專利名稱：：釀酒酵母CGMCCNo.2266及其在制備(S)-(-)-β-羥基苯丙酸乙酯中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一株微生物新菌林釀酒酵母CGMCCNo.2266及其在微生物轉(zhuǎn)化制備(s)-(-)-p-羥基苯丙酸乙酯中的應(yīng)用。(二)
背景技術(shù)：
(S)-(-)-(3-i^基苯丙酉吏乙面旨((S)-(-)-Beta-hydroxy-benzenepropanoicacidethylester),分子式為CH1403，分子量194.23。(S)-(-)-卩-羥基苯丙酸乙酯是合成(S)-氟西汀的重要中間體。(S)-氟西汀在人體內(nèi)的作用時間是(R)-氟西汀的3倍。鹽酸氟西汀商品名百憂解，是一種選^^性的5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRI),其能有效地抑制神經(jīng)元從突觸間隙中攝取5-羥色胺，增加間隙中可供實(shí)際利用的這種神經(jīng)遞質(zhì)，從而改善情感狀態(tài)，治療抑郁性精神障礙。適應(yīng)于各種抑郁性精神障礙、包括輕性或重性抑郁癥、雙相情感性精神障礙的抑郁癥，心因性抑郁及抑郁性神經(jīng)癥。(S)-(-H3-羥基苯丙酸乙酯的合成途徑主要有化學(xué)法和生物轉(zhuǎn)化法兩種。在化學(xué)催化劑或生物催化劑的作用下，還原(3-羰基苯丙酸乙酯可以獲得(S)-(-)-(3-羥基苯丙酸乙酯。采用化學(xué)法不對稱還原(3-羰基苯丙酸乙酯需要在手性催化劑的催化下才能完成，化學(xué)還原過程中手性催化劑價格昂貴、制備過程繁瑣。采用含有羰基還原酶的微生物細(xì)胞為生物催化劑不對稱還原P-羰基苯丙酸乙酯具有反應(yīng)條件溫和、立體選擇性好、成本低廉的特點(diǎn)，又被稱為手性化合物的綠色合成技術(shù)。微生物細(xì)胞中含有羰基還原酶的輔酶NAD(P)H，可以為還原過程提供供氬體，有利于實(shí)現(xiàn)輔酶NAD(P)H的原位再生，提高還原反應(yīng)效率。利用微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)(S)-(-)-p-羥基苯丙酸乙酯是一種科學(xué)、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好的合成方法。采用微生物轉(zhuǎn)化法還原p-羰基苯丙酸乙酯制備(s)-(-)-p-羥基苯丙酸乙酯未見專利報(bào)道，只有少數(shù)公開發(fā)表的文章報(bào)道如下2005年，巴西科研工作者JoyceBenzaquemRibeiro等人采用游離的釀酒酵母(&cc/7<3ro，cescerevzi/ae)、漢遜酵母(//<ms*e"w/as/.)、馬克思克魯纟,酵母(A7w"eram少cesmao:z'(3m^)禾口白i也霉(G^ofn'c/ww>sp.)在水相中不對稱還原p_羰基苯丙酸乙酯制備(s)-(-)-p-羥基苯丙酸乙酯。2006年，德國科研工作者H.Engelking等人采用釀酒酵母)和枯草芽孢桿菌(^"c/〃w"wto7^)在水相中不對稱還原(3-羰基苯丙酸乙酯制備(S)-(-)-P-羥基苯丙酸乙酯。上述的研究中共同的特點(diǎn)有兩個一是，均采用游離的細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。游離細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化過程不利于產(chǎn)物的后續(xù)分離才是^^和生物催化劑的重復(fù)利用。二是，均在水相中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。由于有機(jī)底物(3-羰基苯丙酸乙酯在水中的溶解度極小，有機(jī)底物對細(xì)胞也會造成一定的毒害作用，細(xì)胞催化忍受不了大量的底物，因此生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)能力較低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種可供生物轉(zhuǎn)化p-羰基苯丙酸乙酯為(s)-(-)-卩-羥基苯丙酸乙酯的微生物新菌種釀酒酵母CGMCCNo.2266，以及利用該菌抹生物轉(zhuǎn)化(3-羰基苯丙酸乙酯合成(s)-(-)-P-羥基苯丙酸乙酯的方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是釀酒酵母CGMCCNo.2266,保藏于中國普通《敖生物菌種保藏管理中心，地址北京市朝陽區(qū)大屯路中科院微生物研究所，保藏編號CGMCCNo.2266，保藏日期2007年11月26日。