具有較強(qiáng)的抑制活性。大量實(shí)驗(yàn)證明，幾丁質(zhì)酶與e-i，3-葡聚糖酶具有協(xié)同抗真菌作用。此外，獲得的轉(zhuǎn)基因植株不僅能有效抵抗真菌病害，對(duì)線蟲(chóng)也有一定的抗性。因此，利用基因工程手段創(chuàng)造非洲菊抗真菌病害新品種對(duì)解決其真菌病害引起的生產(chǎn)問(wèn)題有著主要的實(shí)際應(yīng)用意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于利用生物技術(shù)方法創(chuàng)造能有效抵抗真菌病害侵染的非洲菊新品種，以期獲得自身高抗真菌病害，同時(shí)又不影響觀賞價(jià)值的新型轉(zhuǎn)基因非洲菊新品種。本發(fā)明通過(guò)下列技術(shù)方案完成一種轉(zhuǎn)基因獲得抗真菌病害切花非洲菊的方法，其特征在于包括下列步驟步驟l，以菜豆、煙草為試材進(jìn)行Chi基因及Glu基因的分離、克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建(1)基因分離與克隆A、Chi基因擴(kuò)增引物根據(jù)菜豆幾丁質(zhì)酶cDNA序列GenBankM13968設(shè)計(jì)引物如下Pl:5'GAATGAGGCTTTGTAAATTCAC3'P2:5'CGTTAATTTCCAAAAGACCTCTGGT3'B、Glu基因擴(kuò)增引物根據(jù)煙草葡聚糖酶cDNA序列GenBankX53600設(shè)計(jì)引物如下P3:5'AAATGGCTGCTATCACACTCCTAG3'P4:5'CGTCACCCAAAGTTGATATTATATTTGG3'C、總RNA的提取及PCR產(chǎn)物擴(kuò)增分別從菜豆及煙草中提取總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA，并利用逆轉(zhuǎn)錄的cDNA在下列反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得所需的Per產(chǎn)物10XPerbuffer2.5uldNTP(2.OmM)2ulMgcl22ulPrimerl(10pmol/ul)lulPrimer2(10pmol/ul)lulTaq酶(lug/ul)0.5ulcDNA(25ng)2ulH20llulD、對(duì)Pcr產(chǎn)物補(bǔ)平利用Klenow片段對(duì)上述Per產(chǎn)物進(jìn)行補(bǔ)平反應(yīng)，其反應(yīng)體系為Klenow片段Buffer10ulKlenow片段3ul2.5mM的dNTP17ulPer產(chǎn)物70ul反應(yīng)條件為37°C，lh，得到末端補(bǔ)平DNA產(chǎn)物；E、末端補(bǔ)平DNA產(chǎn)物的去磷酸化利用DNA片段末端堿基去磷酸化試劑盒對(duì)上述末端補(bǔ)平DNA產(chǎn)物進(jìn)行去5'端去磷酸化反應(yīng)后，回收補(bǔ)平DNA產(chǎn)物及T-載體克隆后，獲得克隆Chi/T-Vector及Glu/T-Vector;(2)表達(dá)載體的構(gòu)建A、pB-Chi、pB-Glu表達(dá)載體的構(gòu)建分別用Chi/T-Vector和Glu/T-Vector,用Klenow片段按步驟1-(1)-D的體系對(duì)其補(bǔ)平，再用&c/酶切，1%的電泳檢測(cè)，回收958bp和940bp的目的片段；同時(shí)用577a/的酶切質(zhì)粒pBI121,該質(zhì)粒帶有啟動(dòng)子CaMV35S，再用fee/酶切，回收載體大片段；T4DNA連接酶分別作載體與目的片段的連接，連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化￡coh'DH5a，幼'/7o7Z7雙酶切鑒定pB-Chi質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆，////w/雙酶切鑒定pB-Glu質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆，獲得連接方向正確的pB-Chi、pB-Glu表達(dá)載體；B、pB-Chi-Glu雙價(jià)表達(dá)載體的構(gòu)建用^bt^/酶切pB-Chi，用Klenow片段按步驟1-(1)-D的體系對(duì)其補(bǔ)平，再用歷'/7o7/膽切后，用Klenow片段按步驟1-(1)-D的體系補(bǔ)平，電泳回收2.0kb片段，此片段包括35S-Chi-Nos，然后按步驟1-(1)-E的過(guò)程去磷酸化；用幼'/m7Z7酵切pB-Glu，用Klenow片段按步驟1-(1)-D的體系對(duì)其補(bǔ)平，無(wú)水酒精沉淀載體，溶解，按步驟l-(1)-E的過(guò)程去磷酸化，T4DNA連接酶作載體與目的片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化￡c^iDH5a，以尸"/酶切鑒定pB-Chi-Glu的陽(yáng)性克隆，獲得經(jīng)檢測(cè)的連接方向與預(yù)期目的一致的pB-Chi-Glu雙價(jià)表達(dá)載體質(zhì)粒；步驟2，非洲菊高效轉(zhuǎn)化再生體系的建立(1)培養(yǎng)非洲菊愈傷組織選擇離體培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)健康的非洲菊單株，以葉柄帶有小愈傷組織的葉片為材料，在非洲菊愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基即Ms+6.0-10.0mg/L的6-BA+0.5-1.5mg/L的NAA上進(jìn)行培養(yǎng)，其培養(yǎng)溫度為24士rC，光照為20001x;14-21天后在葉柄基部長(zhǎng)出帶有綠色生長(zhǎng)點(diǎn)的愈傷組織。