專利名稱：：防治十字花科根腫病的生物制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，主要涉及一種防治十字花科作物根腫病的生物制劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：根腫病最早發(fā)現(xiàn)于地中海西岸和歐洲南部，目前，在世界各國均有分布，造成至少10%的經(jīng)濟(jì)損失。根腫病亦廣泛分布于我國的浙江、廣東、廣西、湖南、福建、江西、江蘇、安徽、四川、云南、新疆、西藏、遼寧、山東、上海、北京以及重慶等省(市、自治區(qū))，可以說基本上覆蓋了我國的十字花科植物的主栽區(qū)。該病由低等、較原始的真菌---蕓苔根腫菌(尸to,^o//wm^m/cae)(或被稱為原生動(dòng)物)引起，極難防治。該菌為專性寄生，主要危害十字花科植物的根部，能夠產(chǎn)生吲哚乙酸和細(xì)胞分裂素等激素類物質(zhì)，致使植物的根部組織膨大。根腫部一般為紡錘型、手指型和不規(guī)則型等。根腫初期表面光滑，后期常發(fā)生龜裂，易被其他微生物侵染而腐爛。通常苗期就可受害，嚴(yán)重時(shí)幼苗枯死。成株期受害，地上部分初期表現(xiàn)生長緩慢、矮小，基部葉片中午萎蔫，早晚恢復(fù)；后期基部葉片變黃，且萎蔫癥狀不能恢復(fù)，嚴(yán)重時(shí)全株枯死。由該病引起的十字花科作物損失占世界范圍的十字花科作物總量的10%以上，在發(fā)病的區(qū)域引起損失一般在20-90%之間，病菌以厚垣孢子在病殘?bào)w和土壤中休眠，借流水、土壤移動(dòng)和秧苗擴(kuò)散傳播。厚垣孢子在無十字科作物的土壤中仍能存活10年以上，導(dǎo)致種植過十字花科作物的地塊在短期內(nèi)不能再種植同科作物。根腫病危害嚴(yán)重，但對其的防治效果不理想。目前，控制根腫病的措施主要有檢疫、抗病品種、輪作、調(diào)節(jié)土壤的pH值和土壤化學(xué)消毒等。生產(chǎn)上栽培的十字花科作物的抗病性較差，有人鑒定了404份甘藍(lán)，未找到抗病品種，有限的抗性基因主要來自歐洲的蕪菁，而且病菌致病性存在分化，即有生理小種分化，致使同一抗病品種在一地抗病，在另一地抗性較差，而且即使抗病品種，其抗性也不像水稻對稻瘟病、小麥對銹病那樣，呈現(xiàn)很高抗性。有報(bào)導(dǎo)誘發(fā)休眠孢子萌發(fā)的措施，減少田間孢子數(shù)量，可減輕下一茬目標(biāo)作物根腫病發(fā)生程度。有報(bào)道稱咖啡酸和云實(shí)精能促進(jìn)休眠孢子萌發(fā)。種植多葉蘿卜作為誘餌植物，能誘使休眠孢子萌發(fā)，可減少孢子量71-94%，但不能減輕大白菜根腫病發(fā)生程度。堆肥可殺死病殘?bào)w中的病菌量，當(dāng)溫度升至54-73°C6-7天，可殺死病菌。輪作是非常有效的防治措施，特別是十字花科作物與非十字花科作物輪作，效果更明顯。然而，根腫病菌還能侵染旱金蓮，木瓜，白木犀草和甜菜等產(chǎn)生內(nèi)源芥子酸的非十字花科植物，不產(chǎn)生典型的腫瘤，但能形成具有活力的厚垣孢子。這些結(jié)果表明輪作適用作物范圍還是有限的，而且在已建成的蔬菜基地，特別是設(shè)施農(nóng)業(yè)基地，輪作很難被完全采用。長期以來，調(diào)節(jié)土壤pH值被認(rèn)為是最有效的措施之一。利用石灰及其他形式的鈣鹽在一定程度上可以調(diào)節(jié)土壤pH值，可有效減少休眠孢子的萌發(fā)，起到控制該病害的效果。鈣鹽處理既可以調(diào)節(jié)土壤的pH，又可以增加土壤中可交換Ca2+的濃度從而減輕病害的危害。有人在比較Ca(OH)2、CaC03和KOH對根腫病的防治效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，KOH對根腫病的防治效果不及Ca(0H)2和CaCO:,，這充分說明根腫病的發(fā)生與土壤中鈣的含量有著密切關(guān)系。但是長期使用石灰對土壤結(jié)構(gòu)、生理生化性狀都會(huì)造成不良影響。