菌林來源本發(fā)明中所述的微生物菌林釀酒酵母CGMCCNo.2266是從杭州西湖啤酒廠附近的土壤中篩選得到。將土壤中分離得到的菌抹用于轉(zhuǎn)化卩-羰基苯丙酸乙酯，得到釀酒酵母CGMCCNo.2266具有良好的轉(zhuǎn)化卩-羰基苯丙酸乙酯生產(chǎn)(s)-(-)-P-羥基苯丙酸乙酯的能力。所述釀酒酵母CGMCCNo.2266的菌落特征在瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出乳白色、有光澤、平坦、邊緣整齊、濕潤、表面光滑，質(zhì)地均勻的菌落形態(tài)。釀酒酵母CGMCCNo.2266可應(yīng)用于微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-(-)-P-羥基苯丙酸乙酯。具體的，所述應(yīng)用為以p-羰基苯丙酸乙酯為底物，以釀酒酵母CGMCCNo.2266發(fā)酵獲得的發(fā)酵液再制得的固定化細(xì)胞顆粒為生物催化劑，在鄰苯二曱酸二丁酯中，于25-35。C轉(zhuǎn)化反應(yīng)8~72小時，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述(s)-(-)-p-羥基苯丙酸乙酯。所述發(fā)酵培養(yǎng)可按常規(guī)方法進(jìn)行，在常規(guī)適用于釀酒酵母的培養(yǎng)基中、常規(guī)適用于釀酒酵母發(fā)酵的條件下進(jìn)行。所述鄰苯二曱酸二丁酯中底物p-羰基苯丙酸乙酯的初始濃度為5.15~100.0mmol/L。催化劑用量為每L鄰苯二曱酸二丁酯中含有的菌體干重相當(dāng)于以包埋法將0.330L菌體濃度為3.010.0g/L的發(fā)酵液制成固定化細(xì)胞顆粒在液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)1672小時后獲得的增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒的菌體干重；所述發(fā)酵液中菌體濃度定義為菌體干重與發(fā)酵液體積之比。交聯(lián)法、載體結(jié)合法等，其中包埋法最為常用，包埋法的原理是將微生物細(xì)胞截留在水不溶性的凝膠聚合物孔隙的網(wǎng)絡(luò)空間中，通過聚合作用或通過離子網(wǎng)絡(luò)形成，或通過沉淀作用，或改變?nèi)軇囟?、pH值使細(xì)胞截留、凝膠聚合物的網(wǎng)絡(luò)可以阻止細(xì)胞的泄露，同時能讓底物物質(zhì)滲入進(jìn)去和產(chǎn)物擴(kuò)散出來。作為包埋載體，天然高分子多糖類的海藻酸鈉和卡拉膠應(yīng)用最多，它們具有固化、成形方便，對微生物毒性小及固定化密度高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明中所述固定化細(xì)胞顆粒推薦由如下方法制備得到將經(jīng)釀酒酵母CGMCCNo.2266發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液與等體積1~5%(w/w%)的海藻酸鈉溶液相混合，所述的發(fā)酵液菌體濃度為3.010.0g/L,攪拌均勻得到混合液，將混合液逐滴滴入濃度為2.54.0%(w/w%)的氯化鈣溶液中，連續(xù)攪拌，含有菌體的海藻酸鈉混合液固化形成凝膠珠固定化顆粒，將得到的固定化懸浮液放置于3538。C條件下固化，得到的固定化顆粒用無菌生理鹽水洗滌，獲得固定化細(xì)胞顆粒，將得到的固定化顆粒分散于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)1672h獲得增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒，以增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒為生物催化劑。所述固定化細(xì)胞顆粒粒徑可通過注射器的針頭尺寸來控制，推薦為l~5mm,最優(yōu)為2mm左右。在包埋處理過程中，海藻酸鈉的濃度推薦為15%,最優(yōu)為2%。推薦按如下方法獲得發(fā)酵液(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CGMCCNo.2266接種至斜面培養(yǎng)基，2635。