(2)抗真菌基因?qū)Ψ侵蘧盏霓D(zhuǎn)化A、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取農(nóng)桿菌LBA4404，接種于5ml含有50-80mg/L的卡那霉素Km和5-10mg/L的利福平Rif的LB液體培養(yǎng)基中，LB培育基配方如下8g/1的細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨+5g/L的細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取粉+10g/L的NaCl，于28°C、200rpm培養(yǎng)過(guò)夜；取2ml培養(yǎng)物于相同LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，至0D600為0.4—0.6，將培養(yǎng)物冰浴30min，4°C、5000rpm離心5min，棄上清，用lml的濃度為20腸1/L的冷CaCl2懸浮，分裝成50nl/管，加15%的甘油，液氮中冷凍后-70。C保存，得感受態(tài)細(xì)胞；B、質(zhì)粒向農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)化把上述制備好的感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化，加入lug質(zhì)粒pB-Chi-Glu，冰上放置30min后，液氮速凍5min，37。C水浴35min至完全融化，冰上放置2min，加600ul上述A步驟的LB液體，28。C溫度下200rpm恢復(fù)培養(yǎng)35h,5000rpm離心35min，收集菌體，留50100ul重懸，涂在含有抗生素的下列LB平板8g/L的細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨+5g/L的細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取粉+10g/L的NaCl+15g瓊脂+50-100mg/L的Km+5-8mg/L的Rif，28。C培養(yǎng)2天，得根癌農(nóng)桿菌pB-Chi-Glu/LBA4404單菌落板；C、農(nóng)桿菌對(duì)非洲菊愈傷組織(非洲菊小芽)的侵染挑取上述根癌農(nóng)桿菌pB-Chi-Glu/LBA4404單菌落，在含量為5080mg/LRif的下列LB培養(yǎng)基即8g/L的細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨+5g/L的細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取粉+10g/L的NaCl屮5080mg/L的Km+510mg/L的Rif中，震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得活化菌液，用該活化菌液對(duì)步驟2—(1)的非洲菊愈傷組織進(jìn)行侵染，侵染8-10min，轉(zhuǎn)入Ms培養(yǎng)基中，黑暗下培養(yǎng)2天，得到侵染的非洲菊愈傷組織；D、轉(zhuǎn)化植株的抗生素篩選:將上述侵染植株轉(zhuǎn)到選擇培養(yǎng)基即Ms+O.40.2mg/L的6-BA+0.51.5mg/L的NAA+0.20.4mg/L的KT+25mg/L的Km+50_80mg/L的Rif中，于28'C培養(yǎng)14天，分化出的正常非洲菊轉(zhuǎn)化苗，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基即Ms+0.40.2mg/L的6-BA+0.51.5mg/L的NAA+0.20.4mg/L的KT中，于28。C篩選培養(yǎng)20天，篩選出的生長(zhǎng)正常的非洲菊株系在步驟三的繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁，得經(jīng)抗生素篩選的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。所述步驟l-(1)-C的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為Chi基因94°C4min，Glu基因94°C45s;Chi基因6064°C，45s，Glu基因5660°C，45s;Chi基因和Glu基因72°C90s，如此進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°C10min，反應(yīng)結(jié)束即得所需的Per產(chǎn)物。