常用的化學(xué)防治主要采用兩種方法，即化學(xué)熏蒸和化學(xué)藥劑灌根，由于前者要求特殊設(shè)備和高投入，后者因施藥麻煩、成本高不能大面積推廣應(yīng)用，且兩者均對土壤生態(tài)系具有破壞作用和殘留問題，致使化學(xué)防治亦不能在生產(chǎn)上發(fā)揮作用。如溴甲烷和威百畝等高效、廣譜，但長期使用導(dǎo)致土壤退化和有益微生物的消亡；溴甲烷還導(dǎo)致大氣臭氧層的破壞，聯(lián)合國1997年規(guī)定2005年發(fā)達(dá)國家全面禁止其使用，至2015年，發(fā)展中國家禁用，同時(shí)威百畝等廣譜熏蒸劑出于價(jià)格高的原因也不易被農(nóng)民接受，目前也僅在溫室等局部范圍應(yīng)用，還沒有在大面積的田間使用。在澆灌的農(nóng)藥中，五氯硝基苯，苯菌靈和百菌清應(yīng)用較多。據(jù)報(bào)道，每穴用300mL1000倍液的百菌清淋施，對直播大白菜的根腫病控制效果可以達(dá)到86.2%;對于移栽大白菜，控制效果可以達(dá)到71.7%，損失率控制在20%以下。然而，由于防治成本過高(每畝需要80元以上)及殘留問題，在十字花科作物中還沒有大量應(yīng)用。一種德國產(chǎn)的化學(xué)肥料Perlka，其主要成分為石灰氮，也常被用來防治根腫病，但低濃度使用，防效不好，如高濃度使用，易產(chǎn)生藥害。生物防治因?qū)Νh(huán)境友好和易于使用而在其他作物病害上己部分地發(fā)揮作用。但用于根腫病這類特殊病害防治一直停滯不前。人們首先想到從土壤中分離具有抑菌活性的菌株。如從小麥、油菜、大白菜和象草地里生長的大白菜根中分離根殖真菌，663份樣本中分離到了322個(gè)菌株，其中186個(gè)菌株來自小麥地里的大白菜根。它們分屬18個(gè)屬，2個(gè)有隔菌群，有色和淡色有隔菌約占50%。在消毒土壤中，16個(gè)菌株可以完全抑制根腫病菌，其中有兩個(gè)根內(nèi)生菌(//他racom',c/"eto^/m)在自然土中也能高效抑制根腫病，用它們來處理種子，植株亦很健康，而且有一個(gè)菌株還能促進(jìn)植株生長。但這些菌株還沒有在大田自然土中有效地應(yīng)用。有人報(bào)道利用P/wmaJCM9972可以抑制根腫病休眠孢子的萌發(fā)并有效控制根腫病的發(fā)生，其主要抑菌物質(zhì)為頂環(huán)氧菌素(N-[3-氯-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]-3-氯-4-(三氟甲基)-2,6-二硝基苯胺)，且250ug.mL-l頂環(huán)氧菌素能夠完全抑制休眠孢子的萌發(fā)。在田間試驗(yàn)中，產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的放線菌泣w/;tom;;c^取AC-3與有機(jī)肥按2%的比例混合對根腫病的防治效果明顯好于單用有機(jī)肥的效果，且與有機(jī)肥混用時(shí)根腫病危害程度可以減輕50%。綜上所述，迄今為止，世界上尚未見到利用微生物生防制劑成功用于大田防治十字花科根腫病的報(bào)導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的正是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高效、無毒、安全、無殘留，對環(huán)境友好，使用簡便的防治十字花科根腫病的生物制劑。本發(fā)明采用的細(xì)菌是枯草芽孢桿菌(5acz7/^^6"fo)XF-l菌株，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址中國.北京.中關(guān)村；保藏日2008年l月24日，保藏登記入冊的編號CGMCCNO.2357。本發(fā)明的生產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌(5a"7/^犯^/to)XF-1，分離自云南省昆明市官渡區(qū)大板橋鎮(zhèn)大白菜根際土，經(jīng)形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)性狀、常規(guī)生理生化和Biolog全自動(dòng)鑒定系統(tǒng)測定，該菌株為枯草芽孢桿菌的一個(gè)新菌株(Sad//^)XF-1。