專利名稱：一種檢測單核細(xì)胞增生李斯特活菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測李斯特菌的方法。
技術(shù)背景單核細(xì)胞增生(增多性)李斯特菌a/Wen'o附o"oc^oge"es， Lm)，簡 稱單增李斯特菌，是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，其pH值生長范圍為 4.39~9.40，在4'C下也可生長，因此增加了對冷藏食物的危害性。單增李斯 特菌廣泛存在于土壤、動(dòng)物和水產(chǎn)品中，主要通過乳及乳制品、蔬菜、水產(chǎn) 品、肉制品等食物傳播。因其具有獨(dú)特的生理特性，能引起人類腦膜炎、敗 血癥等疾患，尤以妊娠期婦女、新生兒以及免疫功能低下的病人更易感染， 致死率達(dá)30%以上?，F(xiàn)有檢測單增李斯特菌的方法全過程至少需要4~7天，檢出限度不夠靈 敏，操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而PCR和探針雜交都無法排除死菌和活菌，由于 死菌中的DNA降解較慢，也容易產(chǎn)生假陽性。檢測技術(shù)的假陽性會(huì)帶來錯(cuò) 誤的信息和判斷，根據(jù)假陽性結(jié)果所采取的措施可能會(huì)帶來不必要的損失。 熒光染料(EMA)與PCR技術(shù)相結(jié)合可以對活菌進(jìn)行檢測，其原理是EMA 可通過被破壞的細(xì)胞膜與DNA相結(jié)合，而結(jié)合了 EMA的基因組DNA在 PCR反應(yīng)中不能進(jìn)行擴(kuò)增；反之，EMA不能通過活菌的細(xì)胞膜，所以不能 與基因組DNA相結(jié)合，PCR反應(yīng)可正常進(jìn)行。但有研究報(bào)告指出EMA可 穿透部分細(xì)菌活體的細(xì)胞膜，并與DNA雙鏈結(jié)合，造成活菌基因組DNA 損失，所以PCR檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明為了解決現(xiàn)有檢測單增李斯特活菌的方法容易產(chǎn)生假陽性的問題，而提供一種檢測單核細(xì)胞增生李斯特活菌的方法。本發(fā)明的檢測單核細(xì)胞增生李斯特活菌的方法按如下步驟進(jìn)行一、取待測物品25g置于225mL胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯中進(jìn)行培養(yǎng)培養(yǎng)8小時(shí)，再取培養(yǎng)液4mL放于5mL環(huán)氧樹脂管中，在室溫下以14000r/min的速度離心3min，得到菌泥；二、 將得到的菌泥重懸于3mL甲醇、乙醚和氨水的混合液中，再重懸 于lmL的裂解液中，然后加入0.2g、直徑為0.2mm的玻璃珠，2000轉(zhuǎn)/分渦 旋5min。然后以14000r/min的相對離心力離心3min;三、 取離心后懸浮物700mL與同體積pH值為5.5的水飽和酚混合于 1.5mL的環(huán)氧樹脂管中，在68'C的條件下保溫5min,然后在室溫下以 14000r/min的速度離心4min;四、 取600^iL的上層水相與同體積氯仿混合于另一個(gè)1.5mL的環(huán)氧樹脂 管中，以2000r/min的速度渦旋20s后，再以14000r/min的速度離心4min;五、 再取400nL上層水相與800nL的絕對乙醇和40nL、濃度為3mol/L 的醋酸鈉混合，以2000r/min的速度渦旋20s后，于-20。C保溫lOmin，再以 16000r/min的速度離心5min獲得RNA沉淀物；六、 用體積為lmL、質(zhì)量濃度為70%的乙醇洗滌沉淀物，以16000r/min 的速度離心3min后，在室溫下干燥至無乙醇?xì)埩?。七?將干燥的RNA重懸于20nLDEPC水中，加入DNA酶(DNaseI) 和RNA酶抑制劑(Ribonuclease Inhibitor)在37'C下保溫15min，再放入60°C 的水浴10min;八、 RNA抽提之后進(jìn)行RT-PCR操作，反轉(zhuǎn)錄條件為在95'C保溫2min 后，在42""C保溫15min; PCR反應(yīng)參數(shù)為在95'C的條件下預(yù)變性10s, 40個(gè)循環(huán)中，每個(gè)循環(huán)均在95°C的條件下變性5s，在60°C的條件下延伸34s, 其中反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)PCR的正向引物為5，-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3，， 反向引物為5'-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3，，熒光探針為 FAM-5'-CGATTTCATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3'-TAMRA;通過熒光監(jiān)測 系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，收集熒光信號(hào)，各循環(huán)數(shù)的相對熒光值數(shù)據(jù)通過軟 件分析形成圖譜，通過圖譜判斷待檢測物品是否含有單增李斯特活菌。