C培養(yǎng)4-6天得到斜面菌種；斜面培養(yǎng)基終濃度組成為麥芽汁515g/L,酵母粉24g/L,蛋白胨46g/L，葡萄糖7~12g/L，瓊脂1525g/L,溶劑為水，pH自然；滅菌后冷卻制成斜面；(2)種子培養(yǎng)將斜面菌種接種至種子培養(yǎng)基，28~32°C、150~200r/min培養(yǎng)18~28h,得種子液；種子培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖2632g/L,酵母粉24g/L,硫酸銨36g/L,無水MgS040.2~0.4g/L,K2HPO4-3H200.5~1.5g/L，KH2P040.61.5g/L,溶劑為水，pH自然，滅菌后冷卻；(3)將種子液以體積比520%的接種量，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，28~32°C、150200r/min培養(yǎng)1828h,得發(fā)酵液；發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖2632g/L，酵母粉24g/L，硫酸銨3~6g/L，無水MgS040.2~0.4g/L，K2HPO4'3H200.51.5g/L，KH2P040.61.5g/L,溶劑為水，pH自然，滅菌后冷卻。推薦按如下方法獲得所述的生物催化劑將發(fā)酵液與等體積2%的海藻酸鈉溶液相混合，所述的發(fā)酵液菌體濃度為4.3g/L,攪拌均勻得到混合液，將混合液逐滴滴入3.5。/。的氯化鈣溶液中，連續(xù)攪拌，含有菌體的海藻酸鈉混合液固化形成凝膠珠固定化顆粒，將得到的固定化懸浮液放置于37。C條件下固化，得到的固定化顆粒用無菌生理鹽水洗滌，獲得固定化細(xì)胞顆粒；得到的固定化細(xì)胞顆粒分散于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)24h，獲得增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒，以增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒為生物催化劑。本發(fā)明采用固定化細(xì)胞顆粒作為催化劑，將(3-羰基苯丙酸乙酯還原為(S)-(-)-(3-羥基苯丙酸乙酯的生物轉(zhuǎn)化機(jī)理如下:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(SH-)-p-羥基苯丙酸乙酯具體的，所述的應(yīng)用為以(3-羰基苯丙酸乙酯為底物，以增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒為生物催化劑，在鄰苯二曱酸二丁酯中，于30°C、180r/min條件下轉(zhuǎn)化反應(yīng)72小時，轉(zhuǎn)化液過濾，取濾液脫去溶劑鄰苯二甲酸二丁酯，再經(jīng)硅膠柱層析分離，得到所述(S)-(-)-P-羥基苯丙酸乙酯；鄰苯二曱酸二丁酯中，底物P-羰基苯丙酸乙酯初始濃度為5.15100mmol/L,每L鄰苯二曱酸二丁酯中含有的菌體干重相當(dāng)于以包埋法將0.330L菌體濃度為4.3g/L的發(fā)酵液制成固定化顆粒在發(fā)酵培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)24d、時后獲得的增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒的菌體干重。得到的(s)-(-)-p-羥基苯丙酸乙酯純品用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行;險(xiǎn)測確定產(chǎn)物的純度和分子量。摩爾轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物(S)-(-)-P-羥基苯丙酸乙酯對映體過剩值(ee%)的確定采用安捷倫1200液相色譜儀分析檢測。色譜柱為手性柱，型號為DaicelOB;流動相為正己烷/異丙醇(80/20);紫外檢測波長為254nm。手性柱可以檢測到(R)-(-)-(3-羥基苯丙酸乙酯和(s)-(-)-p-羥基苯丙酸乙酯兩種對映體的含量，進(jìn)一步計(jì)算出反應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率和(S)-(-)-(3-羥基苯丙酸乙酯的對映體過剩值(ee%)。采用的微生物轉(zhuǎn)化法制備(s)-(-)-p-羥基苯丙酸乙酯與化學(xué)合成法相10比具有以下優(yōu)點(diǎn)①生物催化劑比化學(xué)催化劑成本低廉。②環(huán)境友好，反應(yīng)條件溫和，常溫常壓下即可順利進(jìn)行轉(zhuǎn)化。③生產(chǎn)所用的菌林安全無毒。