專利名稱：一種含綠色熒光蛋白基因的植物轉(zhuǎn)基因表達載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含綠色熒光蛋白基因的植物轉(zhuǎn)基因 表達載體，以及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。技術(shù)背景綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)是海洋動物水母"e。d/orea W"o/^a)體內(nèi)的一種發(fā)光蛋白。其編碼基因g/p作為一種新穎的非酶性標(biāo)記基 因具有許多優(yōu)點檢測方便，只需要熒光顯微鏡或激發(fā)光源；材料無需前處理， 可以活體檢測；無需任何底物或輔助因子；對細胞本身幾乎無毒；植物本身不含 有GFP，不會出現(xiàn)假陽性；對于一些使用抗生素或除草劑會降低轉(zhuǎn)基因效率的物 種，GFP可以作為替代的選擇標(biāo)記；此外，由于GFP分子量較小，不影響與其融 合的蛋白的生物學(xué)活性，GFP在研究蛋白的亞細胞定位方面也是一個很好的工具 (Stewart CN Jr. The utility of green fluorescent protein in transgenic plants. Plant Cell R印，2001, 20(5): 376 — 382. Zimmer M. Green fluorescent protein (GFP): Applications, structure, and related photophysical behavior. Chem Rev， 2002， 102(3): 759 — 781.)。Haseloff等、Richards等、Tzfira等、范文韜等和熊玲媛等分別報道構(gòu)建 了含有g(shù)fp基因的表達載體(Haseloff J， Siemering KR， Prasher DC， Hodge S. Removal of a cryptic intron and subcellular localization of green fluorescent protein are required to mark transgenic Arabidopsis plants brightly. Proc Natl Acad Sci USA, 1997， 94(6): 2122—2127; Richards HA, Rudas VA， Sun H, McDaniel J"K， Tomaszewski Z, Conger BV. Construction of a GFP-BAR plasmid and its use for switchgrass transformation. Plant Cell R印，2001， 20(1): 48 — 54; Tzfira T， Tian GW, Lacroix B, Vyas S， Li J, Leitner-Dagan Y， Krichevsky A， Taylor T， Vainstein A, Citovsky V. pSAT vectors: a modular series of plasmids for autofluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol biol, 2005， 57(4): 503 — 516;范文韜，劉德立，孫曉潔，楊成麗。帶有綠色熒光蛋白基因(g/p)的植物重組表達質(zhì)粒pBI-GFP的構(gòu)建。華中師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2000， 34(2): 213 — 215;熊玲媛，陳亮，沈明山，黃胤怡，陳睦傳。GFP-mut2植物表 達載體的構(gòu)建及在甜菊愈傷組織中的表達。廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2002， 41(5): 546_550。)。但構(gòu)建的這些載體有的功能單一，有的單一的酶切位點 少，有的構(gòu)建的載體未見《/p基因表達效果的驗證。因此，構(gòu)建能高效穩(wěn)定表達、 單一的酶切位點多、用途廣的含^^植物轉(zhuǎn)基因表達載體具有重要的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種由質(zhì)粒pBIN19、 pGFP和pCHS構(gòu)建的CaMV 35S 啟動子驅(qū)動的g/p基因的植物轉(zhuǎn)基因表達載體pBIN-35S-GFP，以實現(xiàn)g/p基因 的高效表達，以便于g/p基因在植物特異性啟動子的功能研究、目標(biāo)基因編碼蛋 白的亞細胞定位、目的基因的遺傳轉(zhuǎn)化等方面的應(yīng)用，同時也提供一種構(gòu)建所述 載體pBIN-35S-GFP的方法。