所述步驟1-(1)-E去磷酸化反應(yīng)按照DNA片段末端堿基去磷酸化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行1)在微量離心管中配制下列去磷酸化反應(yīng)液10XBAPBuffer5ulBacterialAlkalinePhosphatase(BAP)2.5ul補(bǔ)平DNA片段42.5ul2)65'C保溫30分鐘后，加入50p1的滅菌蒸餾水，補(bǔ)充體積至IOOyl;3)加入lOOul的下列混合物苯酚氯仿異戊醇=25:24:1，充分混勻，離心后取上層水相轉(zhuǎn)移至另一微量離心管中；重復(fù)本步驟一次；4)加入lOOyl的下列混合物氯仿異戊醇=24:1，充分混勻，離心后取上層水相轉(zhuǎn)移至另一微量離心管中；5)加入10u1pH為5.2的3MCH3C00Na(乙酸鈉)，混合均勻；6)加入4n1的DNAmate溶液，混合均勻；7)加入250nl-2(TC的無(wú)水乙醇，充分混勻；8)離心回收沉淀，用70%的冷乙醇清洗沉淀后，干燥；9)用50ulTE水稀釋。所述步驟1-(1)-E對(duì)補(bǔ)平DNA產(chǎn)物的回收按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；T-載體克隆按照pMD18-TVectorKit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，獲得克隆Chi/T-Vector及Glu/T-Vector,之后再用5鵬/酶切Chi/T-Vector，用i7o酶切Glu/T-Vector,分別切出329bp、690bp片段的克隆即為陽(yáng)性正向克隆，對(duì)正向克隆作進(jìn)一步的DNA序列測(cè)定。本發(fā)明選用的材料為(1)菌種和質(zhì)粒PMD18-Tvector,大腸桿菌DH5a，表達(dá)載體pBI121，農(nóng)桿菌LBA4404;(2)植物材料普通菜豆(戶(hù)A"^omvw/g"r紅)、煙草(7V/co"》"fltoZwcww)、非洲菊品種'紅帽子'；(3)供試菌種隱地疫霉(,Ar"o力"orac/T/^^es)及惡疫霉(戶(hù)/u^^力^wra(4)主要化學(xué)試劑乙烯、SDS(十二垸基硫酸鈉)、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇、逆轉(zhuǎn)錄酶及其Buffer、0ligdtu。)、T4連接酶及其Buffer、質(zhì)粒片斷提取試劑盒、膠回收試劑盒、Km(卡那霉素)、Amp(氨芐青霉素)、Cb(羧芐青霉素)、Rif(利福平)、Pcr擴(kuò)增引物、Taq酶及其buffer、dNTP、DL2000Marker、限制性?xún)?nèi)切酶及其Buffer、Klenow片段及其Buffer等；本發(fā)明具有以下的優(yōu)點(diǎn)及效果1、構(gòu)建以pBI121表達(dá)載體為的Chi-Glu雙價(jià)表達(dá)載體，為今后構(gòu)建相應(yīng)的雙價(jià)表達(dá)載體研究工作提供了思路及研究基礎(chǔ)；2、建立以'紅帽子'品種為代表的非洲菊高效再生轉(zhuǎn)化體系，經(jīng)Per檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化率達(dá)8%。該項(xiàng)工作的完成為后續(xù)開(kāi)展的非洲菊轉(zhuǎn)基因工作提供了較為豐富的經(jīng)驗(yàn)及工作基礎(chǔ)；3、對(duì)非洲菊真菌病害低抗品種進(jìn)行了Chi-Glu基因的轉(zhuǎn)化，有效提高其協(xié)同抗真菌作用，與同期接種對(duì)照株系相比，疫霉根腐病發(fā)病程度明顯降低，表明轉(zhuǎn)基因株系能有效抵抗由隱地疫霉(尸力/top/t/orac/Tpfogea)及惡疫霉(/^ytop/^/oraca"fW7;/n)引起的非洲菊真菌病害，降低了非洲菊栽培管理中的成本，對(duì)實(shí)際種植生產(chǎn)有實(shí)際意義。具體的實(shí)施方式為了更好地說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容，下面給出本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不僅限于這些。步驟l，以菜豆、煙草為試材進(jìn)行Chi基因及Glu基因的分離、克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建(1)基因的分離與克隆A、Chi基因擴(kuò)增引物根據(jù)菜豆幾丁質(zhì)酶cDNA序列GenBankM13968設(shè)計(jì)引物如下:P1:5'GAATGAGGCTTTGTAAATTCAC3'P2:5'CGTTAATTTCCAAAAGACCTCTGGT3'B、Glu基因擴(kuò)增引物根據(jù)煙草葡聚糖酶cDNA序列GenBankX53600設(shè)計(jì)引物如下P3:5'AAATGGCTGCTATCACACTCCTAG3'P4:5'CGTCACCCAAAGTTGATATTATATTTGG3'以上2對(duì)引物由北京奧克生物公司合成；C、總RNA的提取及PCR產(chǎn)物擴(kuò)增按照常規(guī)Tizol法分別從乙烯利誘導(dǎo)四葉期菜豆及接種TMV幼苗期煙草中提取總RNA,用ReverTraAce逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA，并利用逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為lOXPcrbuffer2.5uld證(2.0mM)2ulMgcl22ulPrimerl(10pmol/ul)lulPrimer2(10pmol/ul)lulTaq酶(lug/ul)0.5ulc腿(25ng)2ulH20llul反應(yīng)條件為Chi基因94°C4min，Glu基因94°C45s;Chi基因6064°C，45s，Glu基因5660°C，45s;Chi基因和Glu基因72°C