④不受季節(jié)影響，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。⑤生產(chǎn)操作簡便，生物轉(zhuǎn)化率4交高。采用固定化細(xì)胞在鄰苯二曱酸二丁酯中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化與傳統(tǒng)的生物轉(zhuǎn)化相比具有如下優(yōu)點(diǎn)①固定化細(xì)胞作為生物催化劑有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的分離提取。②固定化細(xì)胞作為生物催化劑有利于實(shí)現(xiàn)催化劑的重復(fù)利用，節(jié)約成本。③易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。④鄰苯二曱酸二丁酯可以溶解大量的底物和產(chǎn)物，可以降低有機(jī)底物和產(chǎn)物對生物催化反應(yīng)過程的抑制作用，提高底物的轉(zhuǎn)化量，提高生物轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)效率。本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在提供了一林可供生物轉(zhuǎn)化(3-羥基苯丙酸乙酯為(S)-(-)-f3-羥基苯丙酸乙酯的新菌林，利用本發(fā)明方法生產(chǎn)的(S)-(-)-(3-羥基苯丙酸乙酯對映體過剩值大于99.0%,底物摩爾轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到92.2%,產(chǎn)品純度達(dá)到99.8%，硅膠柱層析產(chǎn)物提取收率為95.6%,固定化細(xì)胞顆粒可以重復(fù)利用10次。(四)圖1為本發(fā)明實(shí)施例1工藝流程圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不Y義限于此實(shí)施例1:工藝流程圖參見圖1。斜面培養(yǎng)將CGMCCNo.2266菌種接種至斜面培養(yǎng)基，30。C培養(yǎng)4~6天，得斜面菌種。斜面培養(yǎng)基配制麥芽汁10g，酵母粉3g，蛋白胨5g,葡萄糖10g，瓊脂20g,水1000g，pH自然，121。C滅菌20分鐘，冷卻制成斜面。種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)種子和發(fā)酵培養(yǎng)基均采用液體培養(yǎng)基，按如下組成配制葡萄糖30g，酵母粉3g，硫酸銨5g，無水MgS040.25g,K2HP04.3H20lg，KH2P041g,水1000g,pH自然，121。C滅菌20分鐘，冷卻備用。用接種針從斜面培養(yǎng)基中取一環(huán)斜面菌種接種在含有100ml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于30。C、180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得種子液。將種子液以體積比10%的接種量接種于含有100ml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得發(fā)酵液，用獲得的發(fā)酵液用于菌體的固定化。將5瓶菌體干重為430mg的100ml發(fā)酵液分別與100ml的濃度為1%、2%、3%、4%和5%(w/w%)的海藻酸鈉溶液混合制成混合液，將混合液分別裝入注射器，滴入3.5%(w/w%)CaCl2溶液中形成固定化顆粒，顆粒直徑大小為2mm，于37。C固化30min，得到的固定化顆粒用無菌生理鹽水洗滌，洗去過量的鈣離子和未捕獲的細(xì)胞，將獲得的固定化細(xì)胞顆粒繼續(xù)在液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)24h。將上述5種增殖培養(yǎng)好的固定化細(xì)胞顆粒分別加入到含有15.45mmoip-羰基苯丙酸乙酯的300ml鄰苯二曱酸二丁酯中，30°C、180r/min的條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化72h，轉(zhuǎn)化過程中每隔8h耳又樣，采用液相色譜測定產(chǎn)物含量和對映體過剩值，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，固定化過程中，海藻酸鈉的濃度對固定化細(xì)胞顆粒的生物轉(zhuǎn)化能力有影響，當(dāng)海藻酸鈉的濃度為最佳濃度2%時，生物轉(zhuǎn)化的摩爾轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到72.8%,在5種不同濃度的海藻酸鈉包埋條件下獲得的固定化CGMCCNo.2266顆粒轉(zhuǎn)化底物所得到的(S)-(-)-(3-羥基苯丙酸乙酯的對映體過剩值均大于99.0%。