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)試劑用量PCR擴(kuò)增聚合酶(2x)PCR正向引物(10nM)0.4nLPCR反向引物(10nM)0.4|iL探針0.4jiLROXII (熒光染料)0單DNA模板2攀蒸餾水6單總體積20pL步驟七中的DEPC水是用DEPC (diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯) 處理過并經(jīng)高溫高壓消毒的MiliQ純水。步驟二的甲醇、乙醚和氨水的混合液中甲醇:乙醚:氨水的體積比為1:1:1， 其中甲醇的濃度為10.4mol/L，乙醚的濃度為4.5mol/L，氨水的濃度為9.5 mol/Lo用本發(fā)明的方法檢測單增李斯特菌，無假陽性反應(yīng)，可以區(qū)分存活的李 斯特菌和死亡的李斯特菌，這是現(xiàn)有檢測方法達(dá)不到的效果，本發(fā)明的檢測 方法靈敏度最高達(dá)到樣品增菌12小時(shí)檢測限為17CFU/mL，檢測全過程僅 需要16小時(shí)。


圖1為本發(fā)明的方法檢測單增李斯特活菌陽性的曲線示意圖；圖2為具 體實(shí)施方式五的人工污染乳12小時(shí)李斯特活菌檢測圖。
具體實(shí)施方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式檢測單核細(xì)胞增生李斯特活菌的方法按如 下步驟進(jìn)行一、 取待測物品25g置于225mL胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯中進(jìn)行培養(yǎng) 培養(yǎng)8小時(shí)，再取培養(yǎng)液4mL放于5mL環(huán)氧樹脂管中，在室溫下以 14000r/min的速度離心3min，得到菌泥；二、 將得到的菌泥重懸于3mL甲醇、乙醚和氨水的混合液中，再重懸 于lmL的裂解液中，然后加入0.2g、直徑為0.2mm的玻璃珠，2000轉(zhuǎn)/分渦 旋5min。然后以14000r/min的相對離心力離 心3min;三、 取離心后懸浮物700pL與同體積pH值為5.5的水飽和酚混合于 1.5mL的環(huán)氧樹脂管中，在68。C的條件下保溫5min，然后在室溫下以 14000r/min的速度離心4min;四、 取600^L的上層水相與同體積氯仿混合于另一個(gè)1.5mL的環(huán)氧樹脂 管中，以2000r/min的速度渦旋20s后，再以14000r/min的速度離心4min;五、 再取400nL上層水相與800^iL的絕對乙醇和40jxL、濃度為3mol/L 的醋酸鈉混合，以2000r/min的速度渦旋20s后，于-2(TC保溫10min，再以 16000r/min的速度離心5min獲得RNA沉淀物；六、 用體積為lmL、質(zhì)量濃度為70%的乙醇洗滌沉淀物，以16000r/min 的速度離心3min后，在室溫下干燥至無乙醇?xì)埩?。七?將干燥的RNA重懸于20iiLDEPC水中，加入DNA酶(DNaseI) 和RNA酶抑制劑(Ribonuclease Inhibitor)在37'C下保溫15min，再放入60。C 的水浴10min;八、 RNA抽提之后進(jìn)行RT-PCR操作，反轉(zhuǎn)錄條件為在95'C保溫2min 后，在42°。保溫15min; PCR反應(yīng)參數(shù)為在95"C的條件下預(yù)變性10s， 40個(gè)循環(huán)中，每個(gè)循環(huán)均在95°C的條件下變性5s，在60°C的條件下延伸34s， 其中反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)PCR的正向引物為5'-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3', 反向引物為5'-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3，，熒光探針為 FAM-5，-CGATTTCATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3，-TAMRA;通過熒光監(jiān)測 系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，收集熒光信號(hào)，各循環(huán)數(shù)的相對熒光值數(shù)據(jù)通過軟 件分析形成圖譜，通過圖譜判斷待檢測物品是否含有單增李斯特活菌。