本發(fā)明的目的通過如下的技術(shù)方案實現(xiàn) 一種含綠色熒光蛋白基因的植物轉(zhuǎn) 基因表達載體pBIN-35S-GFP，其特征在于該載體含有農(nóng)桿菌LB邊界序列，并且 從此處開始順時針方向依次連接有細菌操縱子LacZ序列、編碼GFP蛋白的基因 g/p 、 CaMV 35S 啟動子、新霉素-3'-磷酸轉(zhuǎn)移酶 Neomycin phosphotransferase-II ("/^//)基因、農(nóng)桿菌RB邊界序列、卡那霉素抗性基因 、細菌起始復(fù)制子or/K和or仃序列。 所述表達載體pBIN-35S-GFP具有如下特點在g/p基因5'端依次有力ge I、 I、 5"鵬I、 J鵬I、I和Jte I單一酶切位點，3'端有￡coR I和5礎(chǔ)I 單一酶切位點；在CaMV 35S啟動子5'端依次有尸st I、 &力I和歷/ d III單 一酶切位點，3'端有力ge I、I、 5"鵬I、 ifea I、 fe/z I和ife I單一酶切 位點。所述表達載體pBIN-35S-GFP的構(gòu)建方法，包括如下步驟 第一步，將質(zhì)粒pGFP經(jīng)fboR I + I酶切，然后回收含g/p基因的小片段。第二步，將質(zhì)粒pBIN19經(jīng)￡coR I + ^a/di I酶切，然后回收大片段。 第三步，將第一步中回收的小片段與第二步中回收的大片段連接，得到新質(zhì)粒pBIN19-GFP。質(zhì)粒pBIN19-GFP經(jīng)fcoR I + I酶切鑒定得到約10 Kb和750 bp的兩個片段，表明質(zhì)粒pBIN19-GFP構(gòu)建正確。第四步，將質(zhì)粒pCHS經(jīng)歷/7d III + J6a I酶切，然后回收含CaMV 35S啟 動子的小片段。第五步，將第三步中得到的質(zhì)粒pBIN19-GFP經(jīng)歷/ d III + J6a I酶切然后 回收大片段。第六步，將第四步中回收的小片段與第五步中回收的大片段連接，得到所述 表達載體pBIN-35S-GFP。將質(zhì)粒pBIN-35S-GFP，經(jīng)歷/ d III + J6a I酶切鑒定 得到約10. 7 Kb和900 bp的兩個片段，表明構(gòu)建正確。將本發(fā)明的表達載體pBIN-35S-GFP，由發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)轉(zhuǎn)入矮牽牛葉 片外植體。然后對侵染過的矮牽牛葉片進行培養(yǎng)，待經(jīng)培養(yǎng)的矮牽牛葉片生出不 定根，通過PRC擴增的方法對其不定進行鑒定。結(jié)果證明，本發(fā)明的表達載體 pBIN-35S-GFP實現(xiàn)了 g/p基因在植物基因組中的高效表達。基于本發(fā)明的表達載體能實現(xiàn)g/p基因的高效表達，加之該表達載體自身結(jié) 構(gòu)所存在的"在CaMV 35S啟動子的兩端各有一個多克隆位點，可以方便地進行 啟動子替換；在g/p基因的5'端含有多克隆位點，在3'端含有^boRI和^9歷 I兩個單一酶切位點，可以方便地在5'端連接上目標(biāo)基因，表達含GFP的融合 蛋白，也可以方便地切除^^基因，連上需要的目的基因。"等特點?？梢哉f， 本發(fā)明的表達載體pBIN-35S-GFP可以方便地應(yīng)用于研究植物組織特異性啟動子 功能、研究目標(biāo)基因編碼蛋白質(zhì)的亞細胞定位、實現(xiàn)目的基因的遺傳轉(zhuǎn)化等方面。 在植物基因工程的理論和應(yīng)用研究中具有重要的應(yīng)用價值。具體的說，一方面可以用組織特異性啟動子替換所述表達載體pBIN-35S-GFP 中的35S啟動子形成新的質(zhì)粒，將新的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入相應(yīng)植物外植體中，培養(yǎng)再生植 株，通過觀察再生植株的器官和組織中是否具有熒光，以確定組織特異性啟動子 的表達功能。例如，將含有矮牽牛cAsA基因啟動子PchsA的pMT18-T克隆載體，經(jīng)過尸W I 和J&I雙酶切后，從中取小片段；將本發(fā)明的載體pBIN-35S-GFP經(jīng)過/^tl和J6a I雙酶切后，從中取大片段；將得到的大、小片段二者連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。 經(jīng)篩選鑒定，獲得陽性單克隆子。提取該陽性單克隆子的質(zhì)粒，并將其通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或PEG介導(dǎo)法或基因槍等途徑轉(zhuǎn)入矮牽牛外植體，然后對矮牽牛外植體進行培養(yǎng)。結(jié)果表明，矮牽牛外植體再生植株中花發(fā)出綠色熒光，進而證明c力sA 基因的啟動子PchsA為花特異表達的啟動子。