90s，如此進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°C10min，反應(yīng)結(jié)束后，獲得所需的Per產(chǎn)物；D、對(duì)Pcr產(chǎn)物補(bǔ)平利用Klenow片段對(duì)上述Pcr產(chǎn)物進(jìn)行補(bǔ)平反應(yīng)，其反應(yīng)體系為-Klenow片段Buffer10ulKlenow片段3ul2.5mM的dNTP17ulPer產(chǎn)物70ul反應(yīng)條件為37'C,lh，得到末端補(bǔ)平DNA產(chǎn)物；E、末端補(bǔ)平DNA產(chǎn)物的去磷酸化利用DNA片段末端堿基去磷酸化試劑盒對(duì)上述末端補(bǔ)平DNA進(jìn)行去5'端去磷酸化反應(yīng)，其過(guò)程為1)在微量離心管中配制下列去磷酸化反應(yīng)液10XBAPBuffer5ulBacterialAlkalinePhosphatase(BAP)2.5ul補(bǔ)平DNA片段42.5ul2)65。C保溫30分鐘后，加入50ii1的滅菌蒸餾水，補(bǔ)充體積至100u1;3)加入100wl的下列混合物苯酚氯仿異戊醇=25:24:1，充分混勻，離心后取上層水相轉(zhuǎn)移至另一微量離心管中；重復(fù)本步驟一次；4)加入100nl的下列混合物氯仿異戊醇=24:1，充分混勻，離心后取上層水相轉(zhuǎn)移至另一微量離心管中；5)加入10u1pH為5.2的3MCH3C00Na(乙酸鈉)，混合均勻；6)加入4u1的DNAmate溶液，混合均勻；7)加入250ul-2(TC的無(wú)水乙醇，充分混勻；8)離心回收沉淀，用70%的冷乙醇清洗沉淀后，干燥；9)用50ulTE水稀釋?zhuān)谎a(bǔ)平DNA產(chǎn)物回收及T-載體克隆目的DNA片段的回收按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；T-載體克隆按照pMD18-TVectorKit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，獲得克隆Chi/T-Vector及Glu/T-Vector;T-載體克隆的酶切鑒定和序列測(cè)定用Sza/酶切Chi/T-Vector，用i7o酶切Glu/T-Vector，分別切出329bp、690bp片段的克隆即為陽(yáng)性正向克隆，對(duì)正向克隆送北京奧克生物公司作進(jìn)一步的DNA序列測(cè)定；(2)表達(dá)載體的構(gòu)建A、pB-Chi、pB-Glu表達(dá)載體的構(gòu)建分別用Chi/T-Vector和Glu/T-Vector，用Klenow片段按步驟1-G)-D的體系對(duì)其補(bǔ)平，再用5"ac/酶切，1%的電泳檢測(cè)，回收958bp和940bp的目的片段；同時(shí)用5i/7a/的酶切質(zhì)粒pBI121，該質(zhì)粒帶有啟動(dòng)子CaMV35S，再用5"ac/酶切，回收載體大片段；T4DNA連接酶分別作載體與目的片段的連接，連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化EcoWDH5a，歷V7rf/Z/雙酶切鑒定pB-Chi質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆，Za6/Atto/雙酶切鑒定pB-Glu質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆，獲得連接方向正確的pB-Chi、pB-Glu表達(dá)載體；B、pB-Chi-Glu雙價(jià)表達(dá)載體的構(gòu)建用化o7/酶切pB-Chi，用Klenow片段按步驟1-(1)-D的體系對(duì)其補(bǔ)平，再用歷'/7dffl酶切后，用Klenow片段按步驟1-(1)-D的體系補(bǔ)平，電泳回收2.0kb片段，此片段包括35S-Chi-Nos，然后按步驟1-(1)-E的過(guò)程去磷酸化；用HindIII酶切pB-Glu，用Klenow片段按步驟1-(1)-D的體系對(duì)其補(bǔ)平，無(wú)水酒精沉淀載體，溶解，按步驟1-(1)-E的過(guò)程去磷酸化，T4DNA連接酶作載體與目的片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Eco^DH5a，以戶(hù)M/酶切鑒定pB-Chi-Glu的陽(yáng)性克隆，獲得經(jīng)檢測(cè)的連接方向與預(yù)期目的一致的pB-Chi-Glu雙價(jià)表達(dá)載體質(zhì)粒；步驟2，非洲菊高效轉(zhuǎn)化再生體系的建立(1)培養(yǎng)非洲菊愈傷組織選擇離體培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)健康的非洲菊單株，以葉柄帶有小愈傷組織的葉片為材料，在非洲菊愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基即Ms+6.0-10.0mg/L的6-BA+0.5-1.5mg/L的NAA上進(jìn)行培養(yǎng)，其培養(yǎng)溫度為24土rC，光照為20001x;14-21天后在葉柄基部長(zhǎng)出帶有綠色生長(zhǎng)點(diǎn)的愈傷組織。