該菌株具有以下特征(1)在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)初期菌落淡乳白色，膿狀，圓形，邊緣整齊，菌落隆起呈饅頭狀，表面濕潤；培養(yǎng)后期菌落淡黃色，邊緣不整齊，表面干燥有褶皺；在顯微鏡下觀察菌體短桿狀，大小0.70.8X2.02.4ixm;產(chǎn)生芽孢，芽孢中生，橢圓形，孢囊稍膨大，周生鞭毛、具運(yùn)動(dòng)性。(2)該菌株定殖能力強(qiáng)，抑菌能力強(qiáng)，具有殺菌、防病和增產(chǎn)作用。該菌還能在十字花科根際土中定殖。(3)該菌株具有以下生理生化特征革蘭氏染色陽性，好氧生長；能利用糖原、蔗糖、D-乳糖、D-果糖、D-山梨醇、L-鼠李糖、D-甘露醇、檸檬酸鹽，水解明膠、淀粉、酪素，不能水解纖維素，不能水解酪氨酸，具過氧化氫酶，氧化酶活性，V.P.試驗(yàn)陽性，5"U下不能生長，10°C-55"C可生長。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的枯草芽孢桿菌(^d/to^^'to)XF-l菌株的試管培養(yǎng)，搖床擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)制備為生物制劑，然后運(yùn)用于十字花科作物的根際土壤中，測定其對十字花科根腫病的防治效果和十字花科作物產(chǎn)量。本發(fā)明生防菌株枯草芽孢桿菌(&cv7/mXF-1的培養(yǎng)方法(以下為重量百分比)(1)、固體培養(yǎng)接種于固體培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨，0.5%酵母膏，l%NaCl，1.5%瓊脂)中，于3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。(2)、液體培養(yǎng)把生防菌接種于裝有液體培養(yǎng)基(黃豆粉2.0%，玉米粉1.0%，葡萄糖0.3%，蛋白胨0.3%，CaC030.2%，(NH4)2S040.05%,MgS04.7H200.03%，KH2P040.1%，NaOHO.1°/。，花生油0.2%，消泡劑0.01%,pH6.8-7.0。)有500ml三角瓶中，每瓶裝200ml，在3(TC溫度下，轉(zhuǎn)速150-200rpm的搖床上培養(yǎng)48h，即可作為制劑。也可將上述培養(yǎng)液接至發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，獲得液體制劑。發(fā)酵罐中的生產(chǎn)條件罐溫發(fā)酵罐中溫度控制在3(TC37。C,通過插入培養(yǎng)基的溫度計(jì)測量，以夾層內(nèi)通入冷卻水或熱水的方法進(jìn)行調(diào)節(jié)。罐壓發(fā)酵罐的罐壓控制在0.5/平方厘米，通過無菌空氣入口和廢氣排放口進(jìn)行調(diào)節(jié)。攪拌發(fā)酵罐的攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘。抽樣檢査和培養(yǎng)條件調(diào)節(jié)每隔2小時(shí)自取樣管取樣1次，測定pH值，并涂片以結(jié)晶紫染色鏡檢菌體形態(tài)、有無雜菌的污染，觀察菌體是否產(chǎn)生芽孢等，等鏡檢菌體芽孢數(shù)占整個(gè)菌體的5%以上時(shí)，減少通風(fēng)量和降低培養(yǎng)溫度至25'C左右，其他條件不變，繼續(xù)發(fā)酵和抽樣檢查，待芽孢數(shù)占整個(gè)菌體的90%以上時(shí)，停止發(fā)酵和放罐。放罐時(shí)，鏡檢計(jì)數(shù)，并用培養(yǎng)基平板方法進(jìn)行活菌的計(jì)數(shù)。培養(yǎng)周期發(fā)酵罐的培養(yǎng)周期約為36-48小時(shí)。