專利名稱：放射線劑量的生物檢測(cè)用報(bào)告質(zhì)粒的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基因質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，即放射線劑量的生 物檢測(cè)用報(bào)告質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
電離輻射對(duì)健康的危害和輻射安全評(píng)估，各種條件下的急、慢性輻射損傷的分類、診斷 和治療等都需要了解和確定受照射的劑量。放射線劑量的生物檢測(cè)是利用生物材料如組織、 細(xì)胞、DNA、蛋白質(zhì)等在電離輻射后發(fā)生的、與輻射劑量存在的一定量一效關(guān)系的某個(gè)方面 的改變，利用這種可測(cè)、可記錄和分析的生物改變來(lái)度量輻射劑量的一類生物標(biāo)記物及分析 方法。與物理檢測(cè)相比，利用生物進(jìn)行劑量檢測(cè)的最大優(yōu)勢(shì)是直接和忠實(shí)代表性。
目前進(jìn)行放射線劑量的生物檢測(cè)的方法很多，常用的有放射線照射后DNA損傷而形 成的彗星尾與未受損的細(xì)胞表現(xiàn)的彗星核心之間的關(guān)系來(lái)研究預(yù)測(cè)放射線劑量的單細(xì)胞凝膠 電泳(慧星試驗(yàn))法(Berwick and Vineins, 2000);也有通過(guò)調(diào)査射線照射后的細(xì)胞所引起 的染色體的雙著絲粒、交換或易位等損傷指標(biāo)來(lái)估算放射線劑量的染色體畸變分析法 (Ballarini and Ottolenghi, 2003; Duran " a/., 2002; Camparoto " a/.， 2003 )，但這些方法的共 同缺點(diǎn)是存在操作復(fù)雜、檢測(cè)的成本較高、損傷觀察時(shí)人為因素較多、很難準(zhǔn)確定量等缺點(diǎn)； 雖通過(guò)計(jì)算機(jī)等輔助手段的利用可以適當(dāng)提高其度量的精度，但這些方法只能對(duì)低劑量的放 射線進(jìn)行檢測(cè)和度量，對(duì)于高劑量放射線的生物檢測(cè)和度量的方法目前還沒(méi)有。迫切需要有 一種使用方便、精確度高，同時(shí)又能對(duì)高劑量的放射線進(jìn)行生物檢測(cè)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開(kāi)一種放射線劑量的生物檢測(cè)用報(bào)告質(zhì)粒以及這種生物測(cè)定用報(bào)告 質(zhì)粒的構(gòu)建方法。以及這種放射線劑量的生物檢測(cè)用報(bào)告質(zhì)粒的應(yīng)用。
本發(fā)明的這種放射線劑量的生物檢測(cè)用報(bào)告質(zhì)粒是以抗輻射菌一大腸桿菌間的穿梭載 體為基礎(chǔ)，與具有北美產(chǎn)螢火蟲(chóng)(i^orimw/7j;rato)的寄主DNA由來(lái)的熒光素酶基因lux領(lǐng) 域的DNA片段重組，構(gòu)建成具有熒光素酶基因的抗輻射菌一大腸桿菌間穿梭載體報(bào)告質(zhì)粒。
具體構(gòu)建方法為以下步驟 (1)穿梭載體質(zhì)粒的構(gòu)建
用QIAfilter Plasmid kit (德國(guó)QIAGEN)從抗輻射菌Dez'"ococc附ra&o戶g"fl";s中提取質(zhì) 粒pUE30并進(jìn)行Sphl酶切，用Sphl消化包含有大腸桿菌載體pUC19復(fù)制開(kāi)始領(lǐng)域、大腸桿 菌中有活性的Amp抗性基因、抗輻射菌Z)e/"ococc船raofz'o^ra朋中有活性的氯霉素抗性基因 的質(zhì)粒pKatCAT,再與上述pUE30的Sphl消化物混合，用DNA連接酶連接，采用電穿孔法 將上述連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株，從抗Amp的轉(zhuǎn)化株中選擇具有pUE30和pKatCAT連 接的質(zhì)粒的株，獲得穿梭載體質(zhì)粒。 (2)報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建