表1:不同濃度的海藻酸鈉溶液固定化CGMCCNo.2266轉(zhuǎn)化(3-羰基苯丙酸乙酯<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例2:將CGMCCNo.2266按照實(shí)例1中的方法培養(yǎng)獲得菌體發(fā)酵液。將4瓶菌體干重為430mg的100ml發(fā)酵液分別與100ml濃度為2%(w/w%)的海藻酸鈉溶液混合制成混合液，將混合液分別裝入針頭尺寸不同的注射器中，滴入3.5%(w/w%)CaCl2溶液中形成固定化顆粒，形成的固定化顆庫立直徑大小分別為2mm、3mm、4mm和5mm，于37°C固4匕30min，得到的固定化顆粒用無菌生理鹽水洗滌，洗去過量的鈣離子和未捕獲的細(xì)說明書第10/14頁胞，將獲得的固定化細(xì)胞顆粒繼續(xù)在液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)24h。將上述4種增殖培養(yǎng)好的固定化細(xì)胞顆粒分別加入到含有15.45mmoip-羰基苯丙酸乙酯的300ml鄰苯二曱酸二丁酯中，30°C、180r/min的條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化72h,轉(zhuǎn)化過程中每隔8h取樣，釆用液相色譜測定產(chǎn)物含量和對映體過剩值，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，固定化細(xì)胞顆粒直徑的不同對生物轉(zhuǎn)化的摩爾轉(zhuǎn)化率有影響，當(dāng)最佳固定化細(xì)胞顆粒直徑為2mm時，生物轉(zhuǎn)化的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到72.8%,以上述四種直徑的固定化顆粒作為催化劑制備的(s)-(-)-p-羥基苯丙酸乙酯的對映體過剩值均大于99.0%。表2:不同粒徑的固定化細(xì)胞顆粒轉(zhuǎn)化(3-羰基苯丙酸乙酯<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例3:將CGMCCNo.2266按照實(shí)例1中的方法培養(yǎng)獲得菌體發(fā)酵液。將4瓶菌體干重為430mg的發(fā)酵液100ml分別與100ml濃度為2%(w/w%)的海藻酸鈉溶液混合制成混合液，將混合液分別裝入注射器中，滴入3.5%(w/w。/。)CaCl2溶液中形成固定化顆粒，形成的固定化顆粒直徑為2mm，于37。C固化30min，得到的固定化顆粒用無菌生理鹽水洗滌，洗去過量的鈣離子和未捕獲的細(xì)胞，將獲得的4瓶固定化細(xì)胞顆粒分別繼續(xù)在液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)0h、24h、48h和72h。將上述4種增殖培養(yǎng)好的固定化細(xì)胞顆粒分別加入含有15.45mmol卩-羰基苯丙酸乙酯的300ml鄰苯二曱酸二丁酯中，30°C、180r/min的條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化72h,轉(zhuǎn)化結(jié)束后，采用液相色i普測定產(chǎn)物含量和對映體過剩值，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，固定化細(xì)胞顆粒的增殖培養(yǎng)時間越長越有利于摩爾轉(zhuǎn)化率的提高，增殖培養(yǎng)時間達(dá)到72h的固定化細(xì)胞顆粒用于轉(zhuǎn)化|3-羰基苯丙酸乙酯摩爾轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到79.8%，以上述4(S)-(-)-(3-羥基苯丙酸乙酯的對映體過剩值均大于99.0%。表3:不同增殖培養(yǎng)時間的固定化細(xì)胞顆粒轉(zhuǎn)化p-羰基苯丙酸乙酯增殖培養(yǎng)時間(h)0244872摩爾轉(zhuǎn)化率(％)072.876.579.8實(shí)施例4:將CGMCCNo.2266按照實(shí)例1中的方法培養(yǎng)獲得菌體發(fā)酵液。