專利名稱：：一種改進(jìn)的拮抗細(xì)菌生物測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明
技術(shù)領(lǐng)域：
屬于農(nóng)學(xué)門類，植物保護(hù)一級學(xué)科下設(shè)的植物病理學(xué)二級學(xué)科，更具體涉及一種生物農(nóng)藥研制和開發(fā)中所必須的拮抗細(xì)菌生物活性測定方法。
背景技術(shù)：
：1、生物防治在可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展中發(fā)揮著越來越重要的作用。生物防治的一個重要內(nèi)容就是利用微生物防治病害，有益微生物中用于研究防治植物真菌病害較多的是細(xì)菌，如芽孢桿菌屬(Bacillussp)和假單孢桿菌屬(Pseudomonassp)的一些種，人們通常稱之為拮抗細(xì)菌或生防細(xì)菌，眾多研究證明一些細(xì)菌對植物病原真菌生長具有較強的抑制作用，與病菌對峙培養(yǎng)，能表現(xiàn)出明顯的抑菌帶，其代謝物質(zhì)能引起病菌菌絲消解和細(xì)胞內(nèi)溶，能抑制病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)，在病害防治中顯示出較好的生防效果。2、在拮抗細(xì)菌的篩選過程中，拮抗細(xì)菌對病原菌的生物測定方法具有至關(guān)重要的作用，它是生物農(nóng)藥研制和開發(fā)必不可少的一個重要環(huán)節(jié)。目前采用的生物測定方法通常有拮抗菌與病菌之間平板對峙培養(yǎng)法；菌體直接作用測定法、三明治法；拮抗細(xì)菌無菌發(fā)酵液(細(xì)菌過濾器過濾、高溫滅菌)抗菌能力測定法，其中又包括發(fā)酵液混于培養(yǎng)基中抑制病菌菌落生長測定法、發(fā)酵液抑制孢子萌發(fā)測定法、發(fā)酵液管碟法、發(fā)酵液濾紙片法等。我們經(jīng)過多年的實驗研究發(fā)現(xiàn)，這些方法在使用過程中存在著明顯的局限性。(1)平板對峙法，拮抗細(xì)菌與病菌之間平板對峙培養(yǎng)法，通常在兩者之間會形成一明顯的抑菌帶(約3mm18mm)，此法操作比較簡便，適合于拮抗細(xì)菌的初篩，但拮抗細(xì)菌形成的抑菌帶大小不僅與拮抗細(xì)菌自身分泌的代謝產(chǎn)物抑菌活性有關(guān)，還與菌株代謝產(chǎn)物在培養(yǎng)基上擴散能力有關(guān)，人們采用平板對峙法通常以抑菌帶寬度值作為評價拮抗菌株抗菌能力的指標(biāo),而保留抑菌帶寬度值大的菌株，淘汰抑菌帶寬度值小的菌株。我們由此會失去一個因分泌的代謝產(chǎn)物在培養(yǎng)基擴散能力差，而代謝產(chǎn)物抑菌活性強的好菌株?，F(xiàn)實中生物農(nóng)藥的研制常常是利用菌株代謝產(chǎn)物的抗菌特性。因此采用此法，并不能真正反應(yīng)出拮抗細(xì)菌潛在的抗菌能力。再者用此法試驗穩(wěn)定性、重復(fù)性差，同一拮抗細(xì)菌點接后，菌落大小并不完全一樣，抑菌帶寬度值因而也會出現(xiàn)差異。(2)菌體直接作用測定法，通常是在平板上涂抹拮抗細(xì)菌菌液(菌苔稀釋液或含菌體的發(fā)酵液)，或利用拮抗細(xì)菌菌液與培養(yǎng)基混合制平板，然后在含拮抗菌的平板上接入病菌塊，測定病菌菌落生長直徑，采用此法，細(xì)菌可快速占領(lǐng)平板培養(yǎng)空間，對病菌生長影響極大，生測效果不明顯，無法真實反應(yīng)出細(xì)菌代謝產(chǎn)物的抗菌活性。