非洲菊抗生素本底試驗(yàn)根據(jù)表達(dá)載體pBI121的結(jié)構(gòu)組成特性，選擇卡那霉素Km為該非洲菊轉(zhuǎn)化材料的篩選抗生素，在步驟三的繼代培養(yǎng)基中分別添加20、25、30、40、50tng/1的Km，植入非洲菊愈傷組織塊及單株培養(yǎng)14天，經(jīng)觀察含有25mg/l的Km的繼代培育基有利于對(duì)非洲菊轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株進(jìn)行篩選；(2)抗真菌基因?qū)Ψ侵蘧盏霓D(zhuǎn)化A、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取農(nóng)桿菌LBA4404，接種于5ml含有50-80mg/L的卡那霉素Km和5-10mg/L的利福平Rif的LB液體培養(yǎng)基中，LB培育基配方如下細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨8g/L+細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取粉5g/L+NaCl10g/L;于28°〇、200rpm培養(yǎng)過(guò)夜；取2ml培養(yǎng)物于相同LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，至0D600為0.4—0.6，將培養(yǎng)物冰浴30min，4°C、5000rpm離心5min，棄上清，用lml冷的濃度為20mmol/L的CaCl2懸浮，分裝成50ul/管，力卩15%的甘油，液氮中冷凍后-7(TC保存，得感受態(tài)細(xì)胞；B、質(zhì)粒向農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)化把上述制備好的感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化，加入lug質(zhì)粒pB-Chi-Glu，冰上放置30min后，液氮速凍5min，37。C水浴35min至完全融化，冰上放置2min，加600ul與上述A相同的LB液體，28'C溫度下200rpm恢復(fù)培養(yǎng)35h,5000rpm離心35min，收集菌體，留50100ul重懸，涂在含有抗生素的下列LB平板8g/L的細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨+5g/L的細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取粉+10g/L的NaCl+15g瓊脂+50-100mg/L的Km+5-8mg/L的Rif，28。C培養(yǎng)2天，得根癌農(nóng)桿菌pB-Chi-Glu/LBA4404單菌落板；C、農(nóng)桿菌對(duì)非洲菊愈傷組織的侵染挑取根癌農(nóng)桿菌pB-Chi-Glu/LBA4404單菌落，在含量為5080mg/LRif的下列LB培養(yǎng)基即8g/L的細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨+5g/L的細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取粉+10g/L的NaCl+5080mg/L的Km+510mg/L的Rif中，震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得活化菌液，用該活化菌液對(duì)步驟2_(1)的非洲菊愈傷組織進(jìn)行侵染，侵染8-10min，轉(zhuǎn)入Ms培養(yǎng)基中，黑暗下培養(yǎng)2天，得到侵染植株；D、轉(zhuǎn)化植株的抗生素篩選-將上述侵染植株轉(zhuǎn)到選擇培養(yǎng)基即Ms+0.40.2mg/L的6-BA+0.51.5mg/L的NAA+0.20.4mg/L的KT+25mg/L的Km+50-80mg/L的Rif中，于28。C培養(yǎng)14天，分化出的正常非洲菊轉(zhuǎn)化苗，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基即Ms+0.40.2mg/L的6-BA+0.51.5mg/L的NAA+0.20.4mg/L的KT中，于28。C篩選培養(yǎng)20天，篩選出的生長(zhǎng)正常的非洲菊株系在步驟三的繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁，得轉(zhuǎn)基因植株；步驟3，轉(zhuǎn)基因植株的Pcr檢測(cè)(1)對(duì)經(jīng)抗生素篩選存活的非洲菊植株進(jìn)行Per檢測(cè)；轉(zhuǎn)化的非洲菊植株的總DNA的提取在無(wú)菌條件下，取轉(zhuǎn)化材料的葉片，置于離心管中，在液氮條件下進(jìn)行研磨，加入DNA提取緩沖液(lOOmMNaCl，50mMEDTA，0.5%SDS，50mMTris，PH7.4)，混勻，6(TC水浴lh，加入等體積的氯仿-異戊醇(24:1)，顛倒混勻，10000rpm離心4min，重復(fù)抽提2-3次；取上液水相層，加入2倍體積的冰凍異丙醇，充分混勻，-2(TC放置。經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，結(jié)果表明獲得轉(zhuǎn)化非洲菊植株的總DNA。非洲菊對(duì)照植株的總DNA的提取選擇未經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的材料，進(jìn)行DNA的提取，提取方法與轉(zhuǎn)化非洲菊植株的總DNA提取方法相同。經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，結(jié)果表明獲得對(duì)照材料非洲菊植株的總DNA?？