將菌體干重為430mg的發(fā)酵液100ml與等100ml濃度為2%(w/w%)的海藻酸鈉溶液混合制成混合液，將混合液裝入注射器中，滴入3.5%(w/w%)CaCl2溶液中形成固定化顆粒，形成的固定化顆粒直徑為2mm,于37°C固化30min,得到的固定化顆粒用無菌生理鹽水洗滌，洗去過量的鈣離子和未捕獲的細(xì)胞，將獲得的固定化細(xì)胞顆粒繼續(xù)在液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)72h。將上述增殖培養(yǎng)好的固定化細(xì)胞顆粒加入到含有15.45mmol卩-羰基苯丙酸乙酯的300ml鄰苯二甲酸二丁酯中，30°C、180r/min的條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化72h,轉(zhuǎn)化結(jié)束后過濾出固定化細(xì)胞顆粒，將固定化細(xì)胞顆粒重新懸浮在300ml鄰苯二曱酸二丁酯中，30°C、180r/min的條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化72h，如此重復(fù)利用固定化細(xì)胞顆粒IO次，每次都采用液相色譜測定產(chǎn)物含量和對映體過剩值。結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，固定化細(xì)胞顆?？梢?艮好地重復(fù)利用于(SH-)-P-羥基苯丙酸乙酯的生物合成，產(chǎn)物(S)-(-)-(3-羥基苯丙酸乙酯的對映體過剩值均大于99.0%,第10次的摩爾轉(zhuǎn)化率為第一次摩爾轉(zhuǎn)化率的48.4%。表4:固定化CGMCCNo.2266轉(zhuǎn)化(3-羰基苯丙酸乙酯的重復(fù)利用<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例5:將CGMCCNo.2266按照實(shí)例1中的方法培養(yǎng)獲得菌體發(fā)酵液。將菌體干重為430mg的100ml發(fā)酵液與100ml濃度為2%(w/w%)的海藻酸鈉溶液混合制成混合液，將混合液裝入注射器中，滴入3.5%(w/w%)CaCl2溶液中形成固定化顆粒，形成的固定化顆粒直徑為2mm,于37°C固化30min,得到的固定化顆粒用無菌生理鹽水洗滌，洗去過量的4丐離子和未捕獲的細(xì)胞，將獲得的固定化細(xì)胞顆粒繼續(xù)在液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)72h。將上述增殖培養(yǎng)好的固定化細(xì)胞顆粒加入到5瓶(3-羰基苯丙酸乙酯初始濃度分別為17.17mmol/L、34.33mmol/L、51.5mmol/L、68.67mmol/L和85.83mmol/L的300ml鄰苯二曱酸二丁酯中，30°C、180r/min的條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化72h,結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明，底物初始濃度對固定化細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化P-羰基苯丙酸乙酯的摩爾轉(zhuǎn)化率有較大影響。反應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率隨著底物濃度的提高而降低。說明底物的量增高對生物轉(zhuǎn)化存在抑制作用。當(dāng)?shù)孜锍跏紳舛葹?7.17mmol/L時，反應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到92.2%。在上述5種不同的底物初始濃度條件下的生物轉(zhuǎn)化過程中，產(chǎn)物(S)-(-)-(3-羥基苯丙酸乙酯的對映體過剩值均大于99.0%。表5:固定化CGMCCNo.2266轉(zhuǎn)化不同初始濃度的卩-羰基苯丙酸乙酯<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)施例6:將CGMCCNo.2266按照實(shí)例1中的方法培養(yǎng)獲得菌體發(fā)酵液。將菌體干重為430mg的100ml發(fā)酵液與100ml濃度為2%(w/w%)的海藻酸鈉溶液混合制成混合液，將混合液裝入注射器中，滴入3.5%(w/w%)CaCl2溶液中形成固定化顆粒，形成的固定化顆粒直徑為2mm，于37°C固化30min,得到的固定化顆粒用無菌生理鹽水洗滌，洗去過量的4丐離子和未捕獲的細(xì)胞,將獲得的固定化細(xì)胞顆粒繼續(xù)在液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)72h。