專利名稱：菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒及其檢測方法，它屬于生物技術(shù)領(lǐng)域， 專用于口岸檢驗檢疫和農(nóng)業(yè)植檢部門等對大豆上菜豆莢斑駁病毒的快速檢測。
背景技術(shù)：
菜豆莢斑駁病毒(BPMV)屬于豇豆花葉病毒科(a)歷oWn'flfee)、豇豆花葉病毒屬 (Co/w w'/YA9)成員，病毒基因組為二分體線形正義單鏈RNA， RNA-l長約6kb， RNA-2長約 3.6kb。 BPMV最早是1948年報道于美國査爾斯頓的菜豆Tendergreen品種上，現(xiàn)主要分布于 北美地區(qū)，在美國的阿肯色州、北卡羅來納州、維吉尼亞州、肯塔基州、密西西比州、路 易斯安那州、愛荷華州、伊利諾斯州和印地安那州等大豆種植地區(qū)分布廣泛。除美國外， 近年來加拿大、巴西、秘魯也己有BPMV在大豆上發(fā)生的報道。菜豆莢斑駁病毒侵染大豆引 起的菜豆莢斑駁病，不僅影響大豆的正常生長，引起產(chǎn)量損失，還使大豆種子質(zhì)量明顯下 降。據(jù)統(tǒng)計，BPMV侵染大豆造成的產(chǎn)量損失范圍為3y。一52y。，侵染時間越早，損失越嚴(yán)重， 若與大豆花葉病毒(6bj^e朋ifos&'c SMV)復(fù)合侵染，則大豆產(chǎn)量損失可高達(dá)85%，
給大豆生產(chǎn)帶來嚴(yán)重威脅。此外，BPMV侵染大豆后，還可導(dǎo)致大豆更易受到擬莖點霉屬 (州OT叩w's)真菌的危害，致使大豆種子品質(zhì)進(jìn)一步降低。BPMV作為危險性有害生物，已 被正式列入我國新增進(jìn)境植物檢疫性病毒名錄。迄今為止，我國尚未見BPMV發(fā)生的報道， 但隨著我國對外貿(mào)易和大豆加工業(yè)的的迅速發(fā)展，每年從國外(特別是美國)進(jìn)口大量大 豆，BPMV隨進(jìn)口大豆傳入的風(fēng)險越來越大。為避免BPMV傳入我國，給我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，特別 是大豆種植業(yè)帶來巨大危險，迫切需要加強(qiáng)對BPMV的口岸檢疫，因此提高該病毒檢測技術(shù) 具有極其重要的現(xiàn)實意義。
當(dāng)前，用于植物病毒檢測的方法主要包括生物學(xué)檢測、電鏡檢測、血清學(xué)檢測和分子 生物學(xué)檢測。通過接種指示植物可以檢測BPMV，該病毒接種大豆、菜豆Tendergreen后產(chǎn) 生斑駁癥狀，而接種菜豆Pinto和Bountiful品種后產(chǎn)生局部枯斑，但該方法檢測時間長， 并且結(jié)果易受人為因素和環(huán)境條件的影響。電鏡觀察由于需要昂貴的儀器和專門的操作人 員，并且材料前處理較為復(fù)雜，因此在BPMV的快速檢測上具有較大局限性。血清學(xué)檢測具 有所需設(shè)備簡單、操作簡便、成本低廉和反應(yīng)靈敏的優(yōu)點，目前已成為BPMV最常用的檢測 方法，但該方法的使用前提是需要有價格昂貴、特異性強(qiáng)的抗血清。與血清學(xué)檢測方法相比，基于核酸水平的RT-PCR分子檢測方法具有靈敏度更高、特異性更強(qiáng)、結(jié)果更可靠等優(yōu) 點，國內(nèi)外已有多篇關(guān)于利用RT-PCR方法檢測BPMV的研究報道，包括普通RT-PCR、免疫 捕獲巢式RT-PCR和半巢式RT-PCR等(Gu等，Phytopathology, 2002, 92 (4): 446 452; 于翠等，植物檢疫，2006， 20 (4): 201 204;聞偉剛等，植物病理學(xué)報，2006， 36 (4): 296 300)。但是，至今尚未見應(yīng)用TC-RT-PCR (試管捕捉RT-PCR)技術(shù)檢測BPMV的報道， 更未見專門用于檢測BPMV的TC-RT-PCR檢測試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒及其檢測方法，它可對口岸進(jìn) 境大豆種子及田間大豆上菜豆莢斑駁病毒進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、有效的檢疫鑒定。 本發(fā)明技術(shù)方案由以下兩部分構(gòu)成 (一) 一種菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒，其特征在于其組成為
(1) 1#液，含有病毒抽提試劑PBS緩沖液，濃度1X， pH7.4;
(2) 2*液，含有菜豆莢斑駁病毒上游引物5， -GGCAATTTTAGAGCAAGTGTTG-3，， 濃度10timol/L;