液體發(fā)酵制劑經(jīng)平板計(jì)數(shù)測定含菌量，含菌量達(dá)200億CFU/ml，供田間防治根腫病之用。本發(fā)明生物制劑防治十字花科作物根腫病田間防效試驗(yàn)和增產(chǎn)試驗(yàn)1.制備生物制劑按前述枯草芽孢桿菌(5a"7/^^^"fc)XF-1菌株培養(yǎng)方法制備試驗(yàn)用制劑。2.生防菌XF-1液體制劑對十字花科作物大白菜(品種83-4)、白菜(品種上海青)和甘藍(lán)型油菜(品種花油3號)的根腫病ffl間防效試驗(yàn)和增產(chǎn)試驗(yàn)。2.1供試藥劑及處理A.生防菌XF-1液體制劑100倍稀釋液采用澆根法，在播種時(shí)每株大白菜澆100毫升，每株白菜和每株甘藍(lán)型油菜各澆50毫升；間隔10天后，再澆l次；再間隔15天澆第三次；甘藍(lán)型油菜再間隔20天澆第四次，每株甘藍(lán)型油菜再澆50毫升。B.生防菌XF-l液體制劑200倍稀釋液采用澆根法，在播種時(shí)每株大白菜澆100毫升，每株白菜和每株甘藍(lán)型油菜各澆50毫升；間隔10天后，再澆l次；再間隔15天澆第三次；甘藍(lán)型油菜再間隔20天澆第四次，每株甘藍(lán)型油菜再澆50C.生防菌XF-l液體制劑500倍稀釋液采用澆根法，在播種時(shí)每株大白菜澆100毫升，每株白菜和每株甘藍(lán)型油菜各澆50毫升；間隔10天后，再澆l次；再間隔15天澆第三次；甘藍(lán)型油菜再間隔20天澆第四次，每株甘藍(lán)型油菜再澆50D.對照殺菌劑75%百菌清可濕性粉500倍稀釋液采用澆根法，在播種時(shí)每株大白菜澆100毫升，每株白菜和每株甘藍(lán)型油菜各澆50毫升；間隔10天后，再澆l次；再間隔15天澆第三次；甘藍(lán)型油菜再間隔20天澆第四次，每株甘藍(lán)型油菜再澆50毫升。E.空白對照施用清水，采用澆根法，在播種時(shí)每株大白菜澆100毫升，每株白菜和每株甘藍(lán)型油菜各澆50毫升；間隔10天后，再澆l次；再間隔15天澆第三次；甘藍(lán)型油菜再間隔20天澆第四次，每株甘藍(lán)型油菜再澆50毫升。2.2試驗(yàn)方法供試作物有大白菜、白菜和甘藍(lán)型油菜，試驗(yàn)地點(diǎn)在云南省昆明市盤龍區(qū)大板橋鎮(zhèn)復(fù)興新村。除施藥設(shè)置不同水平外，其他m間管理同常規(guī)生產(chǎn)。試驗(yàn)設(shè)5個(gè)處理，3次重復(fù)，共15個(gè)小區(qū)。小區(qū)面積20平方米，隨機(jī)排列。四周高保護(hù)行，收獲時(shí)每小區(qū)分開測產(chǎn)。2.3調(diào)査方法在白菜和白菜收獲期調(diào)查病情和測定地上部生物學(xué)產(chǎn)量。在甘藍(lán)型油菜收獲期調(diào)查病情和測定經(jīng)濟(jì)學(xué)產(chǎn)量(油菜種子)。大白菜、白菜和甘藍(lán)型油菜根腫病調(diào)査均以根部腫瘤的大小為依據(jù)，采用5個(gè)級別方法進(jìn)行調(diào)査0級無任何腫瘤；l級主根腫大，其直徑小于二倍莖基；3級主根腫大，其直徑為莖基的2-3倍；5級主根腫大，其直徑為莖基的3-4倍；7級主根腫大，其直徑為莖基的4倍以上。死亡植株按7級計(jì)算。E(各級病穗數(shù)X相對級數(shù)值)病情指數(shù)=-----------------------------xioo調(diào)査總穗數(shù)X7防治效果計(jì)算采用與對照相比較，計(jì)算公式如下對照病情指數(shù)_處理病情指數(shù)防治效果(％)=-----------------------------X100對照病情指數(shù)3.試驗(yàn)結(jié)果3.1生防菌XF-1液體制劑防治大白菜根腫病的田間藥效和增產(chǎn)試驗(yàn)效果表1.