另一方面，還可以將目的基因插入到所述表達載體pBIN-35S-GFP中的《/p^ 因的5'端或3'端形成新的質(zhì)粒，將新的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入相應(yīng)植物的原生質(zhì)體中，觀察 原生質(zhì)體亞細胞結(jié)構(gòu)是否具有熒光，以確定目標(biāo)基因編碼蛋白的亞細胞定位。例如，將含有水稻乙烯受體類蛋白基因必7^7的pClT'克隆載體，經(jīng)過化"I 和J6al雙酶切后，從中取小片段；將本發(fā)明的載體pBIN-35S-GFP經(jīng)過《p/7l和J力a I雙酶切后，從中取大片段；將得到的大、小片段連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)篩 選鑒定，獲得陽性克隆子。提取該陽性克隆子的質(zhì)粒，并將其通過PEG介導(dǎo)途徑 轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體。結(jié)果，轉(zhuǎn)化后含有必7%7基因的原生質(zhì)體，其質(zhì)膜上發(fā)出綠 色熒光。這說明本發(fā)明的表達載體將O^,7基因編碼的蛋白0SPKl定位在細胞質(zhì)膜 上，即0SPK1蛋白在核糖體中合成后被運送到細胞質(zhì)膜上，并在細胞質(zhì)膜上發(fā)揮 其信號傳遞作用。第三方面，也可以將所述表達載體pBIN-35S-GFP中的《/;7基因替換為目標(biāo)基 因形成新的質(zhì)粒，將新的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入相應(yīng)植物的外植體，然后培養(yǎng)再生植株，以實 現(xiàn)目標(biāo)基因的遺傳轉(zhuǎn)化。例如，將含有矮牽牛W, 〃基因的pMT18-T克隆載體，首先經(jīng)過/^fl酶切， 用T4 DNA聚合酶補平粘性末端，再用&oR I酶切后，從中取小片段；將本發(fā)明的 載體pBIN- 35S-GFP經(jīng)過5"歷a I和fcoR I雙酶切后，從中取大片段。將得到的大、 小片段連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)篩選鑒定后獲得陽性克隆子。提取該陽性克隆 子的質(zhì)粒，并將其通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或PEG介導(dǎo)法或基因槍等途徑轉(zhuǎn)入菊花外植 體，然后對菊花外植體進行培養(yǎng)。經(jīng)RT-PCR分析，結(jié)果證明，菊花外植體再生植 株中，/^,57/基因得到高效表達。在本發(fā)明的各實驗過程中，質(zhì)粒DNA小量提取、酶切、片段回收、連接、轉(zhuǎn) 化克隆、以及篩選鑒定等步驟，均按照常規(guī)方法進行。本發(fā)明的表達載體pBIN-35S-GFP樣本已保藏至中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，保藏日期為2008年2月27日，保藏編號為CGMCC No. 2378， 分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli，上述保藏中心的地址為北京市朝 陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所，100101。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細說明。 圖l、載體pBIN19-GFP構(gòu)建示意圖。圖2、質(zhì)粒pBIN19-GFP DNA用￡boR I和fe/* I酶切結(jié)果。其中，Ml: 1 Kb DNA ladder標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記；1: pBIN19被￡boR I + 5a/zH I酶切；2: pBIN19-GFP被￡coR I +飽/zH I酶切；3: pGFP被￡coR I + feMi I酶切；M2: 100 bp DNA ladder Plus標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記。圖3、載體pBIN-35S-GFP構(gòu)建示意圖。圖4、 質(zhì)粒pBIN-35S-GFP DNA用歷"d III和JZ I酶切結(jié)果。其中，Ml: 1 Kb DNA ladder標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記；1: pBIN19_GFP被歷/7d III + J力a I酶切； 2: pBIN-35S-GFP被//i/xi III + I酶切；3: pCHS被歷/ d III + J6a I 酶切；M2: 100 bp DNA ladder Plus標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記。