專利名稱：：兔抗人IRGMa全長蛋白多克隆抗體的制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及IRGMa蛋白的制備和應(yīng)用。具體的說是一種兔抗人IRGMa全長蛋白多克隆抗體的制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：MS是T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病，研究發(fā)現(xiàn)臨床表型嚴(yán)重者，IFN-y表達(dá)細(xì)胞顯著增多，提示IFN-y可使MS病變加重。小鼠Irgml(LRG-47)是由IFN-y誘導(dǎo)的蛋白，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)Irgml與MS的動物模型EAE的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。Irgml是IFN-y的一個下游效應(yīng)子，對淋巴細(xì)胞的存活具有下游調(diào)節(jié)作用，在免疫防御中起著重要作用。人類IRGM基因于2006年被克隆，定位于5q33.1，編碼一個氨基端和羧基端截短的G區(qū)。它與小鼠Ir柳同源，在人類吞噬細(xì)胞的自體吞噬過程中是必要的，可以誘導(dǎo)BCG吞噬體的成熟。IRGM基因因3'端剪切方式不同，共有5個轉(zhuǎn)錄本，分別為IRGMa、IRGMb、:[RGMc、IRGMd和IRGMe。5個轉(zhuǎn)錄本的氨基酸數(shù)目分別為182、211、192、199、192。IRGMa的182個氨基酸是5個轉(zhuǎn)錄本共有的，因此，IRGMa是該蛋白的主要功能區(qū)。目前國外學(xué)者制備的IRGM抗體為C端涵蓋10多個氨基酸外加一個半胱氨酸(CQIRENVLENLQKER)的抗體，用免疫熒光或Westernblot的方法，該抗體不能檢測到細(xì)胞內(nèi)源信號，由于其未包括主要功能區(qū)，限制了抗體使用的范圍。而目前沒有商品化的IRGM抗體。因此，應(yīng)用IRGMa全長蛋白制備兔抗人多克隆抗體，并應(yīng)用于研究IRGM基因的表達(dá)譜分析及在MS發(fā)病過程中具有實際作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在IRGM基因中優(yōu)選出一段編碼序列，并制備出IRGMa全長蛋白多克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種兔抗人IRGMa全長蛋白多克隆抗體的制備選用，其特征是針對IRGM蛋白的功能區(qū)，選用IRGMa來制備抗體。選用哪一段蛋白來制備抗體及如何獲得正確序列的蛋白是本發(fā)明的關(guān)鍵。IRGM有5個轉(zhuǎn)錄本,5個轉(zhuǎn)錄本氨基酸數(shù)目分別為IRGMa(182)、IRGMb(211)、IRGMc(192)、IRGMd(199)、IRGMe(192),IRGMa的182個氨基酸是5個轉(zhuǎn)錄本共有的，因此，1-182氨基酸應(yīng)該是該蛋白的主要功能區(qū)。而且，IRGMa為一個外顯子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，IRGMb、IRGMc、IRGMd、IRGMe為多個外顯子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，故用IRGMa來制備抗體是既方便，又包括了主要功能區(qū)，因此是可行的。僅合成數(shù)十個氨基酸的多肽來制備兔抗人IRGMa多克隆抗體，可能導(dǎo)致抗體特異性不夠高；但如果針對IRGMa蛋白的功能區(qū)，直接通過合成多肽來合成這么大片段且編碼正確的蛋白十分昂貴，是不現(xiàn)實的。故本發(fā)明選擇GST和His基因融合蛋白的方法來制備該目的蛋白片段。表達(dá)GST和His基因融合蛋白，必須構(gòu)建含IRGMa全長基因(546bp)的GST和His基因融合載體；根據(jù)引物設(shè)計原則設(shè)計引物。本發(fā)明的兔抗人IRGMa全長蛋白多克隆抗體的提取方法1、從人的外周靜脈血抽提基因組DNA。2、引物設(shè)計及GST基因融合載體的選擇選擇了pCMV-邁yc，pGEX4T-2和Pet-28a(O-His載體，并選用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xhol做為連接點；根據(jù)引物設(shè)計原則設(shè)計引物，做到同一條引物沒有回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)，5'端與3'端的4個堿基不互補，正反向引物序列不互補，Tm值相近(2A+2T+4G+4C),且在Genebank上找不到同源系列；共設(shè)計了2對引物，序列如下第--對用于轉(zhuǎn)載pCMViyc-IRGM和pGEX4T-2-IRGM載體IF:5，-AgCgAATTCCTATggAAgCCATgMTgTTg-3，(含EcoRI切點)1R:5，-gCgCTCgAgTTAgTATTCACATACCCgCTC-3，(含XhoI切點)第二對用于轉(zhuǎn)載pET-28a(+)-IRGM載體2F:5，-AgCgAATTCATggAAgCCATgAATgTTg-3，(含EcoRl切點)2R:5，-gCgCTCgAgTTAgTATTCACATACCCgCTC-3，(含XhoI切點)3、制備目的基因片段并連接到myc，GST和His基因融合載體上以正常人基因組DNA為模板，分別釆用上述3對引物和普通Taq酶擴(kuò)增IRGMa全長編碼序列；應(yīng)用TA克隆試劑盒將PCR產(chǎn)物分別連接到PCR2.1載體上，轉(zhuǎn)化并挑取陽性TA克隆，搖菌(大腸桿菌DH5ci菌株，上海卓康生物科技有限公司)，并采用質(zhì)粒抽提純化試劑盒抽提純化質(zhì)粒；EcoRI和Xhol雙酶切證實陽性TA克隆并采用T載體引物及ABIPRISMR3700DM序列分析儀測序鑒定連接在PCR2.1載體上的目的基因片段序列的正確性；正確的TA克隆采用應(yīng)用EcoRI和Xhol雙酶切，回收目的基因片段并連接到經(jīng)過EcoRI和Xhol雙酶切回收的myc,GST和His基因融合載體pCMV-myc，pGEX4T-2，pET-28a(+)-His上并轉(zhuǎn)化；抽提質(zhì)粒，測序驗證。4、含目的基因片段的GST和His基因融合載體的表達(dá)鑒定分別挑取1粒轉(zhuǎn)化好的GST和His基因融合載體克隆，用5ml2YT培養(yǎng)基搖菌(大腸桿菌origamiDE3，Novagen公司產(chǎn)品)，離心收集細(xì)菌并制備小量的GST和His基因融合蛋白，采用PAGE-SDS膠電泳分離蛋白片段，考馬斯亮蘭染色，顯示GST和His基因融合蛋白片段大小。5、制備并純化GST基因融合蛋白及收集目的蛋白大量制備GST基因融合蛋白，過柱純化回收并定量，應(yīng)用Thrombin23X:酶切過夜，或GST基因融合蛋白先掛GST珠子，用Thrombin23'C酶切過夜，第二天過柱收集IRGMa全長目的蛋白。6、大量制備His基因融合蛋白因IRGMa-His基因融合蛋白為不可溶的蛋白，故將離心收集的細(xì)菌用1X蛋白上樣Buffer裂解后采用PAGE-SDS膠電泳分離蛋白片段，考馬斯亮蘭染色，顯示His基因融合蛋白目的片段，割膠凍存于-80'(:冰箱備用。7、制備并純化含GST-tag和His-tag的兔抗人IROIa全長蛋白多克蟄抗體:分別將由Thrombin酶切后回收的IRGMa蛋白和含His-IRGMa融合蛋白的PAGE膠與不完全弗氏佐劑勻漿后皮下多點注射免疫家兔，1個月后從家兔的耳緣靜脈取血lml，凝固后離心取血清，ELISA方法檢測IRGMa多克隆抗體的滴度，此時為l:2000;此后每7-14天用不完全弗氏佐劑與蛋白勻漿后加強免疫1次，每次注射前均從耳緣靜脈取血lml,ELISA方法檢測抗體滴度；加強免疫2次后，ELISA方法檢測抗體的滴度達(dá)到了1:10000以上；采用免疫印跡方法驗證抗體的特異性;從家兔頸動脈取血，離心收集抗體血清分裝，采用ImmobilizedProteinAColumn(Pierce公司)純化抗體，檢測濃度并分裝，保存于-80'C。8、兔抗人IRGMa多克隆抗體的應(yīng)用(1)免疫印跡用pCMViyc-IRGMa轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞，將收集的細(xì)胞裂解液按不同濃度上樣電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉做為封閉液，室溫封閉蛋白電轉(zhuǎn)膜60分種；兔抗人IRGMa多克隆抗體(濃度為5ug/ul)做為一抗，1:500-1:10000稀釋，室溫?fù)u育2小時，或4度搖育過夜，1XTBST緩沖液搖洗3次，每次5分種；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG做為二抗，1:5000稀釋，室溫?fù)u育45分鐘，1XTBST緩沖液搖洗3次，每次5-15分種，辣根過氧化物底物顯色，壓片并沖片。(2)ELISA:將純化的GST基因融合蛋白(抗原)按lng、2.5ng、5ng、10ng、100ng的量作一梯度，并將免疫前和免疫后血清按免疫前血清1:500、免疫后血清以1:500、1:1000、1:2000、1:5000、1:10000作一抗體梯度，免疫前血清作為對照，做ELISA。(3)細(xì)胞免疫熒光染色:將未轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞滴片于多聚賴氨酸處理過的蓋玻片上，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，10%山羊血清室溫封閉細(xì)胞60分鐘；兔抗人丄RGMa抗體濃度為5ug/ul，1:100-1:200稀釋，室溫反應(yīng)2小時，1XPBS搖洗3次，每次5-10分鐘；帶綠色熒光的羊抗兔IgG作為二抗，1:1000-1:2000稀釋，室溫反應(yīng)30-60分鐘，二抗封閉結(jié)束前5分鐘，DAPI染核，1XPBS搖洗3次，每次5-10分鐘；封片鏡下觀察。