侱NA的Per擴(kuò)增以轉(zhuǎn)化材料中提取的非洲菊總DNA及對(duì)照非洲菊DNA為模板，以Chi基因序列為依據(jù)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行Pcr擴(kuò)增擴(kuò)增引物為P1:5'GAATGAGGCTTTGTAAATTCAC3'P2:5'CGTTAATTTCCAAAAGACCTCTGGT3'Per反應(yīng)系統(tǒng)無(wú)菌Pcr管中加入10XPcrbuffer2ul4XdNTP(2mM)2ulPrimerl(10pmol/ul)2ulPrimer2(10pmol/ul)2ulTaq酶(lug/ul)lul模板DNA(約25ng)2ulD2H209ul總體積20ul上封石蠟油，按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性4min;94°C30s，64-60°C30s，72°C3min，35個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取Pcr產(chǎn)物在1.0y。瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的非洲菊'紅帽子，DNA的Per產(chǎn)物為陰性對(duì)照。(2)轉(zhuǎn)基因植株的抗病性檢測(cè)a、菌株培養(yǎng)從非洲菊發(fā)病株上采集疫霉根腐病發(fā)病植株，將新鮮病組織剪取根莖部2cm左右，經(jīng)過(guò)表面清洗接種在V8培養(yǎng)基上，置于24i:暗培養(yǎng)5-7d后，觀察有菌絲體產(chǎn)生但無(wú)孢子囊，待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)基表面后，用皮氏培養(yǎng)液誘導(dǎo)產(chǎn)生孢子囊，將其制備成孢子懸浮液備用；b、材料種植將苗齡相同的鑒定材料栽種在滅過(guò)菌的土壤中，每個(gè)品種栽種10-20盆，8-10盆用于接種，2-4盆用于對(duì)照，放置在溫室中種植，溫度在19-3(TC之間，待植株生長(zhǎng)穩(wěn)定后即可接種；c、接種方法(土壤接種法)用注射器吸入lml孢子懸浮液灌入植株的根莖部，把接種過(guò)的植株放在適溫下栽培，每天澆水1次使土壤保持潮濕。D、病情調(diào)査接種10d后開(kāi)始調(diào)査發(fā)病情況，此時(shí)植株表現(xiàn)出萎蔫，葉片呈現(xiàn)紫紅色或黑褐色，陸續(xù)枯萎，嚴(yán)重時(shí)整株枯死。每隔4d調(diào)査一次，共調(diào)査9次，出現(xiàn)初期病癥的記"V"，萎蔫記"V-"，枯死的記"X"，未發(fā)病的記為"0"。選擇2個(gè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系與對(duì)照的接種非洲菊發(fā)病株上采集疫霉根腐病測(cè)試結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>權(quán)利要求1、一種轉(zhuǎn)基因獲得抗真菌病害切花非洲菊的方法，其特征在于包括下列步驟步驟1，以菜豆、煙草為試材進(jìn)行Chi基因及Glu基因的分離、克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建(1)基因分離與克隆A、Chi基因擴(kuò)增引物根據(jù)菜豆幾丁質(zhì)酶cDNA序列GenBankM13968設(shè)計(jì)引物如下P15’GAATGAGGCTTTGTAAATTCAC3’P25’CGTTAATTTCCAAAAGACCTCTGGT3’B、Glu基因擴(kuò)增引物根據(jù)煙草葡聚糖酶cDNA序列GenBankX53600設(shè)計(jì)引物如下P35’AAATGGCTGCTATCACACTCCTAG3’P45’CGTCACCCAAAGTTGATATTATATTTGG3’C、總RNA的提取及PCR產(chǎn)物擴(kuò)增分別從菜豆及煙草中提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA，并利用逆轉(zhuǎn)錄的cDNA在下列反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得所需的Pcr產(chǎn)物10×Pcrbuffer2.5uldNTP(2.0mM)2ulMgCl22ulPrimerl(10pmol/ul)1ulPrimer2(10pmol/ul)1ulTaq酶(1ug/ul)0.5ulcDNA(25ng)2ulH2O11ulD、對(duì)Pcr產(chǎn)物補(bǔ)平利用Klenow片段對(duì)上述Pcr產(chǎn)物進(jìn)行補(bǔ)平反應(yīng)，其反應(yīng)體系為Klenow片段Buffer10ulKlenow片段3ul2.5mM的dNTP17ulPcr產(chǎn)物70ul反應(yīng)條件為37℃，1h，得到末端補(bǔ)平DNA產(chǎn)物；E、末端補(bǔ)平DNA產(chǎn)物的去磷酸化對(duì)上述末端補(bǔ)平DNA產(chǎn)物進(jìn)行去5’端去磷酸化反應(yīng)后，回收補(bǔ)平DNA產(chǎn)物及T-載體克隆后，獲得克隆Chi/T-Vector及Glu/T-Vector；(2)表達(dá)載體的構(gòu)建A、pB-Chi、pB-Glu表達(dá)載體的構(gòu)建分別用SalI酶切Chi/