圖5、矮牽牛葉片被發(fā)根農(nóng)桿菌K599侵染后15天形成的不定根。圖6、矮牽牛葉片被發(fā)根農(nóng)桿菌K599侵染后20天不定根的大量繁殖。圖7、利用roiB和g/p基因引物對轉(zhuǎn)基因獲得的不定根進行PCR擴增的結(jié) 果。其中，1 8是ro7B基因引物擴增的結(jié)果，9 16是g/^基因引物擴增的結(jié) 果。M: 100 bp DNA ladder Plus標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記；1:野生型發(fā)根農(nóng)桿菌K599Ri質(zhì)粒；2 7:矮牽牛轉(zhuǎn)基因根；8:矮牽牛非轉(zhuǎn)基因根；9:質(zhì)粒 pBIN-35S-GFP;10 15:矮牽牛轉(zhuǎn)基因根；16:矮牽牛非轉(zhuǎn)基因根。圖8、利用w'/G基因引物對轉(zhuǎn)基因不定根進行PCR擴增的結(jié)果。其中，M: 100 bp DNA ladder Plus標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記；1: 野生型發(fā)根農(nóng)桿菌K599 Ri質(zhì) 粒；2: 質(zhì)粒pBIN-35S-GFP; 3 8: 矮牽牛轉(zhuǎn)基因根。圖9、外植體上獲得的一段轉(zhuǎn)基因根在藍色激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光。 圖10、外植體上獲得的另一段轉(zhuǎn)基因根在藍色激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光。
具體實施例方式一、準(zhǔn)備生物材料。將含有質(zhì)粒pGFP的大腸桿菌在LB+Amp (氨芐青霉素)50 mg/L固體培養(yǎng)基 上在37°C條件下培養(yǎng)12小時。從培養(yǎng)基中挑取含有質(zhì)粒pGFP的大腸桿菌單菌 落，并將其轉(zhuǎn)入LB+Amp 50 rag/L液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為250 r/min的搖床上在37°C條件下，懸浮培養(yǎng)12小時。最后用Sangon公司質(zhì)粒小量提取試劑盒提 取質(zhì)粒pGFP，并將獲得的質(zhì)粒保存在-20t條件下備用。再用同樣的方法，分別用含有pBIN19質(zhì)粒和含有pCHS粒的大腸桿菌，依次 使用LB+Km 25 mg/L的固體培養(yǎng)基和LB+Km 25 mg/L的液體培養(yǎng)基，獲得質(zhì)粒 pBIN19和pCHS，也保存在-20。C條件下。二、 構(gòu)建表達載體pBIN-35S-GFP，參照圖l、圖3。第一步，將質(zhì)粒pGFP經(jīng)v coR I +泡Mi I在37°C酶切3小時，然后用Sangon 公司DNA膠回收試劑盒，回收含《/p基因的小片段；第二步，將質(zhì)粒pBIN19經(jīng)fcoR I + I在37°C酶切3小時，然后用Sangon 公司DNA膠回收試劑盒，回收大片段；第三步，將第一步中回收的小片段與第二步中回收的大片段在16°C條件下 連接反應(yīng)12小時。將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue MRF'，在 LB+Km 25 mg/L的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12小時。然后從中挑取單菌落轉(zhuǎn)入LB+Km 25 mg/L的液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為250 r/min的搖床上，在37°C條件下懸浮培養(yǎng)12 小時。然后用Sangon公司質(zhì)粒小量提取試劑盒提取構(gòu)建的新質(zhì)粒pBIN19-GFP。 質(zhì)粒pBIN19-GFP經(jīng)￡coR I + fe/zH I在37"C酶切3小時，電泳鑒定得到約10 Kb 和750 bp的兩個片段，如圖2所示，表明質(zhì)粒pBIN19-GFP構(gòu)建正確。