在上述穿梭載體質(zhì)粒的A^fe I酶切位點(diǎn)插入熒光蛋白酶基因丄w+，構(gòu)建成質(zhì)粒；設(shè)計(jì)包 含限制性內(nèi)切酶MfeI位點(diǎn)的DNA損傷修復(fù)基因wcA的啟動(dòng)子的引物，PCR增幅DNA損 傷修復(fù)基因wc A的啟動(dòng)子，將上述PCR產(chǎn)物順向插入上述質(zhì)粒的熒光蛋白基因i^c+上游的 iVcfel部位，由此形成測(cè)定用的報(bào)告質(zhì)粒。
所述DNA損傷修復(fù)基因wcA的啟動(dòng)子的引物序列為
SEQ ID N0 1: ttgtcagctt cggtcagttg acat
SEQ ID NO 2: tggggtcctc ctgtgagtga
本發(fā)明放射線劑量的生物檢測(cè)用報(bào)告質(zhì)粒的應(yīng)用
將上述測(cè)定用的報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)化抗輻射菌的野生型Rl中，獲轉(zhuǎn)化體抗輻射菌，供"射線 照射。將轉(zhuǎn)化體抗輻射菌培養(yǎng)到穩(wěn)定期，用Y-射線進(jìn)行照射，照射后再進(jìn)行培養(yǎng)，以性狀轉(zhuǎn) 化體的發(fā)光量為依據(jù)，測(cè)定不同劑量Y-射線照射后的發(fā)光量。不同劑量射線照射后得到不同 的發(fā)光量。
以抗輻射菌—大腸桿菌間的穿梭載體為基礎(chǔ)，與具有北美產(chǎn)螢火蟲(chóng)(i^o"m^/^mfc) 的寄主DNA由來(lái)的熒光素酶基因丄wc+領(lǐng)域的DNA片段重組，構(gòu)建成具有熒光素酶基因活性 的抗輻射菌一大腸桿菌間的穿梭載體質(zhì)粒；將含有上述熒光素酶基因活性質(zhì)粒的抗輻射菌培 養(yǎng)于玻璃容器內(nèi)，將該容器放在需要測(cè)定的地方，被曝一定時(shí)間后取回容器，再在30'C條件 下繼續(xù)培養(yǎng)24 hr;取培養(yǎng)液10 與等量的Bright-Glo Luciferase Assay Solution (Promega， 不限定此類試劑)混合，1分鐘后用Lumi Imager(Roche Molecular Biochemicals,不限定此類 儀器)測(cè)定l分鐘間的化學(xué)發(fā)光活性；根據(jù)發(fā)光量的多少估算被測(cè)地的放射性劑量。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明能解決現(xiàn)有技術(shù)放射線劑量生物檢測(cè)法的各種問(wèn)題。如能夠提高劑量檢測(cè)的精 確度，己有的單細(xì)胞凝膠電泳(慧星試驗(yàn))法及染色體畸變分析法的操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)人為 因素較多、很難準(zhǔn)確定量；而本發(fā)明的報(bào)告質(zhì)粒根據(jù)熒光量的有無(wú)及熒光量的多少就能正確 進(jìn)行定性和定量。其次，單細(xì)胞凝膠電泳(慧星試驗(yàn))法及染色體畸變分析法等只能對(duì)低劑 量的放射線進(jìn)行定量，不能對(duì)高劑量的放射線進(jìn)行定量；而本發(fā)明的報(bào)告質(zhì)粒除能對(duì)低劑量 的放射線進(jìn)行定量外，對(duì)于高劑量的放射線也能進(jìn)行定量。同時(shí)，本發(fā)明的報(bào)告質(zhì)粒在抗輻 射菌中具有高熒光素酶活性，可實(shí)時(shí)監(jiān)控重組轉(zhuǎn)化子的生育狀況等。
本發(fā)明的應(yīng)用前景
本發(fā)明的報(bào)告質(zhì)粒可作為高、低放射線劑量的生物檢測(cè)，可以廣泛應(yīng)用于核發(fā)電站等核 設(shè)施、醫(yī)院等放射線照射設(shè)施及其他具有放射源場(chǎng)所的檢測(cè)，也可應(yīng)用于環(huán)境中放射性物質(zhì)
的污染檢測(cè)，同時(shí)可作為一個(gè)生物感應(yīng)器來(lái)感應(yīng)多種DNA損傷劑。本發(fā)明的報(bào)告質(zhì)粒具有 熒光素酶基因，在實(shí)時(shí)監(jiān)控重組轉(zhuǎn)化子的生育、分布及對(duì)環(huán)境的影響等方面也非常有用。