(3) 3*液，含有菜豆莢斑駁病毒下游引物5， -GCATTTGGCATATTCATGAGAAT-3，， 濃度10umol/L;
(4) 4*液，含有RT Buffer,濃度5X;
(5) 5*液，含有RNA酶抑制因子，濃度40U/PL;
(6) 6#液，含有反轉(zhuǎn)錄酶，濃度200U/iiL;
(7) 7*液，含有dNTPs，濃度10咖ol/L:
(8) 8"液，含有PCR Buffer,濃度10X;
(9) 9*液，含有Mgcl2，濃度25mmol/L;
(10) l(f液，含有Taq DNA聚合酶，濃度5U/uL;
(11) ir液，含有菜豆莢斑駁病毒陽性對照；
(12) 12#液，含有菜豆莢斑駁病毒陰性對照；
(13) 13#液，含有PBST緩沖液，濃度1X;
(14) 14*液，含有RNase-free ddH20。
上述1#液-14#液分別為1管，其中r液的含量為10mL， 2-液的含量為100nL， 3*液的含量 為100yL， 4"液的含量為150nL， 5^液的含量為25uL， 6#液的含量為25 ix L, 7#液的含量為 100uL， 8"液的含量為100uL, 9"液的含量為100uL， l(f液的含量為lOii L， 11#液的含量為 2mL， l"液的含量為2mL， lY液的含量為10mL, 14-液的含量為10mU(二)方案(一)所述菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于包括如 下步驟
(1) 病毒提取液的制備
① 如果待測樣品為大豆葉片，則稱取一定量葉片組織，按樣品與抽提緩沖液的重 量體積比為l: 10 (克/毫升)的比例加入病毒抽提試劑r液，充分研磨后，4'C下10000g離 心10min,取上清液作為病毒提取液；
② 或者如果待測樣品為大豆種子，則先將大豆種子用水浸泡2h后，剝?nèi)∑浞N皮作 為樣品，再按樣品與抽提緩沖液的重量體積比為l: 10 (克/毫升)的比例加入病毒抽提試 劑1#液，充分研磨后，4'C下10000g離心10min，取上清液作為病毒提取液；
(2) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取步驟(1)制備的病毒提取液50uL包被PCR管，并以50wL 11#液 和50uL 1Y液分別作為陽性對照和陰性對照包被PCR管，每管37'C下孵育3h、 13#液洗管3次 和14#液洗管2次后，接著進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序為按每管加luL3-液和9uL14' 液，7(TC水浴10min后立即置于冰上冷卻3min，再按每管加5uL 4#液、luL 5#液、1 u L 6# 液、2uL 7*液，經(jīng)42。C lh， 70°C 10min合成cDNA;
(3) PCR反應(yīng)以病毒提取液、lr液及12"液分別通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的各5yL cDNA 為模板，按每管加2. 5P L 8*液、2uL9"液、0.5uL7-液、2uL2'液、2uL3"液、10.75uL 14，和0.25uL l(f液，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)；PCR反應(yīng)程序為94。C變性3min后進(jìn)入以下循環(huán) 94。C變性30s、 52匸退火45s、 72。C延伸lmin，共35個循環(huán)，最后一輪循環(huán)結(jié)束后72。C延伸 10miru
(4) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測PCR反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物10iiL，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳 進(jìn)行檢測，溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄實驗結(jié)果。
含有菜豆莢斑駁病毒樣品的電泳檢測結(jié)果為在542bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶。 本發(fā)明根據(jù)菜豆莢斑駁病毒基因的保守區(qū)域設(shè)計特異性引物，利用TC-RT-PCR (試管捕
捉RT-PCR)技術(shù)對菜豆莢斑駁病毒進(jìn)行檢測，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的菜豆莢斑
駁病毒的檢測試劑盒及其檢測方法具有如下優(yōu)點