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)試劑用量PCR擴(kuò)增聚合酶(2x)10nLPCR正向引物(10pM)0單PCR反向引物(10nM)0.4nL探針0單ROXII (熒光染料)0單DNA模板2攀蒸餾水6單總體積20jiL本實(shí)施方式步驟三的水飽和酚為在68。C的條件下苯酚溶解在水中的飽 和溶液。本實(shí)施方式步驟二的裂解液是將醋酸鈉2.7g、 SDS (十二烷基硫酸鈉) 5g、EDTA(乙二胺四乙酸)0.34g溶解到1000mL的去離子水中，調(diào)節(jié)pH至5.5后進(jìn)行常規(guī)的過濾除菌制成的。本實(shí)施方式的檢測結(jié)果曲線如圖1所示，檢測李斯特菌為陽性時(shí)如圖1 中上揚(yáng)的曲線，檢測李斯特菌為陰性時(shí)如圖1中的平直曲線，對比效果明顯。將單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株過夜培養(yǎng)液按10倍遞增稀釋至濃度為3 3 xl04CFU/mL，并在37。C下分別增菌1、 3、 5、 7小時(shí)后進(jìn)行檢測。經(jīng)過1 小時(shí)增菌后，其中接種濃度為3xl02CFU/mL、 3xl03CFU/mL、 3xl04CFU/mL 的單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)液用本實(shí)施方式的方法均可檢出；而經(jīng)過3小 時(shí)增菌之后，接種濃度為3x10 CFU/mL的標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)液也可檢出；五個(gè) 梯度濃度經(jīng)5小時(shí)和7小時(shí)的增菌后，用本實(shí)施方式的方法檢測均可全部檢 出。即經(jīng)lhr增菌的最低檢出限為3xl02CFU/mL，經(jīng)3小時(shí)增菌的最低檢 出限為3x10 CFU/mL，而經(jīng)5小時(shí)和7小時(shí)增菌后檢出限均為3 CFU/mL。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)為步驟七的 DEPC水是用DEPC (diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過并經(jīng)高溫 高壓消毒的MiliQ純水。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)為步驟二的甲醇、乙醚和氨水的混合液中甲醇:乙醚:氨水的體積比為1:1:1。其它步驟及 參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)為:甲醇的濃 度為10.4mol/L，乙醚的濃度為4.5mol/L，氨水的濃度為9.5 mol/L。其它步 驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
三相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式檢測單核細(xì)胞增生李斯特活菌的方法按如 下步驟進(jìn)行一、 取待測物品25g置于225mL胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯中進(jìn)行培養(yǎng) 培養(yǎng)8小時(shí)，再取培養(yǎng)液4mL放于5mL環(huán)氧樹脂管中，在室溫下以 14000r/min的速度離心3min，得到菌泥；二、 將得到的菌泥重懸于3mL甲醇、乙醚和氨水的混合液中，再重懸 于lmL的裂解液中，然后加入0.2g、直徑為0.2mm的玻璃珠，2000轉(zhuǎn)/分渦 旋5min。然后以14000r/min的相對離心力離 心3min;三、 取離心后懸浮物70(^L與同體積pH值為5.5的水飽和酚混合于81.5mL的環(huán)氧樹脂管中，在68。