生防菌XF-1液體制劑防治大白根腫病效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從表1和表2可以看出，生防菌株XF-1液體制劑對大白菜根腫病有很好的防治效果和挽回產(chǎn)量的作用，其中以稀釋100倍的效果最好，在收獲期的防治效果仍達(dá)84.8%，灌根200倍和500倍的防治效果分別達(dá)79.2%和68.6%,明顯高于常用化學(xué)農(nóng)藥75%百菌清可濕性粉500倍稀釋液的防治效果；生防菌株XF-1液體制劑可增加大白菜產(chǎn)量160.3%-190.8%，明顯高于75%百菌清可濕性粉500倍處理的79.4%，即產(chǎn)量是不用藥劑空白對照的2.6-2.9倍，是75%百菌清可濕性粉500倍處理的1.5-1.6倍。3.2生防菌XF-1液體制劑防治白菜根腫病的田間藥效和增產(chǎn)試驗(yàn)效果表3.生防菌XF-1液體制劑防治白菜根腫病效果病情指數(shù)總株平均病株率平均病指防治效果(%)處理重復(fù)I重復(fù)II重復(fù)III數(shù)(株)CK74.172.173.145010073.1稀釋100倍10.211.410.845012.410.883.9稀釋200倍13.314.513.545022.513.879.8稀釋500倍21.624.323.545028.923.167.075%百菌清500倍34.335.637.94505535.949.5表4.生防菌XF-1液體制劑防治白菜根腫病的增產(chǎn)效果處理小區(qū)產(chǎn)量(kg)重復(fù)I重復(fù)IIIII折合畝產(chǎn)j(kg)畝增產(chǎn)(kg)增產(chǎn)率(%)CK稀釋100倍稀釋200倍稀釋500倍75%百菌清500倍24.163.059.449.533.621.163.958.850.633.922.9757.763.12112.01354.3178.759.11970.31212.6160.050.71676.3918.6121.233.31120.0362.347.8從表3和表4可以看出，生防菌株XF-1液體制劑對白菜根腫病有很好的防治效果和挽回產(chǎn)量的作用，其中以稀釋100倍的效果最好，在收獲期的防治效果仍達(dá)83.9%，灌根200倍和500倍的防治效果分別達(dá)79.8%和67.0%，明顯高于常用化學(xué)農(nóng)藥75%百菌清可濕性粉500倍稀釋液的防治效果；生防菌株XF-1液體制劑可增加大白菜產(chǎn)量121.2%-178.7%，明顯高于75%百菌清可濕性粉500倍處理的47.8%,即產(chǎn)量是不用藥劑空白對照的2.2-2.8倍，是75%百菌清可濕性粉500倍處理的1.5-1.9倍。3.3生防菌XF-1液體制劑防治油菜根腫病的田間藥效和增產(chǎn)試驗(yàn)效果表5.生防菌XF-l液體制劑防治甘藍(lán)型油菜根腫病效果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表6.生防菌XF-1液體制劑防治甘藍(lán)型油菜根腫病的增產(chǎn)效果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>從表5和表6可以看出，生防菌株XF-1液體制劑對甘藍(lán)型油菜根腫病有很好的防治效果和挽回產(chǎn)量的作用，其中以稀釋IOO倍的效果最好，在收獲期的防治效果仍達(dá)84.9%，灌根200倍和500倍的防治效果分別達(dá)81.86%和74.3%，明顯高于常用化學(xué)農(nóng)藥75%百菌清可濕性粉500倍稀釋液的防治效果；生防菌株XF-1液體制劑可增加甘藍(lán)型油菜產(chǎn)量105.2%-144.7%，明顯高于75%百菌清可濕性粉500倍處理的44.6%，即產(chǎn)量是不用藥劑空白對照的2.1-2.4倍，是75%百菌清可濕性粉500倍處理的1.4-1.7倍。在大白菜、白菜和甘藍(lán)型油菜的應(yīng)用結(jié)果表明，以生防菌株XF-1為基礎(chǔ)的生防制劑具有很好的控制根腫病的效果和增產(chǎn)作用，己具備了生產(chǎn)上大量推廣應(yīng)用的基本條件。本發(fā)明的制劑已在云南省昆明市盤龍區(qū)大板橋鎮(zhèn)進(jìn)行了田間小區(qū)防效試驗(yàn)，證明該生防制劑防治效果顯著、穩(wěn)定，可以有效地解決長期困擾農(nóng)民的十字花科根腫病的防治難題，對大白菜、白菜和甘藍(lán)型油菜油菜根腫病的防治效果達(dá)68.6-84.8%。