1) 本發(fā)明應(yīng)用TC-RT-PCR技術(shù)，省去了常規(guī)RT-PCR中繁瑣的RNA提取步驟，可直接對 病毒提取液進(jìn)行RT-PCR，不僅簡化操作程序、降低操作要求，而且避免了使用有機(jī)溶劑， 減少環(huán)境污染；與IC-RT-PCR (免疫捕獲RT-PCR)相比，本發(fā)明不需要價格昂貴的抗血清， 而是用PCR管直接去吸附病毒，大大節(jié)約了檢測成本。
2) 本發(fā)明提供的檢測方法檢測菜豆莢斑駁病毒，樣品用量少、特異性強(qiáng)、靈敏度高、 準(zhǔn)確度好、操作簡便、結(jié)果穩(wěn)定，不僅能檢測單粒大豆種子，同時適于大量樣品的快速檢測。
3)本發(fā)明設(shè)計的檢測試劑盒制作方法簡單、使用經(jīng)濟(jì)，具有重要實際應(yīng)用價值。


圖l為帶病大豆葉片的檢測結(jié)果。其中M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(100bp); 1:檢測樣品(帶 病大豆葉片)；2: BPMV陽性對照；3: BPMV陰性對照；
圖2為帶病大豆種子的檢測結(jié)果。其中M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(100bp); 1:檢測樣品(帶 病大豆種子)；2: BPMV陽性對照；3: BPMV陰性對照。
圖3為帶病大豆幼苗的檢測結(jié)果。其中M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(100bp); 1:檢測樣品I (帶 病大豆幼苗)；2:檢測樣品II (帶病大豆幼苗)；3:檢測樣品III (帶病大豆幼苗)；4: BPMV 陽性對照；5: BPMV陰性對照。
具體實施例方式
以下通過具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。 實施例1:菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒
一種菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒，其特征在于其組成為
(1) r液，含有病毒抽提試劑PBS緩沖液，濃度1X, pH7.4;
(2) 28液，含有菜豆莢斑駁病毒上游引物5， -GGCAATTTTAGAGCAAGTGTTG-3，， 濃度10umol/L;
(3) 3*液，含有菜豆莢斑駁病毒下游引物5' -GCATTTGGCATATTCATGAGAAT-3，， 濃度10pmol/L;
(4) 4*液，含有RT Buffer,濃度5X;
(5) 5"液，含有RNA酶抑制因子，濃度40U/uL;
(6) 6*液，含有反轉(zhuǎn)錄酶，濃度200U/uL;
(7) 7*液，含有dNTPs，濃度10咖ol/L;
(8) 8*液，含有PCR Buffer,濃度10X;
(9) 9*液，含有Mgcl"濃度25ranol/L;
(10) 10#液，含有Taq DNA聚合酶，濃度5U/uL;
(11) 11#液，含有菜豆莢斑駁病毒陽性對照；
(12) 12#液，含有菜豆莢斑駁病毒陰性對照；
(13) 13#液，含有PBST緩沖液，濃度1X;
(14) 14*液，含有RNase-free ddH20。
所述1"液_14#液分別為1管，其中f液的含量為10mL， 2"液的含量為100uL， 3'液的含量為100uL， ^液的含量為150uL， 5，的含量為25uL， 6"液的含量為25uL， 7"液的含量為 100 uL， 8'液的含量為10(^L，薩液的含量為lOOiiL, 10#液的含量為10 ix L, ll'液的含量為 2mL， 12，的含量為2mL， 13'液的含量為10mL， K液的含量為10mL。 實施例2對菜豆莢斑駁病毒的檢測方法
上述菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒用于檢測菜豆莢斑駁病毒(BPMV)的檢測方法，包
括
1) 稱取0.05g大豆病葉，按樣品與抽提緩沖液的重量體積比為1: 10 (克/毫升)加 入病毒抽提試劑1"液，充分研磨后，4。C下10000g離心10min,取上清液作為病毒提取液；
2) 取50uL大豆病葉上清液(病毒提取液)包被PCR管，并以50uLll、液、50uL12# 液分別作為陽性對照和陰性對照包被PCR管。每管37'C下孵育3h、 13#液洗管3次和14#液 洗管2次后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序為按每管加luL 3"液和9uL 14#液，70°C 水浴10min后立即置于冰上冷卻3min，再按每管加5 u L 4*液、1 u L 5*液、luL6"液、2wL 7#液。經(jīng)42。C lh， 70°C 10min合成cDNA;
