專(zhuān)利名稱(chēng)：紅曲協(xié)同發(fā)酵提高蛹蟲(chóng)草子實(shí)體和蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌發(fā)酵工程，具體而言涉及蛹蟲(chóng)草的固體培養(yǎng)及其次生代 謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
蛹蟲(chóng)草[(^^^;^6/^/ ///"〃5 (L.) Link]又名北冬蟲(chóng)夏草，隸屬于真菌 界、子嚢菌門(mén)、子嚢菌綱、糞殼菌亞綱、肉座菌目、麥角菌科、蟲(chóng)草屬，又 名北蟲(chóng)草，北冬蟲(chóng)夏草。它是蟲(chóng)草屬真菌的模式種，其宿主主要為鱗翅目的 蠶蛾科、舟蛾科、天蠶蛾科等。它是由子座與菌核兩部分組成的復(fù)合體。其 無(wú)性型為蛹草擬青霉[AecZ/o/w/c" / ///&r/s(Kob.) Br. &Sm.]。其分布廣 泛，在我國(guó)河北、陜西、安徽、吉林、遼寧、云南、青海、貴州、四川、廣 西等均有發(fā)現(xiàn)。蛹蟲(chóng)草含有多種有效成分，包括蟲(chóng)草酸(D-甘露醇)、蟲(chóng)草 多糖、蟲(chóng)草菌素(cordycepin)、 ^-曱基腺苷(N6-methyladenosine )、 05-乙酰蟲(chóng)草素(05 -acetylcordycepin)、腺苷、3-氨基-3-脫氧腺苷、高瓜氨 酰氨基腺苷、賴(lài)氨酰氨基腺苷、麥角甾醇過(guò)氧化物(ergosterol peroxide) 和蟲(chóng)草環(huán)肽(cordycepeptide)等。蟲(chóng)草菌素是蛹蟲(chóng)草最重要的活性成分之 一，具有顯著的藥理作用。
《新華本草綱要》記載蛹蟲(chóng)草功效為"全草味甘，性平，有益肺腎、補(bǔ) 精髓、止血化痰"。蛹蟲(chóng)草可用于肺結(jié)核、老人虛弱、貧血等，是具有滋補(bǔ) 功能的珍貴中藥材。于2003年被批準(zhǔn)為國(guó)家一類(lèi)新藥(中藥)。人們對(duì)蛹蟲(chóng) 草的藥理作用進(jìn)行了大量的研究，證實(shí)其具有廣泛的藥理學(xué)活性及臨床作用。比如抗腫瘤作用，提高免疫功能的作用，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的作用，對(duì)肺 虛咳嗽，急慢性支氣管炎，哮喘等有較好的療效。對(duì)腎虛所致的陽(yáng)痿早泄有 良好的治療及保健作用，對(duì)腎虛腰痛，糖尿病，蛋白尿等腎功能障礙患者也 有較好的治療效果。具有明顯的抗氧化、抗衰老作用。
蟲(chóng)草菌素即3'-脫氧腺苷(3'-Deoxyadenosine),又稱(chēng)蛹蟲(chóng)草菌素，由 Cunn i ngham等于19 51年從蛹蟲(chóng)草的培養(yǎng)濾液中分離得到。蟲(chóng)草菌素是第 一個(gè) 從真菌中分離出來(lái)的核苷類(lèi)抗菌素。蟲(chóng)草菌素的分子式為C,。H,3N503,分子量 251,堿性，針狀或片狀結(jié)晶，熔點(diǎn)230 23rC,溶于水、熱乙醇和曱醇， 不溶于苯、乙醚和氯仿，蒽酮反應(yīng)陽(yáng)性，紫外光最大吸收波長(zhǎng)為259nm。蟲(chóng) 草菌素具有多種生物學(xué)活性，比如抑菌作用，抗腫瘤作用，抑制人體免疫 缺陷病毒HIVI型病毒的作用，免疫調(diào)節(jié)作用和明顯降血糖、降血脂作用。其 中，降血脂方面的效果尤為明顯，與市售的法國(guó)力博福尼制藥公司生產(chǎn)的非 諾貝特(力平之)效果相當(dāng)或優(yōu)于非諾貝特；在治療白血病方面在美國(guó)進(jìn)入 了臨床研究。蟲(chóng)草菌素的結(jié)構(gòu)式為