C的條件下保溫5min，然后在室溫下以 14000r/min的速度離心4min;四、 取60(HiL的上層水相與同體積氯仿混合于另一個(gè)1.5mL的環(huán)氧樹脂 管中，以2000r/min的速度渦旋20s后，再以14000r/min的速度離心4min;五、 再取400pL上層水相與800ML的絕對乙醇和40ML、濃度為3mol/L 的醋酸鈉混合，以2000r/min的速度渦旋20s后，于-2(TC保溫10min，再以 16000r/min的速度離心5min獲得RNA沉淀物；六、 用體積為lmL、質(zhì)量濃度為70%的乙醇洗滌沉淀物，以16000r/min 的速度離心3min后，在室溫下干燥至無乙醇?xì)埩?。七?將干燥的RNA重懸于20nLDEPC水中，加入DNA酶(DNaseI) 和RNA酶抑制劑(Ribonuclease Inhibitor)在37。C下保溫15min，再放入60°C 的水浴10min;八、 RNA抽提之后進(jìn)行RT-PCR操作，反轉(zhuǎn)錄條件為在95'C保溫2min 后，在42'C保溫15min; PCR反應(yīng)參數(shù)為在95'C的條件下預(yù)變性10s， 40個(gè)循環(huán)中，每個(gè)循環(huán)均在95°C的條件下變性5s，在60'C的條件下延伸34s， 其中反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)PCR的正向引物為5'-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3', 反向引物為5'-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3，，熒光探針為 FAM-5，-CGATTTCATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3'-TAMRA;通過熒光監(jiān)測 系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，收集熒光信號(hào)，各循環(huán)數(shù)的相對熒光值數(shù)據(jù)通過軟 件分析形成圖譜，通過圖譜判斷人工污染乳是否含有單增李斯特活菌。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)試劑用量PCR擴(kuò)增聚合酶(2x)10pLPCR正向引物(10nM)0.4jiLPCR反向引物(l(HiM)0.4^L探針0單ROXII (熒光染料)0單DNA模板2.0nL蒸餾水6.4pL總體積20tiL本實(shí)施方式步驟三的水飽和酚為在68。C的條件下苯酚溶解在水中的飽 和溶液。本實(shí)施方式檢測人工污染乳的結(jié)果如圖2所示，圖中上揚(yáng)曲線為檢測李 斯特菌的陽性信號(hào)曲線，比較平直的曲線為陰性對照曲線，圖2說明本實(shí)施 方式的檢測方法靈敏度高，檢驗(yàn)結(jié)果明顯。序列表<110>東北農(nóng)業(yè)大學(xué)<120> —種檢測單核細(xì)胞增生李斯特活菌的方法<160> 3<210> 1 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列<220><223>用于檢測單增李斯特菌的正向引物 <400> 1tgc肪gtcc 3agacgcca 19<210>2 <211>24 <212> DNA <213>人工序列<220><223>用于檢測單增李斯特菌的反向引物 <400> 2cactgcatct ccgtggtata ctaa 24<210>3 <211>26<212> DNA <213>人工序列<220><223>用于檢測單增李斯特菌的熒光探針的基因序列 <400> 3cgatttcatc cgcgtgtttc ttttcg 2權(quán)利要求
1. 一種檢測單核細(xì)胞增生李斯特活菌的方法，其特征在于檢測單核細(xì)胞增生李斯特活菌的方法按如下步驟進(jìn)行一、取待測物品25g置于225mL胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯中進(jìn)行培養(yǎng)培養(yǎng)8小時(shí)，再取培養(yǎng)液4mL放于5mL環(huán)氧樹脂管中，在室溫下以14000r/min的速度離心3min，得到菌泥；二、將得到的菌泥重懸于3mL甲醇、乙醚和氨水的混合液中，再重懸于1mL的裂解液中，然后加入0.2g、直徑為0.2mm的玻璃珠，2000轉(zhuǎn)/分渦旋5min。