第四步，將質(zhì)粒pCHS經(jīng)歷/ d III + I在37°C酶切3小時，然后用Sangon 公司DNA膠回收試劑盒，回收含CaMV 35S啟動子的小片段；第五步，將第三步中得到的質(zhì)粒pBIN19-GFP經(jīng)歷/ d III + Jte I在37°C 酶切3小時，然后用Sangon公司DNA膠回收試劑盒回收大片段；第六步，將第四步中回收的小片段與第五步中回收的大片段在16°C條件下 連接反應(yīng)12小時，將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue MRF'，在 LB+Km 25 mg/L的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12小時，從固體培養(yǎng)基上挑取單菌落轉(zhuǎn)入 LB+Km 25 mg/L的液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為250 r/min的搖床上，37°C懸浮培養(yǎng)12 小時，用Sangon公司質(zhì)粒小量提取試劑盒提取構(gòu)建的新質(zhì)粒pBIN-35S-GFP，經(jīng) 歷/7d III + I在37°C酶切3小時，電泳鑒定得到約10. 7 Kb和900 bp的兩 個片段，如圖4所示，表明質(zhì)粒pBIN-35S-GFP構(gòu)建正確。三、 將表達載體pBIN-35S-GFP導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599。發(fā)根農(nóng)桿菌K599感受態(tài)的制備和質(zhì)粒的提取均參照向太和等的方法(向太 和，楊劍波，S騰rsDA。野生型發(fā)根農(nóng)桿菌K599的解毒。遺傳，2001， 23(4): 336_340。)進行。用凍融法將pBIN-35S-GFP導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599，即在100 PLK599感受態(tài)細胞中加入約0. 1 ug純化質(zhì)粒DNA，混勻，在0。C冰上放置10 min，再置于液氮速凍5 min，然后立即用28 t水浴熱激5 min,最后轉(zhuǎn)入500 u L LB液體培養(yǎng)基中，在28 。C緩慢振蕩培養(yǎng)2 h。取100 u L菌液涂布于LB+Km (卡 那霉素)50 mg/L+Str (鏈霉素)50 mg/L固體培養(yǎng)基上，在28 'C條件下培養(yǎng) 48 h，篩選得到抗性單克隆菌落。四、 發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化和不定根的繁殖。發(fā)根農(nóng)桿菌K599/pBIN-35S-GFP單克隆在LB+Km 50 mg/L+Str 50 mg/L液體 培養(yǎng)基中，在28'C下，在200 r/min轉(zhuǎn)速的搖床上，過夜培養(yǎng)。再取5 mL菌液 移入50 mL MS+Km 50mg/L+Str 50mg/L液體培養(yǎng)基中，在28。C下，在200 r/min 轉(zhuǎn)速的搖床上，培養(yǎng)至ODe。。為0.5，取反應(yīng)物在5000 r/min轉(zhuǎn)速下，在4 。C條 件下，離心10min，收集菌體，用MS培養(yǎng)基清洗3次后，用MS+乙酰丁香酮20 mg/L培養(yǎng)基將菌液稀釋10倍后作為侵染液待用。取矮牽牛無菌苗葉片，剪成5mm2的小塊，放入侵染液中10min，用無菌濾 紙吸干菌液，置于MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)入MS+Cef (頭孢霉素)500 mg/L+Km 50 mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)；同時將未經(jīng)侵染的矮牽牛葉片外植體培養(yǎng)在相 同的培養(yǎng)基上作為陰性對照。矮牽牛無菌苗離體葉片在發(fā)根農(nóng)桿菌K599/pBIN-35S-GFP侵染后10天，切 口邊緣長出白色小突起；15天，切口邊緣長出明顯可見的白色不定根，如圖5所 示。不定根的誘導(dǎo)頻率達45% (18/40);而未經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌K599/pBIN-35S-GFP 侵染的外植體未見根的生成。待不定根長到5-7 cm,切成兩段，培養(yǎng)在無任何 植物激素的MS+Cef 500 mg/L+Km 50 mg/L上。在該培養(yǎng)基上不定根生長旺盛， 15-20天即可形成大量毛狀分枝的不定根，如圖6所示。五、 不定根的PCR鑒定不定根基因組DNA的提取參照向太和等的方法(向太和，王利琳，龐基良， 陳敏，許超。發(fā)根農(nóng)桿菌K599對大豆、黃瓜和鳳仙花活體感染生根的研究。遺 傳，2005， 27(5): 783 — 786。)。參照施和平等的報道(施和平，齊瑩，張悅，梁山。黃瓜毛狀根的誘導(dǎo)及細胞分裂素6-BA對其生長和形態(tài)的影響。生物工程 學(xué)報，2006， 22(3): 514—520。)