(4)免疫組化將多種人或小鼠的組織石蠟切片脫蠟并復(fù)水，3細(xì)202室溫孵胄'10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸館水沖洗，PBS浸泡5分鐘，再將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92°C-98-C之間并持續(xù)2分鐘進(jìn)行抗原熱修復(fù)。10X正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37'C孵育1-2小時或4'C過夜。PBS沖洗，5分鐘X3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗(19&BSA-PBS稀釋)，37'C孵育30分鐘；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37'C或室溫孵育30分鐘。PBS沖洗，5分鐘X3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37C孵育30分鐘。PBS沖洗，5分鐘X3次。顯色劑顯色(DAB)。自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。(5)組織免疫熒光將多種人或小鼠的組織石蠟切片脫蠟并復(fù)水，3細(xì)202室溫孵育5-IO分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，再將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92'C-98'C之間并持續(xù)2分鐘進(jìn)行抗原熱修復(fù)。10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加兔抗人IRGMa抗體濃度為5ug/ul，1:100-1:200稀釋，室溫反應(yīng)2小時，1XPBS，沖洗3次，毎次10分鐘；帶綠色熒光的羊抗兔IgG作為二抗，1:100-1:200稀釋，室溫反應(yīng)45分鐘，二抗封閉結(jié)束前5分鐘，DAPI染核，1XPBS沖洗3次，每次5分鐘；封片鏡下觀察。本發(fā)明的有益效果是由于本發(fā)明設(shè)計并制備了兔抗人IRGMa全長蛋白多克隆抗體，涵蓋了其主要的功能區(qū)，從而保證了抗體的高度特異性，有助于進(jìn)行IRGM蛋白功能的研究及其在MS發(fā)病過程中的具體作用，從而對揭示MS的發(fā)病機(jī)制并尋找有效的基因免疫治療措施有著積極的作用。圖l是本發(fā)明抗體用于ELISA的結(jié)果照片。隨著上樣蛋白濃度的增高，抗原抗體反應(yīng)明顯增強，即使在lng的蛋白上樣量時，免疫后血清在l:10000的稀釋倍數(shù)下也與免疫前血清有著10倍的數(shù)量級差別，該結(jié)果表明，融合表達(dá)的IRGMa-GST蛋白和抗體具有特異的結(jié)合，且抗體的效價達(dá)到1:10000以上。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>圖2本發(fā)^^抗體月目于免疫印跡的結(jié):果照片。上樣;l羊品為4T-2-IRGMa原核質(zhì)粒表達(dá)的蛋白，艮PIRGMa-GST融合蛋白，大小約為46KDa，介于43和66KDa之間。4個泳道蛋白上樣量一致，但雜交用的一抗不同。1:為免疫前血清l:500;2，3，4均為免疫后血清，稀釋效價分別為l:2000,1:5000和l:10000。免疫印跡結(jié)果表明，在預(yù)期大小相應(yīng)的位置出現(xiàn)特異條帶，提示IRGMa-GST融合蛋白得以正確表達(dá)，也表明本發(fā)明抗體特異性好。圖2本發(fā)明抗體用于免疫印跡的結(jié)果照片。l:為pCMV-myc-IRGMa轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞，2:為未轉(zhuǎn)的293T細(xì)胞。IRGMa-myc融合蛋白約24KDa，介于20.1和31KDa之間。免疫印跡結(jié)果表明，在預(yù)期大小相應(yīng)的位置出現(xiàn)特異條帶，提示IRGMa-myc融合蛋白得以正確表達(dá)，也表明本發(fā)明抗體特異性好。圖4本發(fā)明抗體用于Jurkat細(xì)胞免疫熒光的照片。在所有Jurkat細(xì)胞的胞漿中都見到綠色熒光，說明Jurkat細(xì)胞具有IRGM蛋白的內(nèi)源性表達(dá)，也表明本發(fā)明抗體特異性好。圖5本發(fā)明抗體用于小鼠脊髄組織免疫熒光結(jié)果。在小鼠脊髓的神經(jīng)元胞漿中見到顆粒狀的紅色熒光，說明在小鼠脊髄的神經(jīng)元胞槳中存在IRGM蛋白的內(nèi)源表達(dá)，也表明本發(fā)明抗體特異性好。圖6本發(fā)明抗體用于人的胰腺組織的免疫組化結(jié)果。在胰島細(xì)胞的胞漿中可見到顆粒狀的棕色信號，在腺泡細(xì)胞中未見到，說明在人的胰島細(xì)胞存在IRGM蛋白的內(nèi)源表達(dá)，也表明本發(fā)明抗體特異性好。