具體實(shí)施例方式
以下根據(jù)實(shí)施例詳細(xì)介紹本發(fā)明，本發(fā)明沒(méi)有限定這些實(shí)施例。
(1) 穿梭載體質(zhì)粒的構(gòu)建
從抗輻射菌("""ococc附raAo/wg"""ceATCC19172)中提取質(zhì)粒pUE30并進(jìn)行Sphl酶 切；接著用Sphl消化包含有大腸桿菌載體pUC19復(fù)制開(kāi)始領(lǐng)域、大腸桿菌中有活性的Amp 抗性基因、抗輻射菌De/"ococcw ra^o^rara Rl中有活性的氯霉素抗性基因的質(zhì)粒pKatCAT (Funayama等，Mutat. Res., 435: 151-161, 1999)，再與上述pUE30的Sphl消化物混合，用 DNA連接酶連接。采用電穿孔法將上述連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。從抗Amp的轉(zhuǎn)化株 中選擇具有pUE30和pKatCAT連接的質(zhì)粒的株，得到穿梭載體質(zhì)粒。
(2) 報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建
以抗輻射菌Dez'"ococciw rac fo血ra咖的基因組DNA為模板，SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2所示的堿基序列(根據(jù)Meima等的論文自行設(shè)計(jì)，J. Bacteriol. 183: 3169-3175， 2001 )合成 的DNA為引物，用Pfu Turbo DNA polymerase (Stratagene)進(jìn)行PCR反應(yīng)，增幅Meima 等(J. Bacteriol. 183:3169-3175,2001)記載的在抗輻射菌De/"ococow ra^'oJwrara中具有活 性的已知的groEL啟動(dòng)子領(lǐng)域。然后用Ncol內(nèi)切酶消化含有熒光素酶基因的質(zhì)粒pSP-lux+ (Promega)，用T4 DNA polymerase (Takara)進(jìn)行DNA斷片末端的平滑化。最后，將上述 的PCR產(chǎn)物與平滑化的pSP-lux+連接，得到pGroE-lux。
用HindIII消化上述質(zhì)粒，進(jìn)行切斷末端的平滑化處理，再用EcoRV進(jìn)行消化，得到 含有g(shù)roEL啟動(dòng)子和熒光素酶基因的DNA斷片，將這一 DNA片斷插入步驟1所獲穿梭載體 質(zhì)粒的EcoRV部位，構(gòu)建具有熒光素酶基因的質(zhì)粒，用構(gòu)建的熒光素酶基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 ￡>e// ococo grawfo，得到具有熒光素酶基因的菌株。
(3) 熒光素酶活性的測(cè)定
將上述得到的重組轉(zhuǎn)化子在TGY培養(yǎng)基中3(TC培養(yǎng)，然后進(jìn)行不同劑量Y-射線照射， 再繼續(xù)培養(yǎng)，24 hr后將培養(yǎng)液10 |aL與等量的Bright-Glo Luciferase Assay Solution (Promega) 混合，1分鐘后用Lumi Imager (Roche Molecular Biochemicals)測(cè)定1分鐘間的化學(xué)發(fā)光活性。
由測(cè)定得知，不同劑量射線照射后菌體的發(fā)光量不同，照射劑量與發(fā)光量之間的相關(guān)系數(shù)達(dá)
0.892 (達(dá)極顯著水平)。
使用方法及其效果
將含有放射線劑量生物檢測(cè)用報(bào)告質(zhì)粒的抗輻射菌培養(yǎng)于玻璃容器內(nèi)，將該容器放在需 要測(cè)定的地方，被曝一定時(shí)間后取回容器，再在301C條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 hr。取培養(yǎng)液10PL 與等量的Bright-Glo Luciferase Assay Solution (Promega)混合，1分鐘后用Lumi Imager (Roche Molecular Biochemicals)測(cè)定1分鐘間的化學(xué)發(fā)光活性。根據(jù)發(fā)光量的多少就可以估 算被測(cè)地的放射性劑量。