設(shè)計擴增roiB基因的引物rolB-Pl和rolB-Pl ， rolB-Pl: GCTCTTGCAGTGCTAGATTT， rolB-P2: GAAGGTGCAAGCTACCT CTC;參照Lee 等的報道(Lee MH， Yoon ES， Jeong JH, Choi YE.力^roZ acteri"/T7 r/ j'zoge/7e5^ mediated transformation of 7krayac"歷 ^Kcarp"77 and changes of morphological characters.尸7朋t Cei7 y ep, 2004， 22(11): 822 — 827.)設(shè) 計擴增"/G基因的引物virG-Pl和virG-P2， virG-Pl: TTATCTGAGTGAAGT CGTCTCAGG， virG-P2: CGTCGCCTGAGCTTAAGTGTC;根據(jù)g/p基因(GenBank登記 號U17997)序列設(shè)計引物GFP-PI和GFP-P2， GFP-P1: GTCAGTGGAGAGGGTGAAGG， GFP-P2: AAAGGGCAGATTGTGTGGAC。 PCR擴增反應(yīng)體積為35 u L，其中包括0. 2 y L 10 mmol/L dNTP混合物，2 u L 10 pmol/L PCR引物，2 u Taq Plus DNA聚合 酶和約0. 2 u g DNA。用美國ABI公司PE9700型DNA擴增儀進行擴增反應(yīng)。PCR 反應(yīng)程序為94°C 5 min變性后，按94°C 45 sec、 55°C 45 sec、 72°C 90 sec 的設(shè)置進行30個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后在72'C下延伸10min，隨后于4'C保存?zhèn)溆谩?擴增產(chǎn)物在1.2。/。的瓊脂糖凝膠上電泳1.5h (5V/cm)，溴化乙錠(EtBr)染色， 用美國Bio/Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。根據(jù)"7B基因序列設(shè)計的引物rolB-Pl和rolB-P2對獲得的6個轉(zhuǎn)基因不 定根和野生型發(fā)根農(nóng)桿菌K599自身攜帶的Ri質(zhì)粒均擴增出約450 bp大小的條 帶。同時，根據(jù)g/p基因序列設(shè)計的引物GFP-P1和GFP-P2對獲得的6個轉(zhuǎn)基因 不定根和質(zhì)粒pBIN-35S-GFP均擴增出538 bp的條帶；而非轉(zhuǎn)基因的矮牽牛根基 因組DNA均未擴增出任何條帶，如圖7所示。此外，根據(jù)發(fā)根農(nóng)桿菌w'/G基因設(shè)計的引物virG-Pl和virG-P2對K599自 身攜帶的Ri質(zhì)粒、質(zhì)粒pBIN-35S-GFP和矮牽牛轉(zhuǎn)基因不定根基因組DNA進行擴 增，結(jié)果只有K599自身攜帶的Ri質(zhì)粒擴增出了長度約lKb條帶，如圖8所示。 因此，排除了不定根中存在殘留農(nóng)桿菌污染的可能。六、轉(zhuǎn)基因不定根的GFP蛋白熒光檢測用ZEISS顯微鏡(型號Axio imager)，在藍色激發(fā)光下(濾光片F(xiàn)ITC) 對誘導(dǎo)出的不定根進行熒光檢測，并用ZEISS顯微鏡配套的數(shù)碼成像系統(tǒng)拍照記 錄。利用熒光顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)基因不定根在藍色光激發(fā)下，發(fā)出強烈的綠色熒光，如圖9和圖IO所示。 七、應(yīng)用實例例一，將含有矮牽牛cA9A基因啟動子PchsA的pMT18-T克隆載體，經(jīng)過,st I 和/6a I在37。C酶切3小時，用Sangon公司DNA膠回收試劑盒回收小片段；將本發(fā) 明的載體pBIN-35S-GFP經(jīng)過尸"I和J6a I在37。C酶切3小時，用Sangon公司DNA 膠回收試劑盒回收大片段。小片段和大片段二者在16"C連接反應(yīng)12小時，轉(zhuǎn)化感 受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue MRF'，在LB+Km 25 mg/L的固體培養(yǎng)基上篩選單菌落， 挑單菌落于LB+Km25mg/L的液體培養(yǎng)基上，在轉(zhuǎn)速為250 r/min的搖床上，在37。C 條件下懸浮培養(yǎng)12小時，用Sangon公司質(zhì)粒小量提取試劑盒提取構(gòu)建的新質(zhì)粒， 尸"I和勘I在37"C酶切3小時，電泳出現(xiàn)約ll Kb和O. 5 Kb的大小兩個片段，即 構(gòu)建的新質(zhì)粒鑒定正確。利用構(gòu)建的新質(zhì)粒，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或PEG介導(dǎo)法或基因槍等途徑將矮牽 牛cAsA基因啟動子介導(dǎo)的g/;^因，轉(zhuǎn)入矮牽牛葉片外植體中，外植體在MS+6-BA 2mg/L培養(yǎng)基上再生植株。