(3)三明治法，在兩層培養(yǎng)基中間為一層培養(yǎng)基與拮抗菌菌液(含活菌體)的混合體。然后在上層培養(yǎng)基中接入病菌塊，但此法在制作上層培養(yǎng)基的過程中容易使中間層培養(yǎng)基的菌體攜入，從而影響拮抗細(xì)菌對病菌菌落的生物活性測定。而且在培養(yǎng)過程中拮抗細(xì)菌是在中層培養(yǎng)基缺乏氧氣的條件下生長，勢必影響細(xì)菌代謝產(chǎn)物的正常分泌。(4)拮抗細(xì)菌無菌發(fā)酵液抗菌能力測定法，包括發(fā)酵液混于培養(yǎng)基中抑制病菌菌落生長、發(fā)酵液抑制病菌孢子萌發(fā)，發(fā)酵液濾紙片法、發(fā)酵液管碟法等，通常用此法評價拮抗細(xì)菌發(fā)酵液的抗菌活性，但是在制備拮抗細(xì)菌無菌發(fā)酵液過程中常采用細(xì)菌過濾器過濾獲得無菌濾液，在操作上不方便，易造成污染，且費用較高，而采用高溫滅菌法制備的無菌濾液可能導(dǎo)致發(fā)酵液中部份不耐高溫的代謝物失活，影響拮抗菌發(fā)酵液真實抗菌能力的發(fā)揮。此外，采用拮抗細(xì)菌無菌發(fā)酵液抗菌能力測定法還受于拮抗細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)液培養(yǎng)過程中、細(xì)菌培養(yǎng)液培養(yǎng)無菌過濾和檢測等諸多因素的制約，達(dá)不到快速大量測定的目的。發(fā)酵液濾紙片法，作用效果不明顯，濾紙片風(fēng)干時易污染。含發(fā)酵液培養(yǎng)基法，由于添加不同濃度的發(fā)酵液于培養(yǎng)基中，一定程度上會影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成份和凝固性，從而影響菌的正常生長。發(fā)酵液管碟法，加樣量少，受管底和管壁的作用，一定程度上會影響細(xì)菌發(fā)酵液的擴散方向和擴散量，生測時形成的抑菌斑不規(guī)則，從而影響試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，操作上復(fù)雜、耗時耗財。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的提供一種改進(jìn)的拮抗細(xì)菌生物測定方法，解決和克服拮抗細(xì)菌生物測定其它方法中的不足，如操作上復(fù)雜、耗時耗財，試驗真實性、穩(wěn)定性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性差等問題，根據(jù)拮抗細(xì)菌及其代謝分泌產(chǎn)物等特點，而提供一種操作簡便、快速、材料便宜、來源方便、實驗周期短、試驗真實性、穩(wěn)定性、重復(fù)性好的拮抗細(xì)菌生物測定新方^^——雙層培養(yǎng)基濾紙夾心法，可達(dá)到真實合理評價拮抗細(xì)菌生防效果的目的，本方法適用于多種拮抗細(xì)菌抗菌譜研究，可對多種病原菌(如枯萎病菌、稻瘟病菌、炭疽病菌、玉米紋枯病菌、花生青枯病菌、柑桔潰瘍病菌等)進(jìn)行生物活性測定，對研究拮抗細(xì)菌代謝分泌產(chǎn)物生防穩(wěn)定性(常溫存放、紫外線照射)也具有很好的效果。