將上述增殖培養(yǎng)好的固定化細(xì)胞顆粒加入到300ml鄰苯二甲酸二丁酯中，轉(zhuǎn)化開始時力口入底物5.15mmol,間隔12h加入5.15mmol底物，共加入底物15.45mmol,30°C、180r/min的條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化72h，轉(zhuǎn)化結(jié)束后用液相色譜測定產(chǎn)物含量和對映體過剩值。結(jié)果表明，分批加入底物有利于提高反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率。一次性加入15.45mmol底物的摩爾轉(zhuǎn)化率為79.8%,即可以生成12.33mmol(S)-(-)-(3-羥基苯丙酸乙酯。按上述方法分3次加入底物的總轉(zhuǎn)化率為92.0%,即可以生成14.21mmol(S)-(-)-(3-羥基苯丙酸乙酯，產(chǎn)物的對映體過剩值大于99.0%。權(quán)利要求1.釀酒酵母CGMCCNo.2266，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，地址北京市朝陽區(qū)大屯路中科院微生物研究所，保藏編號CGMCCNo.2266，保藏日期2007年11月26日。2.釀酒酵母CGMCCNo.2266在微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-(-)-P-羥基苯丙酸乙酯中的應(yīng)用。3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為以(3-羰基苯丙酸乙酯為底物，以釀酒酵母CGMCCNo.2266發(fā)酵獲得的發(fā)酵液再制得的固定化細(xì)胞顆粒為生物催化劑，在鄰苯二曱酸二丁酯中，于2535。C轉(zhuǎn)化反應(yīng)8~72小時，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述(S)-(-)-(3-羥基苯丙酸乙酯。4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述鄰苯二曱酸二丁酯中底物卩-羰基苯丙酸乙酯的初始濃度為5.15100.0mmol/L。5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于每L鄰苯二曱酸二丁酯中含有的菌體干重相當(dāng)于以包埋法將0.330L菌體濃度為3.0~10.0g/L的發(fā)酵液制成固定化細(xì)胞顆粒在液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)1672小時后獲得的增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒的菌體干重；所述發(fā)酵液中菌體濃度定義為菌體干重與發(fā)酵液體積之比。6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述固定化細(xì)胞顆粒由如下方法制備得到將經(jīng)釀酒酵母CGMCCNo.2266發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液與等體積15%的海藻酸鈉溶液相混合，所述的發(fā)酵液菌體濃度為3.010.0g/L,攪拌均勻得到混合液，將混合液逐滴滴入2.5-4.0%的氯化4丐溶液中，連續(xù)攪拌，含有菌體的海藻酸鈉混合液固化形成凝膠珠固定化顆粒，將得到的固定化懸浮液放置于3538。C條件下固化，得到的固定化顆粒用無菌生理鹽水洗滌，獲得固定化細(xì)胞顆粒，將得到的固定化顆粒分散于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)16~72h獲得增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒，以增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒為生物催化劑。7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述固定化細(xì)胞顆粒粒徑為15mm。8.