用ZEISS顯微鏡(型號Axio imager),在藍色激發(fā) 光下(濾光片F(xiàn)ITC)分別對再生植株的不同器官進行觀察，花器官發(fā)出綠色熒光， 即表明cAsA基因的啟動子PchsA為花特異表達的啟動子。例二，將含有水稻乙烯受體類蛋白基因flS/^7的pCRTM2'克隆載體，經(jīng)過,p/7 1 和J6a I在37"C酶切3小時，用Sangon公司DNA膠回收試劑盒回收小片段；將本發(fā) 明的載體pBIN-35S-GFP經(jīng)過vfp/ I和J力a I在37。C酶切3小時，用Sangon公司DNA膠 回收試劑盒回收大片段。小片段和大片段二者在16"C連接反應(yīng)12小時，轉(zhuǎn)化感受 態(tài)大腸桿菌XL1-Blue MRF'，在LB+Km 25 mg/L的固體培養(yǎng)基上篩選單菌落，挑 單菌落于LB+Km 25 mg/L的液體培養(yǎng)基上，在轉(zhuǎn)速為250 r/min的搖床上，37。C懸 浮培養(yǎng)12小時，用Sangon公司質(zhì)粒小量提取試劑盒提取構(gòu)建的新質(zhì)粒，在37t酶 切3小時，電泳出現(xiàn)約ll Kb和l Kb的大小兩個片段，即構(gòu)建的新質(zhì)粒鑒定正確。利用構(gòu)建的新質(zhì)粒，通過PEG介導(dǎo)法將必7^7基因轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化后 含有66FA7基因的原生質(zhì)體，用ZEISS顯微鏡(型號Axio imager)，在藍色激 發(fā)光下(濾光片F(xiàn)ITC)對轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體進行觀察，其質(zhì)膜上發(fā)出綠色熒光。 即用本發(fā)明的表達載體將O^A7基因編碼的蛋白OSPK1定位在細胞質(zhì)膜上，表明 0SPK1蛋白在核糖體中合成后被運送到細胞質(zhì)膜上，并在細胞質(zhì)膜上發(fā)揮其信號傳遞作用。例三，含有矮牽牛W，5W基因的pMT18-T克隆載體，首先用戶"I在37。C酶切 3小時，再用T4DNA聚合酶在在37"C聚合反應(yīng)30分鐘，補平粘性末端。隨后用5boR I在37t酶切3小時，用Sangon公司質(zhì)粒小量提取試劑盒提取小片段；本發(fā)明的載 體pBIN-35S-GFP經(jīng)過S歷a I和fcoR I在37t酶切3小時，用Sangon公司質(zhì)粒小量提 取試劑盒提取大片段。大小片段二者在16。C連接反應(yīng)12小時，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿 菌XL1-Blue MRF'，在LB+Km 25 mg/L的固體培養(yǎng)基上篩選單菌落，挑單菌落于 LB+Km 25 mg/L的液體培養(yǎng)基上，在轉(zhuǎn)速為250 r/min的搖床上，37。C懸浮培養(yǎng)12 小時，用Sangon公司質(zhì)粒小量提取試劑盒提取構(gòu)建的新質(zhì)粒，用&oR I在37t酶 切3小時，電泳出現(xiàn)1條約12.5 Kb的片段，即構(gòu)建的新質(zhì)粒鑒定正確。利用構(gòu)建的新質(zhì)粒，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或PEG介導(dǎo)法或基因槍等途徑將 /^',<57/基因轉(zhuǎn)入菊花葉片外植體，外植體在MS+6-BA 2mg/L+NAA 0. 5mg/L上培養(yǎng) 基再生植株。設(shè)計RT-PCR引物F3',5'H-P1: AAATAAAATGAGCATTCTA ACCCTAA和 F3',5'H-P2: TCAAACAGATTCATCTTACAAACAGA。用Promega公司RT-PCR試劑盒，對葉 片、根和莖分別進行RT-PCR擴增分析，結(jié)果再生植株葉片、根和莖中均擴增出大 小約1500 bp的條帶，即/^'，5W基因得到高效表達。應(yīng)該理解到的是上述實施例只是對本發(fā)明的說明，而不是對本發(fā)明的限制， 任何不超出本發(fā)明實質(zhì)精神范圍內(nèi)的發(fā)明創(chuàng)造，均落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種含綠色熒光蛋白基因的植物轉(zhuǎn)基因表達載體，名稱為pBIN-35S-GFP，其特征在于含有農(nóng)桿菌LB邊界序列，并且從此處開始順時針方向依次連接有細菌操縱子LacZ序列、編碼GFP蛋白的基因gfp、CaMV 35S啟動子、新霉素-3′-磷酸轉(zhuǎn)移酶Neomycin phosphotransferase-II(npt II)基因、農(nóng)桿菌RB邊界序列、卡那霉素抗性基因(KmR)、細菌起始復(fù)制子oriV和oriT序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種含綠色熒光蛋白基因的植物轉(zhuǎn)基因表達載體，其 特征在于，在g/p基因5'端依次有/l《e I、I、 5)z a I、 Zy 7a I、 5s』I 和單一酶切位點，3'端有fcoRI和As歷I單一酶切位點；在CaMV35S 啟動子5'端依次有尸W I、 S。力I和歷"d III單一酶切位點，3'端有Z《e I、 化/ I、 6"鵬I、 ％/肪I、 5a/zH I和J6a I單一酶切位點。