本發(fā)明的新方法對合理評價拮抗細(xì)畬的生防效果、篩選有應(yīng)用價值生防菌株具有重要的作用。本發(fā)明的改進(jìn)的拮抗細(xì)菌生物測定方法，采用雙層培養(yǎng)基濾紙夾心法，將一定濃度細(xì)菌培養(yǎng)液或菌苔稀釋液均勻涂抹于上層培養(yǎng)基中，拮抗細(xì)菌在上層培養(yǎng)基生長產(chǎn)生的代謝分泌物會通過濾紙層均勻擴散到下層培養(yǎng)基中，移去濾紙及其攜帶的上層培養(yǎng)基，下層培養(yǎng)基即為含拮抗細(xì)菌代謝分泌產(chǎn)物的平板，易于進(jìn)行對多種病原真菌菌絲生長、孢子萌發(fā)及細(xì)菌生長的生物測定。本發(fā)明的顯著優(yōu)點是本發(fā)明利用拮抗細(xì)菌代謝分泌產(chǎn)物在培養(yǎng)基的擴散性(拮抗細(xì)菌代謝分泌產(chǎn)物在含瓊脂培養(yǎng)基的擴散距離通常為3~18mm)、利用廉價濾紙良好的滲透性、利用細(xì)菌菌體在培養(yǎng)基生長不透性等原理，進(jìn)行拮抗細(xì)菌對植物病原真菌生物測定方法改進(jìn)和創(chuàng)新。該方法測定周期約為7天，測定過程中利用拮抗細(xì)菌代謝分泌產(chǎn)物在培養(yǎng)基的自然均勻擴散性，病菌菌落在含拮抗細(xì)菌代謝分泌產(chǎn)物的培養(yǎng)基上生長規(guī)則，避免了因菌株代謝產(chǎn)物在培養(yǎng)基上擴散能力差異、菌株發(fā)酵液培養(yǎng)和過濾等問題而帶來試驗結(jié)果的誤差。采用雙層培養(yǎng)基濾紙夾心法在檢測過程中耗費的試材量少，由此法獲得的拮抗菌株生物測定結(jié)果同利用細(xì)菌過濾器獲得的拮抗細(xì)菌無菌發(fā)酵濾液(以20%~50%劑量添加至病菌培養(yǎng)基中)進(jìn)行生物測定獲得的評價結(jié)果較為吻合。實施雙層培養(yǎng)基濾紙夾心法能真實反應(yīng)菌株代謝產(chǎn)物抗菌能力，具有試驗穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、材料便宜、來源方便、操作簡便等優(yōu)點，適用于多種拮抗細(xì)菌抗菌譜研究，可對多種病原菌(如枯萎病菌、稻瘟病菌、炭疽病菌、玉米紋枯病菌、花生青枯病菌、柑桔潰瘍病菌等)進(jìn)行生物活性測定，對研究拮抗細(xì)菌代謝分泌產(chǎn)物生防穩(wěn)定性(常溫存放、紫外線照射)也具有很好的效果。本發(fā)明的新方法對合理評價拮抗細(xì)菌的生防效果、篩選有應(yīng)用價值生防菌株具有重要的作用。并且本發(fā)明的方法可同時完成多個拮抗細(xì)菌的抗菌譜測定，具有新穎性、實用性和創(chuàng)造性，作為一種新的拮抗細(xì)菌生物測定方法，具有潛在的應(yīng)用價值。圖1是本發(fā)明的應(yīng)用技術(shù)路線流程圖。圖2是本發(fā)明的技術(shù)原理圖。