T-Vector和Glu/T-Vector，用Klenow片段按步驟1-(1)-D的體系對(duì)其補(bǔ)平，再用SacI酶切，1％的電泳檢測(cè)，回收958bp和940bp的目的片段；同時(shí)用SmaI的酶切質(zhì)粒pBI121，再用SacI酶切，回收載體大片段；T4DNA連接酶分別作載體與目的片段的連接，連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化E.coliDH5a，EcoRI/HindIII雙酶切鑒定pB-Chi質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆，XabI/XhoI雙酶切鑒定pB-Glu質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆，獲得連接方向正確的pB-Chi、pB-Glu表達(dá)載體；B、pB-Chi-Glu雙價(jià)表達(dá)載體的構(gòu)建用EcoRI酶切pB-Chi，用Klenow片段按步驟1-(1)-D的體系對(duì)其補(bǔ)平，再用HinIII酶切后，用Klenow片段按步驟1-(1)-D的體系補(bǔ)平，電泳回收2.0kb片段，此片段包括CaMV35S-Chi-Nos，然后按步驟1-(1)-E的過(guò)程去磷酸化；用HindIII酶切pB-Glu，用Klenow片段按步驟1-(1)-D的體系對(duì)其補(bǔ)平，無(wú)水酒精沉淀載體，溶解，按步驟1-(1)-E的過(guò)程去磷酸化，T4DNA連接酶作載體與目的片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化coliDH5a，以PstI酶切鑒定pB-Chi-Glu的陽(yáng)性克隆，獲得經(jīng)檢測(cè)的連接方向與預(yù)期目的一致的pB-Chi-Glu雙價(jià)表達(dá)載體質(zhì)粒；步驟2，非洲菊高效轉(zhuǎn)化再生體系的建立(1)培養(yǎng)非洲菊愈傷組織選擇離體培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)健康的非洲菊單株，以葉柄帶有小愈傷組織的葉片為材料，在非洲菊愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基即Ms+6.0-10.0mg/L的6-BA+0.5-1.5mg/L的NAA上進(jìn)行培養(yǎng)，其培養(yǎng)溫度為24±1℃，光照為20001x；14-21天后在葉柄基部長(zhǎng)出帶有綠色生長(zhǎng)點(diǎn)的愈傷組織，無(wú)菌條件下切下長(zhǎng)出的愈傷組織(2)抗真菌基因?qū)Ψ侵蘧盏霓D(zhuǎn)化A、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取農(nóng)桿菌LBA4404，接種于5ml含有50-80mg/L的卡那霉素Km和5-10mg/L的利福平Rif的LB液體培養(yǎng)基中，LB培育基配方如下8g/L的細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨+5g/L的細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取粉+10g/L的NaCl，于28℃、200rpm培養(yǎng)過(guò)夜；取2ml培養(yǎng)物于相同LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，至OD600為0.4-0.6，將培養(yǎng)物冰浴30min，4℃、5000rpm離心5min，棄上清，用1ml的濃度為20mmol/L的冷CaCl2懸浮，分裝成50μl/管，加15％的甘油，液氮中冷凍后-70℃保存，得感受態(tài)細(xì)胞；B、質(zhì)粒向農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)化把上述制備好的感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化，加入1ug質(zhì)粒pB-Chi-Glu，冰上放置30min后，液氮速凍5min，37℃水浴3～5min至完全融化，冰上放置2min，加600ul上述A步驟的LB液體，28℃溫度下200rpm恢復(fù)培養(yǎng)3～5h，5000rpm離心3～5min，收集菌體，留50～100ul重懸，涂在含有抗生素的下列LB平板8g/L的細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨+5g/L的細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取粉+10g/L的NaCl+15g瓊脂+50-100mg/L的Km+5-8mg/L的Rif，28℃培養(yǎng)2天，得根癌農(nóng)桿菌pB-Chi-Glu/LBA4404單菌落板；C、農(nóng)桿菌對(duì)非洲菊愈傷組織的侵染挑取上述根癌農(nóng)桿菌pB-Chi-Glu/LBA4404單菌落，在含量為50～80mg/LRif的下列LB培養(yǎng)基即8g/L的細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨+5g/L的細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取粉+10g/L的NaCl+50～80mg/L的Km+5～10mg/L的Rif中，震