3) 取以病毒提取液、lr液及12、液分別通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的各5!iL cDNA為模板， 按每管加2. 5uL 8#液、2uL 9#液、0. 5uL 7"液、2uL 2'液、2uL 3#液、10. 75pL 14#液 和0. 25u L 10#液，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序為94。C變性3min后進(jìn)入以下循環(huán) 94X:變性30s、 52。C退火45s、 72'C延伸lmin，共35個循環(huán)，最后一輪循環(huán)結(jié)束后72。C延 伸10min;
4) PCR反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物10"L，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，溴化乙錠染色 后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄實驗結(jié)果。
含有菜豆莢斑駁病毒(BPMV)樣品的電泳檢測結(jié)果為在542bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶 (圖1)，否則無。 實施例3 口岸截獲美國進(jìn)境帶病大豆種子的檢測
與實施例2區(qū)別在于檢測對象是大豆的種子。先將大豆種子用水浸泡2h后，剝?nèi)∑浞N皮
作為樣品，再按樣品與抽提緩沖液的重量體積比為l: 10 (克/毫升)加入病毒抽提試劑1#
液，充分研磨后，4'C下10000g離心10min，取上清；其余步驟同實施例2，含有菜豆莢斑駁 病毒(BPMV)樣品的電泳檢測結(jié)果為在542bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶(圖2)，否則無。 實施例4進(jìn)境美國大豆幼苗的檢測
在進(jìn)境大豆隔離種植基地，隨機(jī)選取具有斑駁癥狀的大豆幼苗，每5株幼苗的葉片作為 一份樣品，共3份。其余步驟同實施例2，含有菜豆莢斑駁病毒(BPMV)樣品的電泳檢測結(jié) 果為在542bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶(圖3),否則無。序列表.SEQ.txt
2008-5-30
SEQUENCE LISTING
<110>
福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
<120>
菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒及其檢測方法
<130> None
<160> 2
<170> P3tentln wersion 3-3
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<4, 2
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權(quán)利要求
1. 一種菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒，其特征在于其組成為(1)1#液，含有病毒抽提試劑PBS緩沖液，濃度1×，pH7.4；(2)2#液，含有菜豆莢斑駁病毒上游引物5’-GGCAATTTTAGAGCAAGTGTTG-3’，濃度10μmol/L；(3)3#液，含有菜豆莢斑駁病毒下游引物5’-GCATTTGGCATATTCATGAGAAT-3’，濃度10μmol/L；(4)4#液，含有RT Buffer，濃度5×；(5)5#液，含有RNA酶抑制因子，濃度40U/μL；(6)6#液，含有反轉(zhuǎn)錄酶，濃度200U/μ L；(7)7#液，含有dNTPs，濃度10mmol/L；(8)8#液，含有PCR Buffer，濃度10×；(9)9#液，含有Mgcl2，濃度25mmol/L；(10)10#液，含有Taq DNA聚合酶，濃度5U/μL；(11)11#液，含有菜豆莢斑駁病毒陽性對照；(12)12#液，含有菜豆莢斑駁病毒陰性對照；(13)13#液，含有PBST緩沖液，濃度1×；(14)14#液，含有RNase-free ddH2O。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒，其特征在于所述r液-i4"液 分別為1管，其中r液的含量為10mL， 2"液的含量為100uL, 3#液的含量為100 P L， 4#液的含 量為150uL， 5"液的含量為25uL， 6"液的含量為25uL，"液的含量為IOO u L， 8#液的含量 為100uL， 9'液的含量為100nL， 1(^液的含量為10uL， lr液的含量為2mL， 12#液的含量為 2mL， 13"液的含量為10mL， K液的含量為10mL。