3、 權(quán)利要求1所述表達載體pBIN-35S-GFP的構(gòu)建方法，包括如下步驟 第一步，將質(zhì)粒PGFP經(jīng)feoR I +泡W I酶切，然后回收含g/p基因的小 片段；第二步，將質(zhì)粒pBIN19經(jīng)5boR I + fe/zH I酶切，然后回收大片段； 第三步，將第一步中回收的小片段與第二步中回收的大片段連接，得到新質(zhì) 粒pBIN19-GFP;第四步，將質(zhì)粒pCHS經(jīng)附/ d III + J6a I酶切，然后回收含CaMV 35S啟 動子的小片段；第五步，將第三步中得到的質(zhì)粒pBIN19-GFP經(jīng)歷/7d III + Jte I酶切然后 回收大片段；第六步，將第四步中回收的小片段與第五步中回收的大片段連接，得到所述 表達載體pBIN-35S-GFP。
4、 權(quán)利要求1所述表達載體pBIN-35S-GFP在研究植物組織特異性啟動子的功能 方面的應(yīng)用。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，用組織特異性啟動子替換所述表 達載體pBIN-35S-GFP中的35 S啟動子形成新的質(zhì)粒，將新的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入相應(yīng) 植物外植體中，培養(yǎng)再生植株，通過觀察再生植株的器官和組織中是否具有 熒光，以確定組織特異性啟動子的表達功能。
6、 權(quán)利要求1所述表達載體pBIN-35S-GFP在研究目標(biāo)基因編碼蛋白的亞細胞 定位方面的應(yīng)用。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，將目的基因插入到所述表達載體pBIN-35S-GFP中的^^基因的5'端或3'端形成新的質(zhì)粒，將新的質(zhì)粒轉(zhuǎn) 入相應(yīng)植物的原生質(zhì)體中，觀察原生質(zhì)體亞細胞結(jié)構(gòu)是否具有熒光，以確定 目標(biāo)基因編碼蛋白的亞細胞定位。
8、 權(quán)利要求1所述表達載體pBIN-35S-GFP在實現(xiàn)目的基因的遺傳轉(zhuǎn)化方面的 應(yīng)用。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，將所述表達載體pBIN-35S-GFP 中的g/p基因替換為目標(biāo)基因形成新的質(zhì)粒，將新的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入相應(yīng)植物的外 植體，培養(yǎng)再生植株，以實現(xiàn)目標(biāo)基因的遺傳轉(zhuǎn)化。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)中的基因工程領(lǐng)域，公開了一種含綠色熒光蛋白基因的植物轉(zhuǎn)基因表達載體，以及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。即利用pBIN19、pGFP和pCHS質(zhì)粒，通過酶切和重組等方法，構(gòu)建CaMV 35S啟動子驅(qū)動的gfp基因的植物轉(zhuǎn)基因表達載體pBIN-35S-GFP。該載體能實現(xiàn)gfp基因的高效表達，并且在CaMV35S啟動子的兩端各有一個多克隆位點，可以方便地進行啟動子替換，用于研究組織特異性啟動子的功能；此外，該載體在gfp基因的5′端含有多克隆位點，在3′端含有EcoR I和Bsm I兩個單一酶切位點，可以方便地在5′端連接上目標(biāo)基因，表達含GFP的融合蛋白，用于研究目標(biāo)基因編碼蛋白的亞細胞定位；也可以方便地切除gfp基因，連上需要的目的基因用于遺傳轉(zhuǎn)化研究。
文檔編號C12N15/82GK101240290SQ200810059790
公開日2008年8月13日 申請日期2008年2月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月29日
發(fā)明者向太和, 徐紀(jì)明 申請人:杭州師范大學(xué)