圖7本發(fā)明抗體用于人的小腦組織的免疫組化結(jié)果。在小腦浦肯野氏細(xì)胞的胞漿和軸突中均見到顆粒狀的棕色信號，而在分子層和顆粒細(xì)胞層未見到，說明IRGM蛋白在人的小腦的浦肯野氏細(xì)胞中有內(nèi)源性表達(dá)，也表明本發(fā)明抗體特異性好。圖8本發(fā)明抗體用于小鼠脊髄組織的免疫組化結(jié)果。在脊髓神經(jīng)元胞漿和突起中均見到顆粒狀的棕色信號，說明在小鼠脊髄的神經(jīng)元胞漿中存在IRGM蛋白的內(nèi)源表達(dá)，也表明本發(fā)明抗體特異性好。圖9小鼠的胰腺組織免疫組化結(jié)果。在小鼠胰腺的胰島周邊細(xì)胞可見到顆粒狀的棕色信號，在腺泡細(xì)胞中未見到，說明在小鼠的胰島細(xì)胞存在IRGM蛋白的內(nèi)源表達(dá)，也表明本發(fā)明抗體特異性好。具體實施例方式實施例h一種兔抗人IRGMa全長蛋白多克隆抗體的制備選用1、針對IRGM蛋白的共同功能區(qū)，選用涵蓋IRGMa的1-182氨基酸的蛋白來制備抗體。2、根據(jù)引物設(shè)計原則自行設(shè)計兩對引物，構(gòu)建含IRGMa全長基因(546bp)的GST和His基因融合載體，制備涵蓋IRGMa的1-182氨基酸的目的蛋白片段，表達(dá)GST和His基因融合蛋白，免疫家兔，2個月后從家兔頸動脈取血，離心收集抗體血清并純化抗體。本實施例的兔抗人IRGMa全長蛋白多克隆抗體的具體提取方法1、從人的外周靜脈血抽提基因組DNA:因IRGMa僅有一個外顯子，從基因組DNA即能擴(kuò)增到所要的蛋白編碼序列。因此，首先從人的外周靜脈血抽提基因組DNA。2、引物設(shè)計及GST基因融合載體的選擇選擇了pCMViyc,pGEX4T-2和Pet-28a(+)-His載體，并選用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xhol做為連接點；根據(jù)引物設(shè)計原則設(shè)計引物，做到同一條引物沒有回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)，5'端與3'端的4個堿基不互補，正反向引物序列不互補，Tm值相近(2A+2T+4G+4C)，且在Genebank上找不到同源系列；共設(shè)計了2對引物，序列如下第一對用于轉(zhuǎn)載pCMV-myc-IRGM和pGEX4T-2-IRGM載體1F:5，-AgCgAATTCCTATggAAgCCATgAATgTTg-3，(含EcoRl切點)1R:5，-gCgCTCgAgTTAgTATTCACATACCCgCTC-3,(含XhoI切點)第二對用于轉(zhuǎn)載pET-28a(+)-IRGM載體2卜、5，-AgCgAATTCATggAAgCCATgAATgTTg-3,(含EcoRI切點)2R:5，-gCgCTCgAgTTAgTATTCACATACCCgCTC-3，(含XhoI切點)上述2對引物用于PCR擴(kuò)增構(gòu)建質(zhì)粒的目的基因片段。3、制備目的基因片段并連接到myc，GST和His基因融合載體上以正常人基因組DNA為模板，分別采用上述3對引物和普通T叫酶擴(kuò)增IRGMa全長編碼序列；應(yīng)用TA克隆試劑盒將PCR產(chǎn)物分別連接到PCR2.1載體上，轉(zhuǎn)化并挑取陽性TA克隆，搖菌(大腸桿菌DH5a菌株，本室保存)，并采用質(zhì)粒抽提純化試劑盒抽提純化質(zhì)粒；EcoRI和Xhol雙酶切證實陽性TA克隆并采用T載體引物及AB1PR1SMR3700DNA序列分析儀測序鑒定連接在PCR2.1載體上的目的基因片段序列的正確性；正確的TA克隆采用應(yīng)用EcoRI和XhoI雙酶切，回收目的基因片段并連接到經(jīng)過EcoRI和Xhol雙酶切回收的myc，GST和His基因融合載體pCMV-myc，pGEX4T-2，pET-28a(+)-His上并轉(zhuǎn)化；抽提質(zhì)粒，測序驗證。4、含目的基因片段的GST和His基因融合載體的表達(dá)鑒定分別挑取1粒轉(zhuǎn)化好的GST和His基因融合載體克隆，用5ml2YT培養(yǎng)基搖菌(大腸桿菌origamiDE3，Novagen公司產(chǎn)品)，離心收集細(xì)菌并制備小量的GST和His基因融合蛋白，采用PAGE-SDS膠電泳分離蛋白片段，考馬斯亮蘭染色，顯示GST和His基因融合蛋白片段大小。5、制備并純化GST基因融合蛋白及收集目的蛋白大量制備GST基因融合蛋白，過柱純化回收并定量，應(yīng)用Thrombin23'C酶切過夜，或GST基因融合蛋白先掛GST珠子，用Thrombin23'C酶切過夜，第二天過柱收集IRGMa全長目的蛋白。6、大量制備His基因融合蛋白因IRGMa-His基因融合蛋白為不可溶的蛋白，故將離心收集的細(xì)菌用1X蛋白上樣Buffer裂解后采用PAGE-SDS膠電泳分離蛋白片段，考馬斯亮蘭染色，顯示His基因融合蛋白目的片段，割膠凍存于-8(TC冰箱備用。