近年來(lái)，蟲(chóng)草的生產(chǎn)與應(yīng)用受到了人們的關(guān)注，涉及蟲(chóng)草的專(zhuān)利申請(qǐng)上 百件。例如94115054.2號(hào)"冬蟲(chóng)夏草的深層發(fā)酵工藝"、03117400.0號(hào)"一種誘發(fā)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體原基的化學(xué)方法"、200410059964. X號(hào)"蛹蟲(chóng)草食品和蛹蟲(chóng) 草基質(zhì)及其制備方法"、200610028671. 4號(hào)"一種發(fā)酵蟲(chóng)草菌^^分的水溶性活性 組分及其應(yīng)用，，等。然而迄今為止，尚無(wú)利用紅曲協(xié)同發(fā)酵提高蛹蟲(chóng)草子實(shí) 體和蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量技術(shù)的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供利用紅曲協(xié)同發(fā)酵提高蛹蟲(chóng)草子實(shí)體和蟲(chóng)草菌 素產(chǎn)量的方法，提高蛹蟲(chóng)草子實(shí)體的產(chǎn)量與質(zhì)量。
本發(fā)明所使用的菌抹為紅曲為紫紅曲M;w/77"re^菌林ATCC 16365; 蛹蟲(chóng)草(Corriycejas訪""ar/s )為無(wú)性型蛹草擬青霉(； se"7啤ce51 肌7/"rh) PM-71菌抹，此菌抹已于2008年4月17日在中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCCNo. 2459。
發(fā)明人指出，在實(shí)現(xiàn)紅曲協(xié)同發(fā)酵之前，需要進(jìn)行菌種活化和拮抗試驗(yàn)， 具體方法是
1、菌種活化分6步進(jìn)行
(l)配PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g,水煮30min,用4層紗布過(guò)濾，取濾液， 葡萄糖20g，瓊脂15 20g，加水至1000ml;
("將配好的PDA培養(yǎng)基分裝到試管，包扎，121。C滅菌3(kin;
(3) 滅好菌的試管培養(yǎng)基凝固前擺斜面，冷卻；
(4) 將原始菌種從4 。C冰箱中取出，室溫下在超凈操作臺(tái)上無(wú)菌接種； ("接種紅曲(ATCC 16365)的試管置30匸下黑暗恒溫培養(yǎng)，接種蛹蟲(chóng)草
(CGMCCNo. 2459 )的試管置26。C下黑暗恒溫培養(yǎng)。
(6)3~5天后，等菌種長(zhǎng)滿斜面，用無(wú)菌水洗斜面制成孢子懸液(在超凈 工作臺(tái)上無(wú)菌操作)。2、拮抗實(shí)驗(yàn)
用點(diǎn)種法，在沙氏平板上同時(shí)接種蛹蟲(chóng)草(CGMCCNo. 2459 )和紅曲(ATCC 16365),并使二者相距2cm，另在沙氏平板上分別接種單一的蛹蟲(chóng)草、紅曲， 作對(duì)照。2個(gè)單一的只接種蛹蟲(chóng)草和紅曲的平板和3個(gè)接種雙菌的平板作為一 組，共接5組，根據(jù)蛹蟲(chóng)草和紅曲各自最適生長(zhǎng)溫度設(shè)置協(xié)同發(fā)酵的培養(yǎng)溫 度梯度，將5組平板分別放在26。C，27。C，28。C，30。C及26。C, 6h/30。C，6h交替 的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，篩選出使二者生長(zhǎng)良好且均衡的培養(yǎng)溫度為26。C 。
本發(fā)明的紅曲協(xié)同發(fā)酵提高蛹蟲(chóng)草子實(shí)體和蟲(chóng)草素產(chǎn)量的方法包括
1、 紅曲培養(yǎng)