然后以14000r/min的相對離心力離心3min；三、取離心后懸浮物700μL與同體積pH值為5.5的水飽和酚混合于1.5mL的環(huán)氧樹脂管中，在68℃的條件下保溫5min，然后在室溫下以14000r/min的速度離心4min；四、取600μL的上層水相與同體積氯仿混合于另一個(gè)1.5mL的環(huán)氧樹脂管中，以2000r/min的速度渦旋20s后，再以14000r/min的速度離心4min；五、再取400μL上層水相與800μL的絕對乙醇和40μL、濃度為3mol/L的醋酸鈉混合，以2000r/min的速度渦旋20s后，于-20℃保溫10min，再以16000r/min的速度離心5min獲得RNA沉淀物；六、用體積為1mL、質(zhì)量濃度為70％的乙醇洗滌沉淀物，以16000r/min的速度離心3min后，在室溫下干燥至無乙醇?xì)埩?。七、將干燥的RNA重懸于20μL DEPC水中，加入DNA酶和RNA酶抑制劑在37℃下保溫15min，再放入60℃的水浴10min；八、RNA抽提之后進(jìn)行RT-PCR操作，反轉(zhuǎn)錄條件為在95℃保溫2min后，在42℃保溫15min；PCR反應(yīng)參數(shù)為在95℃的條件下預(yù)變性10s，40個(gè)循環(huán)中，每個(gè)循環(huán)均在95℃的條件下變性5s，在60℃的條件下延伸34s，其中反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)PCR的上游引物為5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’，下游引物為5’-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3’，熒光探針為FAM-5’-CGATTTCATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3’-TAMRA；通過熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，收集熒光信號(hào)，各循環(huán)數(shù)的相對熒光值數(shù)據(jù)通過軟件分析形成圖譜，通過圖譜判斷待檢測物品是否含有單增李斯特活菌。
實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)試劑用量 PCR擴(kuò)增聚合酶(2x) 10μLPCR正向引物(10μM) 0.4μLPCR反向引物(10μM) 0.4μL探針0.4μLROX II 0.4μLDNA模板 2.0μL蒸餾水 6.4μL總體積 20μL
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測單核細(xì)胞增生李斯特活菌的方法， 其特征在于步驟七的DEPC水是用DEPC處理過并經(jīng)高溫高壓消毒的MiliQ 純水。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測單核細(xì)胞增生李斯特活菌的方法， 其特征在于步驟二的甲醇、乙醚和氨水的混合液中甲醇:乙醚:氨水的體積比 為1:1:1。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測單核細(xì)胞增生李斯特活菌的方法， 其特征在于甲醇的濃度為10.4mol/L，乙醚的濃度為4.5mol/L,氨水的濃度 為9.5 mol/L。
全文摘要
一種檢測單核細(xì)胞增生李斯特活菌的方法，它涉及一種檢測李斯特菌的方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有檢測單增李斯特活菌的方法容易產(chǎn)生假陽性的問題。本發(fā)明檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌的方法按如下步驟進(jìn)行從待測物品中提取菌泥后提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)PCR；即得到可以判斷待測物品是否含有單增李斯特活菌的圖譜。本發(fā)明具有靈敏度高，特異性好，操作簡便，周期較短的優(yōu)點(diǎn)，適應(yīng)食品工業(yè)中致病菌快速檢測的需求。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101260423SQ20081006439
公開日2008年9月10日 申請日期2008年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月28日
發(fā)明者琦 呂, 姜毓君, 曲妍妍, 畢宇涵, 王明娜, 麗 相, 冰 閆, 韓希妍 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)