7、制備并純化含GST-tag和His-tag的兔抗人IRGMa全長蛋白多充隆抗體:分別將由Thrombin酶切后回收的IRGMa蛋白和含His-IRGMa融合蛋白的PAGE膠與不完全弗氏佐劑勻漿后皮下多點注射免疫家兔，1個月后從家兔的耳緣靜脈取血lml，凝固后離心取血清，ELISA方法檢測IRGMa多克隆抗體的滴度，此時為l:2000;此后每14天用不完全弗氏佐劑與蛋白勻漿后加強免疫1次，每次注射前均從耳緣靜脈取血lml,ELISA方法檢測抗體滴度;加強免疫2次后，ELISA方法檢測抗體的滴度達(dá)到了1:10000以上；采用免疫印跡方法驗證抗體的特異性，結(jié)果證實該抗體具有高度特異性；從家兔頸動脈取血，離心收集抗體血清分裝，采用ImmobilizedProteinAColumn(Pierce公司)純化抗體，檢測濃度并分裝，保存于-80'C。8、兔抗人IRGMa多克隆抗體的應(yīng)用(l)免疫印跡用pCMV-myc-IRGMa轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞，將收集的細(xì)胞裂解液按不同濃度上樣電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉做為封閉液，室溫封閉蠻白電轉(zhuǎn)膜60分種；兔抗人IRGMa多克隆抗體(濃度為5yg/ul)做為一抗，1:500-1:10000稀釋，室溫?fù)u育2小時，或4度搖育過夜，1XTBST緩沖液搖洗3次，每次5分種；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG做為二抗，1:5000稀釋，室溫?fù)u育45分鐘，1XTBST緩沖液搖洗3次，每次5-15分種，辣根過氧化物底物顯色，壓片并沖片。(2〉ELISA:將純化的GST基因融合蛋白(抗原)按lng、2.5ng、5ng、10ng、100ng的量作一梯度，并將免疫前和免疫后血清按免疫前血清1:500、免疫后血清以1:500、1:1000、1:2000、1:5000、1:10000作一抗體梯度，免疫前血清作為對照，做ELISA，結(jié)果如圖2所提供。(3)細(xì)胞免疫熒光染色:將未轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞滴片于多聚賴氨酸處理過的蓋玻片上，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，10%山羊血清室溫封閉細(xì)胞60分鐘；兔抗人IRGMa抗體濃度為5ug/ul，1:100-1:200稀釋，室溫反應(yīng)2小時，1XPBS搖洗3次，每次5-10分鐘；帶綠色熒光的羊抗兔IgG作為二抗，1:1000-1:2000稀釋，室溫反應(yīng)30-60分鐘，二抗封閉結(jié)束前5分鐘，DAPI染核，1XPBS搖洗3次，每次5-IO分鐘；封片鏡下觀察。(4)免疫組化將多種人或小鼠的組織石蠟切片脫蠟并復(fù)水，3細(xì)202室溫孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，再將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92"C-98'C之間并持續(xù)2分鐘進(jìn)行抗原熱修復(fù)。10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37'C孵育1-2小時或4'C過夜。PBS沖洗，5分鐘X3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗(1%BSA-PBS稀釋)，37T孵育30分鐘；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37'C或室溫孵育30分鐘。PBS沖洗，5分鐘X3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37'C孵育30分鐘。PBS沖洗，5分鐘X3次。顯色劑顯色(DAB)。自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。(5)組織免疫熒光將多種人或小鼠的組織石蠟切片脫蠟并復(fù)水，3%H202室溫孵育5-IO分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，再將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92'C-98'C之間并持續(xù)2分鐘進(jìn)行抗原熱修復(fù)。10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加兔抗人IRGMa抗體濃度為5ug/ul,1:100-1:200稀釋，室溫反應(yīng)2小時，1XPBS，沖洗3次，每次10分鐘；帶綠色熒光的羊抗兔IgG作為二抗，1:100-1:200稀釋，室溫反應(yīng)45分鐘，二抗封閉結(jié)束前5分鐘，DAPI染核，1XPBS沖洗3次，每次5分鐘；封片鏡下觀察。