如權(quán)利要求27之一所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用按如下方法獲得發(fā)酵液(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CGMCCNo.2266接種至斜面培養(yǎng)基，2635"C培養(yǎng)46天得到斜面菌種；斜面培養(yǎng)基終濃度組成為麥芽汁515g/L，酵母粉24g/L，蛋白胨46g/L，葡萄糖7~12g/L,瓊脂15-25g/L，溶劑為水，pH自然；滅菌后冷卻制成斜面；(2)種子培養(yǎng)將斜面菌種接種至種子培養(yǎng)基，28~32°C、150~200r/min培養(yǎng)18~28h，得種子液；種子培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖26-32g/L,酵母粉24g/L,硫酸銨36g/L,無水MgS040.20.4g/L,K2HPO4'3H200.51.5g/L,KH2P040.6~1.5g/L，；;容劑為7JC，pH自然，滅菌后冷卻；(3)將種子液以體積比520%的接種量，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，2832°C、150~200r/min培養(yǎng)1828h,得發(fā)酵液；發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖26~32g/L,酵母粉2~4g/L,硫酸銨3~6g/L,無水MgS040.20.4g/L,K2HPO4'3H200.51.5g/L,KH2P040.6~1.5g/L,溶劑為水，pH自然，滅菌后冷卻。9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于按如下方法獲得所述的生物催化劑將發(fā)酵液與等體積2%的海藻酸鈉溶液相混合，所述的發(fā)酵液菌體濃度為4.3g/L，攪拌均勻得到混合液，將混合液逐滴滴入3.5%的氯化4丐溶液中，連續(xù)攪拌，含有菌體的海藻酸鈉混合液固化形成凝膠珠固定化顆粒，將得到的固定化懸浮液;^丈置于37。C條件下固化，得到的固定化顆粒用無菌生理鹽水洗滌，獲得固定化細(xì)胞顆粒；得到的固定化細(xì)胞顆粒分散于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)24h,獲得增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒，以增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒為生物催化劑。10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為以(3-羰基苯丙酸乙酯為底物，以增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒為生物催化劑，在鄰苯二曱酸二丁酯中，于30。C、180r/min條件下轉(zhuǎn)化反應(yīng)72小時，轉(zhuǎn)化液過濾，取濾液脫去溶劑鄰苯二曱酸二丁酯，再經(jīng)硅膠柱層析分離，得到所述(SH-)-P-輕基苯丙酸乙酯；鄰苯二曱酸二丁酯中，底物p-羰基苯丙酸乙酯初始濃度為5.15~100mmol/L，每L鄰苯二甲酸二丁酯中含有的菌體干重相當(dāng)于以包埋法將0.330L菌體濃度為4.3g/L的發(fā)酵液制成固定化顆粒在發(fā)酵培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)24小時后獲得的增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒的菌體干重。全文摘要本發(fā)明提供了一株微生物新菌株釀酒酵母CGMCCNo.2266及其在微生物轉(zhuǎn)化制備(S)-(-)-β-羥基苯丙酸乙酯中的應(yīng)用。釀酒酵母CGMCCNo.2266，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，地址北京市朝陽區(qū)大屯路中科院微生物研究所，保藏編號CGMCCNo.2266，保藏日期2007年11月26日。本發(fā)明提供了一株可供生物轉(zhuǎn)化β-羥基苯丙酸乙酯為(S)-(-)-β-羥基苯丙酸乙酯的新菌株，利用本發(fā)明方法生產(chǎn)的(S)-(-)-β-羥基苯丙酸乙酯對映體過剩值大于99.0％，底物摩爾轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到92.2％，產(chǎn)品純度達(dá)到99.8％，硅膠柱層析產(chǎn)物提取收率為95.6％，固定化細(xì)胞顆?？梢灾貜?fù)利用10次。文檔編號C12N11/04GK101230319SQ20081005968公開日2008年7月30日申請日期2008年2月4日優(yōu)先權(quán)日2008年2月4日發(fā)明者徐姜炎,楊根生,歐志敏申請人:浙江工業(yè)大學(xué)