具體實(shí)施例方式本生防制劑可以與其他的殺真菌農(nóng)藥、植物生長調(diào)節(jié)劑混合使用，但必須保證所混藥劑對本發(fā)明采用的枯草芽孢桿菌(&"7/1^^&//&)XF-l無副作用。本發(fā)明的細(xì)菌生防制劑一般在作物播種期、播種后10天、播種后25天及此后的每隔15天左右再次施用。方法是將菌液用清水稀釋100-500倍液，澆灌于植株的根部。本發(fā)明具有對十字花科根腫病防治效果顯著，適用于十字花科作物的生長前期和中期，其有成本低、使用簡便、有效期較長等特點(diǎn)。下面用實(shí)施實(shí)例來進(jìn)一歩詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實(shí)施例一將枯草芽孢桿菌(Ba"7/Mw6"fc)XF-1轉(zhuǎn)到試管斜面培養(yǎng)基上，試管斜面培養(yǎng)的配方為1%胰蛋白胨，0.5%酵母膏，1%NaCl，1.5%瓊脂，pH7.0。在30。C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，獲得試管種。液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方黃豆粉2.0%，玉米粉1.0%，葡萄糖0.3%，蛋白胨0.3%，CaC030.2%，(NH4)2S040.05%，MgS04.7H200.03%，KH2P040.1%，NaOH0.1%，花生油0.2%,消泡劑0.01%，pH6.8-7.0;將試管種接種到500ral三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，在30'C下，轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床上培養(yǎng)48h，所得培養(yǎng)液即為本發(fā)明的生物制劑。實(shí)施例二首先將獲得試管種(同實(shí)施例一)，將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為黃豆粉2.0%，玉米粉1.0%，葡萄糖0.3%,蛋白胨0.3%，CaC030.2%，(Iffl4)2S040.05%，MgS04.7H200.03%,KH2P040.1%，NaOH0.1%，花生油0.2%，消泡劑0.01%，pH6.8-7.0。在3(TC下，轉(zhuǎn)速為180rpm的搖床上培養(yǎng)48h，所得培養(yǎng)液即為本發(fā)明的生物制劑。實(shí)施例三首先將獲得試管種(同實(shí)施例一)，將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為黃豆粉2.0%,玉米粉1.0%，葡萄糖0.3%，蛋白胨0.3%，CaC030.2%，(NH4)2S040.05%，MgS04.7H200.03%,KH2P040.1%，NaOH0.1%,花生油0.2%，消泡劑0.01%，pH6.8-7.0。在3(TC下，轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上培養(yǎng)48h，所得培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，獲得發(fā)酵液即為本發(fā)明的生物制劑。發(fā)酵罐中的生產(chǎn)條件罐溫發(fā)酵罐中溫度控制在3(TC37"C,通過插入培養(yǎng)基的溫度計(jì)測量，以夾層內(nèi)通入冷卻水或熱水的方法進(jìn)行調(diào)節(jié)。罐壓發(fā)酵罐的罐壓控制在0.5/平方厘米，通過無菌空氣入口和廢氣排放口進(jìn)行調(diào)節(jié)。攪拌發(fā)酵罐的攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘。抽樣檢査和培養(yǎng)條件調(diào)節(jié)每隔2小時(shí)自取樣管取樣1次，測定pH值，并涂片以結(jié)晶紫染色鏡檢菌體形態(tài)、有無雜菌的污染，觀察菌體是否產(chǎn)生芽孢等，等鏡檢菌體芽孢數(shù)占整個(gè)菌體的5%以上時(shí)，減少通風(fēng)量和降低培養(yǎng)溫度至25'C左右，其他條件不變，繼續(xù)發(fā)酵和抽樣檢査，待芽孢數(shù)占整個(gè)菌體的90%以上時(shí)，停止發(fā)酵和放罐。放罐時(shí)，鏡檢計(jì)數(shù)，并用培養(yǎng)基平板方法進(jìn)行活菌的計(jì)數(shù)。培養(yǎng)周期發(fā)酵罐的培養(yǎng)周期約為36-48小時(shí)。權(quán)利要求1、一種防治十字花科根腫病的生物制劑，其特征在于該制劑的生產(chǎn)菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)XF-1，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日2008年1月24日，保藏號CGMCCNO.2357。2、權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌(Sac!7/^幼6"fc)XF-1，菌株的培養(yǎng)方法，其特征在于所述菌株是經(jīng)過常規(guī)的液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)獲得的，其液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下(1)液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方黃豆粉2.0%，玉米粉1.0%,葡萄糖0.3%，蛋白胨O.3%，CaC030.2%，(NH4)2S040.05%，MgS04.7H200.03%，KH2P040.1%，NaOH0.1%，花生油0.2%,消泡劑0.01%,pH6.8-7.0;(2)固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方1%胰蛋白胨，0.5%酵母膏，l%NaCl，1.5%瓊脂pH6.8—7.0。3、權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌(&"7/^^^)XF-l菌株在防治十字花科根腫病中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種防治十字花科根腫病的生物制劑及其應(yīng)用，屬生物農(nóng)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。其生產(chǎn)菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillussubtilis)XF-1菌株，保藏號CGMCCNO.2357。該菌株有以下特征(1)在LB培養(yǎng)基上初期菌落淺白色，圓形，表面濕潤；后期菌落淡黃色，邊緣不整，表面干皺；在顯微鏡下觀察菌體短桿狀，有芽孢，周鞭、能運(yùn)動(dòng)，大小0.7～0.8×2.0～2.4μm。(2)革蘭氏陽性，好氧；利用糖原、蔗糖、檸檬酸鹽，水解明膠、淀粉、酪素，不利用纖維素和酪氨酸，過氧化氫酶陽性。(3)有殺菌、防病和增產(chǎn)作用。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的解淀粉芽孢桿菌XF-1菌株的試管和搖床培養(yǎng)以及發(fā)酵培養(yǎng)液制備為生物制劑，然后施用于十字花科作物根際土壤中，有很好的防治和增產(chǎn)效果，易于工廠生產(chǎn)。文檔編號C12N1/20GK101416641SQ200810058919公開日2009年4月29日申請日期2008年9月12日優(yōu)先權(quán)日2008年9月12日發(fā)明者何月秋,熊國如,范成明申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)