在容積為350ml的圓柱形無(wú)色玻璃瓶(內(nèi)徑6. 2cm，高度15cm)中裝入25g 大米，按l : 1. 6的料水比加入40ml蒸餾水；用耐高溫單層聚丙烯塑料膜封口 ， 121°C、 30min高壓滅菌，冷卻后接種已活化好的紅曲(ATCC 16365)菌抹的孢 子懸液，置30。C下黑暗恒溫培養(yǎng)；
2、 蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)
在容積為350ml的圓柱形無(wú)色玻璃瓶中裝入25g大米，麥麩l. 2g,玉米粉 0, 4g，豆粉0. 4g,按l : 1. 6的料水比加入43. 2ml營(yíng)養(yǎng)液；用耐高溫單層聚丙烯 塑料膜封口， ln。C下高壓滅菌30min,冷卻后，接種蛹蟲(chóng)草(CGMCCNo. 2459 ) 菌林的孢子懸液，置26。C下黑暗恒溫培養(yǎng)；
3、 雙菌混合
待培養(yǎng)的紅曲和蛹蟲(chóng)草都封底后，在無(wú)菌條件下將紅曲與蛹蟲(chóng)草的大米 培養(yǎng)物按l : 9的比例混合，混合后攪拌均勻，置于26。C下黑暗恒溫培養(yǎng)，5~ 7d后進(jìn)入蛹蟲(chóng)草子實(shí)體管理階段；
4、 子實(shí)體管理為刺激子實(shí)體原基形成，增加光照和溫差刺激，每天散射光光照不少于
10h，溫度每天18。C， 10h/25°C， 14h (光照)交替，相對(duì)濕度提高至80%左右， 每天通風(fēng)10min以補(bǔ)充新鮮空氣；蛹蟲(chóng)草子座長(zhǎng)出后，增加光照強(qiáng)度至1000LX， 溫度保持22。C左右，空氣濕度85%左右；每天通風(fēng)換氣3次，每次10min;待 子實(shí)體生長(zhǎng)30天后，收獲^^黃色的子實(shí)體。
上述方法的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)階段中，所述的營(yíng)養(yǎng)液配方為葡萄糖10g,蛋白 胨5g， MgSO,7H20 lg， KH2P04 2g，檸檬酸銨lg，水1000ml。
蟲(chóng)草菌素的檢測(cè)方法如下通過(guò)HPLC分析蟲(chóng)草菌素的含量，HPLC測(cè)定用 PC2000型HPLC分析儀(Scientific systems Inc. ， PA， USA);檢測(cè)波長(zhǎng)為259nm; 柱溫30。C;流動(dòng)相為10mM 10^04溶于曱醇/雙蒸水(15 : 85),流速為lml/min; 進(jìn)樣量為20n 1。先精密稱(chēng)取干菌絲粉O. 2g置于具塞試管中，加入雙蒸水10ml， 超聲處理30tnin,然后在5000g下離心15min，最后經(jīng)O. 45 pm濾膜過(guò)濾除去固 體雜質(zhì)后檢測(cè)其中蟲(chóng)草菌素的含量；若測(cè)定前樣品經(jīng)過(guò)稀釋?zhuān)瑒t乘以稀釋倍 數(shù)。無(wú)紅曲協(xié)同發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)組蛹蟲(chóng)草子實(shí)體平均產(chǎn)量為2.87g/瓶(干重)，與 紅曲協(xié)同發(fā)酵的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體平均產(chǎn)量為3. 74g/瓶，蛹蟲(chóng)草子實(shí)體產(chǎn)量提高 30%多。子實(shí)體里蟲(chóng)草菌素平均含量提高20%，達(dá)到20.2mg/g。
表1 紅曲和蛹蟲(chóng)草協(xié)同發(fā)酵時(shí)紅曲加入量對(duì)其子實(shí)體和蟲(chóng)草菌素產(chǎn)量的影響。
紅曲加入量子實(shí)體平均條單根子實(shí)體最大子實(shí)體平均千重子實(shí)體中蟲(chóng)草菌