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得活化菌液，用該活化菌液對(duì)步驟2-(1)的非洲菊愈傷組織進(jìn)行侵染，侵染8-10min，轉(zhuǎn)入Ms培養(yǎng)基中，黑暗下培養(yǎng)2天，到經(jīng)侵染的愈傷組織材料；D、轉(zhuǎn)化植株的抗生素篩選將上述侵染植株轉(zhuǎn)到選擇培養(yǎng)基即Ms+0.4～0.2mg/L的6-BA+0.5～1.5mg/L的NAA+0.2～0.4mg/L的KT+25mg/L的Km+50-80mg/L的Rif中，于28℃培養(yǎng)14天，分化出的正常非洲菊轉(zhuǎn)化苗，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基即Ms+0.4～0.2mg/L的6-BA+0.5～1.5mg/L的NAA++0.2～0.4mg/L的KT中，于28℃培養(yǎng)20天，篩選出的生長(zhǎng)正常的非洲菊株系在步驟三的繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁，得抗生素篩選的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因獲得抗真菌病害切花非洲菊的方法，其特征在于所述步驟1-(l)-C的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為Chi基因94°C4min，Glu基因94°C45s;Chi基因6064°C，45s,Glu基因5660°C，45s;Chi基因和Glu基因72°C90s，如此進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°ClOmin，反應(yīng)結(jié)束即得所需的Per產(chǎn)物。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因獲得抗真菌病害切花非洲菊的方法，其特征在于所述步驟l-(1)-E去磷酸化反應(yīng)按照DNA片段末端堿基去磷酸化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行1)在微量離心管中配制下列去磷酸化反應(yīng)液10XBAPBuffer5ulBacterialAlkalinePhosphatase(BAP)2.5ul補(bǔ)平DNA片段42.5ul2)65。C保溫30分鐘后，加入50u1的滅菌蒸餾水，補(bǔ)充體積至100u1;3)加入lOOyl的下列混合物苯酚氯仿異戊醇=25:24:1，充分混勻，離心后取上層水相轉(zhuǎn)移至另一微量離心管中；重復(fù)本步驟一次；4)加入100wl的下列混合物氯仿:異戊醇=24:1，充分混勻，離心后取上層水相轉(zhuǎn)移至另一微量離心管中；5)加入lOu1pH為5.2的3M乙酸鈉CH3C00Na，混合均勻；6)加入1的DNAmate溶液，混合均勻；7)加入250ul-20。C的無(wú)水乙醇，充分混勻；8)離心回收沉淀，用70%的冷乙醇清洗沉淀后，干燥；9)用50ulTE水稀釋。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因獲得抗真菌病害切花非洲菊的方法，其特征在于所述步驟l-(1)-E對(duì)補(bǔ)平DNA產(chǎn)物的回收按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；T-載體克隆按照pMD18-TVectorKit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，獲得克隆Chi/T-Vector及Glu/T-Vector，之后再用5izs/酶切Chi/T-Vector，用i7o酶切Glu/T-Vector，分別切出329bp、690bp片段的克隆即為陽(yáng)性正向克隆，對(duì)正向克隆作進(jìn)一步的DNA序列測(cè)定。全文摘要本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因獲得抗真菌病害切花非洲菊的方法。它經(jīng)過(guò)抗真菌基因幾丁質(zhì)酶基因Chi和β-1，3-葡聚糖酶基因Glu的分離、克隆和雙價(jià)表達(dá)載體的構(gòu)建，以及非洲菊高效遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的建立、抗真菌基因?qū)Ψ侵蘧盏霓D(zhuǎn)化等步驟，獲得轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明以CaMV35S為啟動(dòng)子，將Chi、Glu、NptII在內(nèi)的基因轉(zhuǎn)化到切花非洲菊品種‘紅帽子’中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，從而為獲得大量的抗真菌病害的轉(zhuǎn)基因非洲菊株系提供技術(shù)支持。該方法在有效提供抗真菌病害非洲菊轉(zhuǎn)基因株系的同時(shí)，還將為非洲菊基因工程育種提供一條快速、有效、穩(wěn)定的技術(shù)路徑。文檔編號(hào)C12N15/56GK101289670SQ20081005855公開(kāi)日2008年10月22日申請(qǐng)日期2008年6月18日優(yōu)先權(quán)日2008年6月18日發(fā)明者婷張,顥張,晏慧君,涵李,李紳崇,王繼華,霞黎申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所