根據(jù)研究結(jié)果，在使用的0-2000 Gy的劑量范圍內(nèi)，不同劑量Y-射線照射后菌體的發(fā)光 量與照射劑量之間的相關(guān)系數(shù)為0.892，達(dá)極顯著水平。
序列表
<110>浙江大學(xué)
<120>放射線劑量的生物檢測(cè)用報(bào)告質(zhì)粒的應(yīng)用 <160> 2
<210> 1 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223> DNA損傷修復(fù)基因rec A的啟動(dòng)子的引物序列 <400> 1
ttgtcagctt cggteagttg acat 24
<210> 2 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223> DNA損傷修復(fù)基因rec A的啟動(dòng)子的引物序列 <400> 2
tggggtccte ctgtgagtga 20
權(quán)利要求
1、放射線劑量的生物檢測(cè)用報(bào)告質(zhì)粒的應(yīng)用，其特征在于以抗輻射菌-大腸桿菌間的穿梭載體為基礎(chǔ)，與具有北美產(chǎn)螢火蟲(chóng)(Photinus pyralis)的寄主DNA由來(lái)的熒光素酶基因Luc+領(lǐng)域的DNA片段重組，構(gòu)建成具有熒光素酶基因活性的抗輻射菌-大腸桿菌間的穿梭載體質(zhì)粒；將含有上述熒光素酶基因活性質(zhì)粒的抗輻射菌培養(yǎng)于玻璃容器內(nèi)，將該容器放在需要測(cè)定的地方，被曝一定時(shí)間后取回容器，再在30C條件下繼續(xù)培養(yǎng)24hr；取培養(yǎng)液10μL與等量的Bright-Glo Luciferase Assay Solution混合，1分鐘后用Lumi Imager測(cè)定1分鐘間的化學(xué)發(fā)光活性；根據(jù)發(fā)光量的多少估算被測(cè)地的放射性劑量。
全文摘要
放射線劑量的生物檢測(cè)用報(bào)告質(zhì)粒的應(yīng)用，以抗輻射菌-大腸桿菌間的穿梭載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建成具有熒光素酶基因活性的抗輻射菌-大腸桿菌間的穿梭載體的報(bào)告質(zhì)粒。將報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)化抗輻射菌的野生型R1中，獲轉(zhuǎn)化體抗輻射菌，供γ-射線照射。以性狀轉(zhuǎn)化體的發(fā)光量為依據(jù)，測(cè)定不同劑量γ-射線照射后的發(fā)光量。本發(fā)明的報(bào)告質(zhì)粒可作為高、低放射線劑量的生物檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于核發(fā)電站等核設(shè)施、醫(yī)院等放射線照射設(shè)施及其他具有放射源場(chǎng)所的檢測(cè)，也可應(yīng)用于環(huán)境中放射性物質(zhì)的污染檢測(cè)，可作為一個(gè)生物感應(yīng)器來(lái)感應(yīng)多種DNA損傷劑。本發(fā)明的報(bào)告質(zhì)粒具有熒光素酶基因，在實(shí)時(shí)監(jiān)控重組轉(zhuǎn)化子的生育、分布及對(duì)環(huán)境的影響等方面也非常有用。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101348823SQ20081006191
公開(kāi)日2009年1月21日 申請(qǐng)日期2008年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
發(fā)明者屠振力 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)