數(shù)(根/瓶)長(zhǎng)度(cm)(g/瓶)素含量mg/g
02327. 02. 8716. 83
10%4527. 33. 7420. 20
20%84. 00. 4815.23
30%33. 50. 1310. 70
40%~ 90%0000本發(fā)明的紅曲協(xié)同發(fā)酵提高蛹蟲(chóng)草子實(shí)體和蟲(chóng)草素產(chǎn)量的方法不僅能明
顯提高蛹蟲(chóng)草子實(shí)體產(chǎn)量(提高達(dá)30%多)，而且還能提高蛹蟲(chóng)草子實(shí)體的 質(zhì)量，使子實(shí)體里蟲(chóng)草菌素含量提高20% (達(dá)到^Jmg/g以上)，這對(duì)提高 蛹蟲(chóng)草固體發(fā)酵的產(chǎn)量和效率，以及提高藥物蛹蟲(chóng)草菌粉和膠囊中有效成分 的含量具有重要意義。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:在洗凈的10個(gè)無(wú)色玻璃瓶中分別裝入25g大米，按1:1.6的料水 比加入40ml蒸餾水，封口后在12rC， 30min高壓滅菌，冷卻后接種已活化好的 紅曲(ATCC 16365)菌4朱的孢子懸液，置3(TC下，黑暗恒溫培養(yǎng)。在90個(gè)罐頭 瓶中分別裝入25g大米，麥麩1.2g,玉米粉0.4g,豆粉0.4g，按l : 1.6的料水 比加入43. 2ml營(yíng)養(yǎng)液(配制方法為葡萄糖10g，蛋白胨5g,MgS04D7H20 lg， KH2P04 2g，檸檬酸銨lg,水1000ml );高壓滅菌，冷卻后，接種蛹蟲(chóng)草 (CGMCCNo. 2459 )菌抹的孢子懸液，置26。C下黑暗恒溫培養(yǎng)。
待培養(yǎng)的紅曲和蛹蟲(chóng)草封底后，在無(wú)菌條件下將紅曲與蛹蟲(chóng)草的大米培養(yǎng) 物按l : 9比例混合，混合后攪拌均勻，置于26。C下黑暗恒溫培養(yǎng)，5-7d后增 加光照和溫差刺激，每天光照不少于10h,溫度每天18。C,10h/25。C，14h (光 照)交替，相對(duì)濕度提高至80%左右，蛹蟲(chóng)草子座長(zhǎng)出后，增加光照強(qiáng)度至 1000LX,溫度保持22。C左右，空氣濕度85%左右，待子實(shí)體生長(zhǎng)30天后，收 獲子實(shí)體并烘干。
實(shí)施例2:在洗凈的20個(gè)無(wú)色玻璃瓶中分別裝入20g大米，按l:l. 6的料水 比加入32ml蒸餾水，封口后在121。C, 30min高壓滅菌，冷卻后接種已活化好的 紅曲(ATCC 16365)菌林的孢子懸液，置3(TC下，黑暗恒溫培養(yǎng)。在180個(gè)罐 頭瓶中分別裝入20g大米，麥麩lg,玉米粉0. 3g,豆粉O. 3g按l : 1.6的料水比加入34.6ml營(yíng)養(yǎng)液(配制方法為葡萄糖10g,蛋白胨5g， MgSO,7H20 lg， KH2P04 2g，檸檬酸銨lg,水1000ml);高壓滅菌，冷卻后，接種蛹蟲(chóng)草 (CGMCCNo. 2459 )菌抹的孢子懸液，置26。C下黑暗恒溫培養(yǎng)。
待培養(yǎng)的紅曲和蛹蟲(chóng)草封底后，在無(wú)菌條件下將紅曲與蛹蟲(chóng)草的大米培養(yǎng) 物按l : 9的比例混合，混合后攪拌均勻，置于26。C下黑暗恒溫培養(yǎng)，5-7d后 增加光照和溫差刺激，每天光照不少于10h，溫度每天18。C,10h/25。C，14h(光 照)交替，相對(duì)濕度提高至80%左右，蛹蟲(chóng)草子座長(zhǎng)出后，增加光照強(qiáng)度至 1000LX,溫度保持22。C左右，空氣濕度85%左右，待子實(shí)體生長(zhǎng)30天后，收 獲子實(shí)體并供干。