<no><120><160>SEQUENCELISTING復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院兔抗人I股la全長蛋白多克隆抗體的稱備和應(yīng)用"70>Patentlnversion3，J<210>1<211>203<212>DNA<213>Helicobacterpylori<柳>1ATCGAAGCCMetGluAla1ATGMetAAT5GTTGAGAAAValGluLysAlaSer10AlaGATAspGGGGlyAACAsnTTGCCALeuPro15GAGGluCTGVallieTCT60Ser加AACATCAAGAsnlieLysAspTCTG(iCSerGlyGAGGluAATA幼ACTThr幼GGGGly45CTGAAGATALeul,ysHeATGTCCMetSerThrCTGTCCValSer30TTCATCPhelie50AGGArgACTSerACAThrGCCAlaCCAProCTTILeuGTTValOGAArgAACATCAsnlie35AACAsn訴ThrACTThrGGAGyATCMetCAT附sGCAAlaGAGGluGCGGly40OGTGly60l加l幼AAGLysGOCTCAAlaSerCCTProCCTPro65ACTGAGThrGluCTCLeuGTAAAAGtaLys70GCTAlaACCThrCAAGinAGAArgTGTCys75GCCAlaTOCSerTATTyrTTCPheTCTSer幼240TCCSerereLeuCACTTTHisPheGAGAACGluAsnSerTACTyrAATAsn85CTGLeul肪GTCGTCValValATGGAAMetGluTTGLeuATGMetTT>GGACTrpAsp90CAGTTCGinPhe110CTGLeuAACAsnCCTProGGGArg卿GlyTATTyrACAThrGACAspGGGGly訴TTCPhe115TCTSerATClieGCCAlaATGMetACCThrCTTValThrGCAAlaACCThr100TCTSer120300360GCACAATTCAGCATCAATCATGTCATCCTTGCCMAACCGtTGAGGACATGCCAAAGAM!AlaGinPheSerMetAsnHisValMetLeuAlaLysThrAlaGluAspMetGlyLysLys1251301351404加TTCTACATTGTCTCGACCAAGCTAGACATGGACCTCAGCACACGTGCCOCOCAGAAGTCPheTyrUeValTipThrLysUuAspMetAspLeuSerThrGlyAlaLeuProGluVal145150155l柳柳CAGCTACTGCAlGATCAGAGAAAATGTCCTGGAAAATCTCCAGAAGGAGCGGGTATGTGAA540GinLeuLeuGinlieArgGluA幼ValLeuGluA幼Leuf'lnLysG]uArgVa3QysGlu165TACTAATyr*18217017518054618權(quán)利要求1、一種兔抗人IRGMa全長蛋白多克隆抗體的制備選用，其特征是針對IRGM蛋白的功能區(qū)，選用IRGMa來制備抗體；選擇GST和His基因融合蛋白的方法來制備目的蛋白片段。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備選用，其特征是表達(dá)GST和His基因融合蛋白，必須構(gòu)建含IRGMa全長基因546bp的GST和His基因融合載體；根據(jù)引物設(shè)計原則設(shè)計引物。3、本發(fā)明的兔抗人IRGMa全長蛋白多克隆抗體的提取方法1)從人的外周靜脈血抽提基因組DNA;2)引物設(shè)計及GST基因融合載體的選擇選擇了pCMV-myc，pGEX4T-2和Pet-28a(+)-His載體，并選用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xhol做為連接點；根據(jù)引物設(shè)計原則設(shè)計引物，做到同一條引物沒有回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)，5'端與3'端的4個堿基不互補，正反,引物序列不互補，Tm值相近(2A+2T+4G+4C),且在Genebankh找不到同源系列；共設(shè)計了2對引物，序列如下第-對用亍轉(zhuǎn)載pCMV-myc-IRGM和pGEX4T-2-IRGM載體''5，-AgCgAATTCCTATggAAgCCATgAATgTTg-3，，含EcoRI切點；IK:5，-gCgCTCgAgTTAgTATTCACATACCCgCTC-3，，含XhoI切點；第二對用于轉(zhuǎn)載pET-28a(+)-IRGM載體2F:5，-AgCgAATTCATggMgCCATgAATgTTg^3,,含EcoRI切點；2R:5，-gCgCTCgAgTTAgTATTCACATACCCgCTC-3，，含XhoI切點；3)制備目的基因片段并連接到inyc,GST和His基因融合載體上以正常人基l夭l組DNA為模板，分別采用上述2對引物和普通Taq酶擴(kuò)增IRGMa全長編碼序列；應(yīng)用TA克隆試劑盒將PCR產(chǎn)物分別連接到PCR2.1載體上，轉(zhuǎn)化并挑取陽忭TA克隆，搖菌，并采用質(zhì)粒抽提純化試劑盒抽提純化質(zhì)粒；EcoRI和XhoI雙酶切證實陽性TA克隆并采用T載體引物及ABIPRISMR3700DNA序列分析儀測序鑒定連接在PCR2.1載體上的目的基因片段序列的正確性；正確的TA克隆采用應(yīng)用EcoRI和Xhol雙酶切，回收目的基因片段并連接到經(jīng)過EcoRI和Xhol雙酶切回收的myc，GST和His基因融合載體pCMV-myc，pGEX4T-2，pET-28a(+)-His上并轉(zhuǎn)化；抽提質(zhì)粒，測序驗證；4)含目的基因片段的GST和His基因融合載體的表達(dá)鑒定分別挑取1粒轉(zhuǎn)化好的GST和His基因融合載體克隆，用5ml2YT培養(yǎng)基搖菌，離心收集細(xì)菌并制備小量的GST和His基因融合蛋白，采用PAGE-SDS膠電泳分離蛋白片段，考馬斯亮蘭染色，顯示GST和His基因融合蛋白片段大?。?)制備并純化GST基因融合蛋白及收集目的蛋白大量制備GST基因融合蛋白，過柱純化回收并定量，應(yīng)用Thrombin23'C酶切過夜，或GST基因融合蛋白先掛GST珠子，用Thrombin23'C酶切過夜，第二天過柱收集IRGMa全長目的蛋白*,6)大量制備His基因融合蛋白因IRGMa-His基因融合蛋白為不可溶的蛋白，將離心收集的細(xì)菌用1X蛋白上樣Buffer裂解后采用PAGE-SDS膠電泳分離蛋白片段，考馬斯亮蘭染色，顯示His基因融合蛋白目的片段，割膠凍存于-80'C冰箱備用；7)制備并純化含GST-tag和His-tag的兔抗人IRGMa全長蛋白多吏隆抗體:分別將由Thrombin酶切后回收的IRGMa蛋白和含His-IRGMa融合蛋白的PAGE膠與不完全弗氏佐劑勻漿后皮下多點注射免疫家兔，1個月后從家兔的耳緣靜脈取血lml，凝固后離心取血清，ELISA方法檢測IRGMa多克隆抗體的滴度，為1:2000:后每7-14天用不完全弗氏佐劑與蛋白勻漿后加強免疫1次，每次注射前均從耳緣靜脈取血lml，ELISA方法檢測抗體滴度；加強免疫2次后，ELISA方法檢測抗體的滴度達(dá)到了1:10000以上；采用免疫印跡方法驗證抗體的特異性；從家兔頸動脈取血，離心收集抗體血清分裝，采用ImmobilizedProteinAColumn純化抗體，檢測濃度并分裝，保存于-80'C。4、兔抗人IRGMa多克隆抗體的應(yīng)用l)免疫印跡用pCMV-myc-IRGMa轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞，將收集的細(xì)胞裂解液按不同濃度i:樣電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉做為封閉液，室溫封閉蛋白電轉(zhuǎn)膜60分種兔抗人IRGMa多克隆抗體濃度為5ug/ul做為一抗，1:500-1:10000稀釋，室溫?fù)u育2小時，或4度搖育過夜，1XTBST緩沖液搖洗3次，每次5分種'.辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG做為二抗，1:5000稀釋，室溫?fù)u育45分鐘，1XTBST緩沖液搖洗3次，每次5-15分種，辣根過氧化物底物顯色，壓片并沖片；2)ELISA:將純化的GST基因融合蛋白抗原按lng、2.5ng、5ng、10ng、100ng的量作一梯度，并將免疫前和免疫后血清按免疫前血清1:500、免疫后血清以1:500、1:1000、1:2000、1:5000、1:10000作一抗體梯度，免疫前血清作為對照，做ELISA;3)細(xì)胞免疫熒光染色將未轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞滴片于多聚賴氨酸處理過的蓋玻片上，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，10%山羊血清室溫封閉細(xì)胞60分鐘；兔抗人IRGMa抗體濃度為5ug/ul，1:100-1:200稀釋，室溫反應(yīng)2小時，1XPBS搖洗3次，每次5-10分鐘；帶綠色熒光的羊抗兔IgG作為二抗，1:1000-1:2000稀釋，室溫反應(yīng)30-60分鐘，二抗封閉結(jié)束前5分鐘，DAPI染核，1XPBS搖洗3次，每次5-IO分鐘；封片鏡下觀察4)免疫組化將多種人或小鼠的組織石蠟切片脫蠟并復(fù)水，39&H202室溫孵育10分鐘；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，再將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92^C-98'C之間并持續(xù)2分鐘進(jìn)行抗原熱修復(fù)；10X正常山羊血清PBS稀釋封閉，室溫孵育10分鐘；傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37'C孵育1-2小時或4'C過夜；PBS沖洗，5分鐘X3次；滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗1紐SA-PBS稀釋，37。C孵育30分鐘；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37'C或室溫孵育30分鉀；PBS沖洗，5分鐘X3次；滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈奪卵白素PBS稀釋，37。