3、 權(quán)利要求l所述菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于包括如下步驟(1)病毒提取液的制備① 如果待測樣品為大豆葉片，則稱取一定量葉片組織，按樣品與抽提緩沖液的重量體積比為l: 10 (克/毫升)的比例加入病毒抽提試劑r液，充分研磨后，4-C下10000g離 心10min，取上清液作為病毒提取液；② 或者如果待測樣品為大豆種子，則先將大豆種子用水浸泡2h后，剝?nèi)∑浞N皮作為樣品，再按樣品與抽提緩沖液的重量體積比為l: 10 (克/毫升)的比例加入病毒抽提試 劑1"液，充分研磨后，4'C下10000g離心10min,取上清液作為病毒提取液；(2) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取步驟(1)制備的病毒提取液50uL包被PCR管，并以50wL 11#液 和50uL lf液分別作為陽性對照和陰性對照包被PCR管，每管37。C下孵育3h、 13#液洗管3次 和14"液洗管2次后，接著進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序為按每管加lPL3"液和9uL14" 液，70。C水浴10min后立即置于冰上冷卻3min,再按每管加5uL 4"液、luL 5'液、1 u L 6' 液、2uL 78液，經(jīng)42。C lh， 70°C 10min合成cDNA;(3) PCR反應(yīng)以病毒提取液、l"液及12"液分別通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的各5uL cDNA 為模板，按每管加2.5uL亂2uL9"液、0.5uL7"液、2uL2'液、2"3#液、10.75" 14"液和0.25uL IO"液，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)；PCR反應(yīng)程序為94'C變性3min后進(jìn)入以下循環(huán) 94'C變性30s、 52'C退火45s、 72'C延伸lmin,共35個循環(huán)，最后一輪循環(huán)結(jié)束后72i:延伸 10mins(4) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測PCR反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物10uL，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄實驗結(jié)果。
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于含有 菜豆莢斑駁病毒樣品的電泳檢測結(jié)果為在542bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶。
全文摘要
本發(fā)明涉及菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒及其檢測方法，它專用于菜豆莢斑駁病毒的檢測。該試劑盒包括引物、病毒抽提試劑、RT Buffer、RNA酶抑制因子、反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、PCR Buffer、Mgcl₂、Taq DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照、PBST緩沖液和RNase-free ddH₂O。本發(fā)明根據(jù)菜豆莢斑駁病毒基因的保守區(qū)域設(shè)計特異性引物，利用TC-RT-PCR技術(shù)對菜豆莢斑駁病毒進(jìn)行檢測，無需繁瑣的RNA提取步驟，直接對病毒提取液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR，不僅操作簡便、結(jié)果穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、靈敏度高，而且檢測成本相對較低，因此具有較高的實用價值。
文檔編號C12Q1/68GK101285104SQ20081007115
公開日2008年10月15日 申請日期2008年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月30日
發(fā)明者沈建國, 王念武, 赟 虞, 郭瓊霞, 黃可輝 申請人:福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心