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的 限制，任何未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施 例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1、紅曲協(xié)同發(fā)酵提高蛹蟲(chóng)草子實(shí)體和蟲(chóng)草素產(chǎn)量的方法，其特征在于該方法包括(1)紅曲培養(yǎng)在容積為300ml的圓柱形無(wú)色玻璃瓶中裝入25g大米，按1∶1.6的料水比加入40ml蒸餾水；用耐高溫單層聚丙烯塑料膜封口，121℃、30min高壓滅菌，冷卻后接種已活化好的紅曲菌種，置30℃下黑暗恒溫培養(yǎng)；(2)蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)罐頭瓶中裝入25g大米，麥麩1.2g，玉米粉0.4g，豆粉0.4g，按1∶1.6的料水比加入43.2ml營(yíng)養(yǎng)液；用耐高溫單層聚丙烯塑料膜封口，121℃下高壓滅菌30min，冷卻后，接種蛹蟲(chóng)草菌株的孢子懸液，置26℃下黑暗恒溫培養(yǎng)；(3)雙菌混合待培養(yǎng)的紅曲和蛹蟲(chóng)草都封底后，在無(wú)菌條件下將紅曲與蛹蟲(chóng)草的大米培養(yǎng)物按1∶9的比例混合，混合后攪拌均勻，置于26℃下黑暗恒溫培養(yǎng)，5～7d后進(jìn)入蛹蟲(chóng)草子實(shí)體管理階段；(4)子實(shí)體管理每天用散射光光照不少于10h，溫度每天18℃，10h/25℃，14h光照交替，相對(duì)濕度提高至80％左右，每天通風(fēng)10min以補(bǔ)充新鮮空氣；蛹蟲(chóng)草子座長(zhǎng)出后，增加光照強(qiáng)度至1000LX，溫度保持22℃左右，空氣濕度85％左右；每天通風(fēng)換氣3次，每次10min；待子實(shí)體生長(zhǎng)30天后，收獲橙黃色的子實(shí)體。
2、 按照權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)過(guò)程中， 所述的營(yíng)養(yǎng)液配方為葡萄糖10g，蛋白胨5g, MgS04.7H20 lg， KH2P04 2g， 檸檬酸銨lg，水IOOO ml。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了紅曲協(xié)同發(fā)酵提高蛹蟲(chóng)草子實(shí)體和蟲(chóng)草素產(chǎn)量的方法，事前，需要進(jìn)行菌種活化和拮抗試驗(yàn)，嗣后需要進(jìn)行蟲(chóng)草菌素的檢測(cè)；該方法包括4個(gè)階段(1)紅曲培養(yǎng)；(2)蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)；(3)雙菌混合協(xié)同發(fā)酵；(4)子實(shí)體管理。本方法不僅能明顯提高蛹蟲(chóng)草子實(shí)體產(chǎn)量，提高達(dá)30％多；而且還能提高蛹蟲(chóng)草子實(shí)體的質(zhì)量，使子實(shí)體里蟲(chóng)草菌素含量提高20％，達(dá)到20.2mg/g以上。這對(duì)提高蛹蟲(chóng)草固體發(fā)酵的產(chǎn)量和效率，以及提高藥物蛹蟲(chóng)草菌粉和膠囊中有效成分的含量具有重要意義，具有良好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。
文檔編號(hào)C12N1/14GK101531968SQ20081006873
公開(kāi)日2009年9月16日 申請(qǐng)日期2008年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月4日
發(fā)明者康冀川, 文庭池, 謝紅艷, 雷幫星 申請(qǐng)人:貴州大學(xué)