C孵育30分鐘；PBS沖洗，5分鐘X3次；顯色劑顯色DAB;自來水充分沖洗，復(fù)染，封片；5)組織免疫熒光將多種人或小鼠的組織石蠟切片脫蠟并復(fù)水，3細(xì)202室溫孵育5-IO分鐘；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，再將切片放入盛有枸槺酸鹽續(xù)2分鐘進(jìn)行抗原熱修復(fù)；10%正常山羊血清PBS稀釋封閉，室溫孵育10分鐘;傾去血清，勿洗，滴加；兔抗人IRGMa抗體濃度為5ug/ul，1:100-1:200稀釋，室溫反應(yīng)2小時，1XPBS，沖洗3次，每次10分鐘；帶綠色熒光的羊抗兔IgG作為二抗，1:100-1:200稀釋，室溫反應(yīng)45分鐘，二抗封閉結(jié)束前5分鐘，DAPI染核，1XPBS沖洗3次，每次5分鐘；封片鏡下觀察。5、IRGM基因中優(yōu)選出一段編碼序列，SEQUENCELISTING:AT(;Met1AACAsnGACAspAAGTCCCTGGCAAlaTTCPhe(;lnTAC'Tyr(;AA(;luArcUeTCTSer(;CCAlaCACHisGAGGluCMGinTACTyr('TA謹(jǐn)氺182(;ccAlaAA(;LysGGCGlyATGMetGAGGluAATAsnTCASerTTTl'h('MCAsnTTCPheATTTie(T(;CCTProTCASerTACTyrAGCSerGTCValCA(;GinAATAsn5ACTThr25GGGGly45CCTPro65AATAsn85CTGLeu105ATGMet125TGGTrp145ATClie165GTTValCTGLeuATGMetACTThrGTGValATGMetAATAsnACCThrAGAArgGAGGluAAGLysTCCSerGAGGluGTGValGAAGluCATHisAAGLysGAAGluAAALysATAlieACCThrCTGLeuTTGLeuATGMetGTCValCTALeuAATAsnGCCAlaGTGValTTCPheGTAGtaTGGTrpCAGGinATGMetGACAspGTCValTCASer10TCCSer30ATClie50AAALys70GACAsp90TTCPhe110CTTLeu130ATGMet150CTGLeu170GCAAlaAGGArgAGTSerGCTAlaCTGLeuMCAsnGCCAlaGACAspGAAGluGATGGGAACAspGlyAsnACACCAGTTThrProValGCCCTTCGAAlaLeuArgACCCMAGAThrGinArgCCTGGCACAProGlyThrCGGTATGACArgTyrAspAAAACCGCTLysThrAlaCTCAGCACALeuSerThrAATCTCCAGAsnLeuGinTTGLeu15AACAsn35AACAsn55TGTCys75GGGGly95TTCPhe115GAGGlu135GGTGly155AAGLys175CCAProATClieACAThrGCCAlaTCTSerATClieGACAspGCCAlaGAGGluGAGGluACTThrGGAGlyTCCSerGCCAlaATGMetATGMetCTCLeuCGGArgGTGValATGMetCATHisTATTyrACCThrGTTValGGAGlyCCAProGTAValATClieGCAAlaGAGGluTTCPheACAThrGCAAlaAAGLysGAAGluTGTCysTCTSer20GGGGly40GGTGly60TCTSer80ACCThr100TCTSer120MGLys140GTGVal160GAAGlu1806012018024030036042048054054全文摘要本發(fā)明公開了兔抗人IRGMa全長蛋白多克隆抗體的制備和應(yīng)用，屬中藥單體干預(yù)疾病的領(lǐng)域。本發(fā)明選定全長IRGMa蛋白來制備抗體，包括了所有的功能區(qū)。在優(yōu)選的基礎(chǔ)上還提出了其制備方法，并根據(jù)引物設(shè)計原則設(shè)計引物，構(gòu)建含IRGMa全長基因的His和GST融合蛋白來制備抗體。本發(fā)明所制備的抗體具有高度特異性和敏感性，有助于研究IRGM基因的表達(dá)譜分析及功能，并研究IRGM在MS發(fā)病過程中的具體作用，從而揭示MS的發(fā)病機(jī)制并尋找有效的基因免疫治療措施。因此，人參皂甙Rg1有一定的干預(yù)多發(fā)性硬化的作用。本發(fā)明的人參皂甙Rg1可以明顯降低多發(fā)性硬化的動物模型—EAE小鼠的發(fā)病率。文檔編號C12N15/12GK101337991SQ20081007069公開日2009年1月7日申請日期2008年3月3日優(yōu)先權(quán)日2008年3月3日發(fā)明者吳志英,檸王申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院;福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院