圖3是本發(fā)明的幾種拮抗細(xì)菌對香蕉枯萎病菌離體抑菌活性生物測定過程圖，其中A部分是注無菌濾紙模制作用直徑為12cm的濾紙(如高速101型)平鋪于直徑為切8.9cm玻璃培養(yǎng)皿中，超出寬度約1.5cm的濾紙邊緣使之皺褶，并置于平皿中高壓滅菌，無菌濾紙平板模成形備用；B部分是注在下層培養(yǎng)基上移入濾紙模在直徑為8.9cm玻璃培養(yǎng)皿中加入10ml的下層培養(yǎng)基，厚度為3~4mm,凝固后，在下層培養(yǎng)基上方移入無菌濾紙模，敏褶處貼于培養(yǎng)皿皿壁，平板處浸濕并緊貼于培養(yǎng)基；C部分是注在濾紙模上制上層培養(yǎng)基在無菌濾紙模上加入10ml的細(xì)菌培養(yǎng)基為上層培養(yǎng)基，凝固后待用，上層培養(yǎng)基通過濾紙模與下層培養(yǎng)基分隔；D部分是注培養(yǎng)待測拮抗細(xì)菌吸取細(xì)菌液(一定濃度含細(xì)菌菌體培養(yǎng)液)均勻涂抹于上層平板中，于適宜細(xì)菌生長的條件下培養(yǎng)(如28'C，黑暗)，培養(yǎng)48h后，在下層培養(yǎng)基上標(biāo)記上層培養(yǎng)基上均勻長滿拮抗細(xì)菌的范圍；E部分是注下層培養(yǎng)基培養(yǎng)香蕉枯萎病菌拮抗細(xì)菌培養(yǎng)48h后，細(xì)菌分泌的代謝產(chǎn)物會通過濾紙層向下層培養(yǎng)基均勻擴散，移出含上層培養(yǎng)基的濾紙，下層培養(yǎng)基作為對目標(biāo)病菌的生物測定試材，在含細(xì)菌分泌的代謝產(chǎn)物的下層培養(yǎng)基中央接入待測病菌，于病菌適宜生長的條件下培養(yǎng)。病菌生長適宜天數(shù)后，在試驗下層培養(yǎng)基中測量病原真菌菌落直徑。真實評價拮抗細(xì)菌對病菌的生測效果，正確篩選出抑菌效果好的拮抗菌株。圖4是示枯草芽孢桿菌、菌株l、2、3、4、5與香蕉枯萎病菌對峙培養(yǎng)(7d)圖。圖5是香蕉枯萎病菌在含33。/。菌株1、2、3、4、5培養(yǎng)濾液的PDA平板中生長情況(7d)圖。圖6是香蕉枯萎病菌在含菌株1、2、3、4、5代謝產(chǎn)物的PDA平板中生長情況(7d)圖。具體實施例方式(1)制作適合病原真菌生長的下層培養(yǎng)基和適合拮抗細(xì)菌生長的上層培養(yǎng)基。(2)制作無菌濾紙平板模用直徑為12cm的濾紙(如高速101型)平鋪于直徑為8.9cm玻璃培養(yǎng)皿中，超出寬度約1.5cm的濾紙邊緣使之皺褶，并置于平皿中高壓滅菌，無菌濾紙平板模成形備用。(3)制作下層培養(yǎng)基:在直徑為8.9cm玻璃培養(yǎng)皿中加入10ml的下層培養(yǎng)基，厚度為3~4mm，凝固后待用。(4)移入無菌濾紙模在下層培養(yǎng)基上方移入無菌濾紙模，皺褶處貼于培養(yǎng)皿皿壁，平板處浸濕并緊貼于培養(yǎng)基。(5)制作上層培養(yǎng)基在無菌濾紙模上加入10ml的細(xì)菌培養(yǎng)基為上層培養(yǎng)基，凝固后待用，上層培養(yǎng)基通過濾紙模與下層培養(yǎng)基分隔。(6)培養(yǎng)待測拮抗細(xì)菌吸取10(^1細(xì)菌液(一定濃度含細(xì)菌菌體培養(yǎng)液)均勻涂抹于上層平板中，于適宜細(xì)菌生長的條件下培養(yǎng)(如28'C,黑暗)，培養(yǎng)48h后，在下層培養(yǎng)基上標(biāo)記上層培養(yǎng)基上均勻長滿拮抗細(xì)菌的范圍。(7)移出無菌濾紙模拮抗細(xì)菌培養(yǎng)48'h后，細(xì)菌分泌的代謝產(chǎn)物會通過濾紙層向下層培養(yǎng)基均勻擴散，移出含上層培養(yǎng)基的濾紙，下層培養(yǎng)基作為對目標(biāo)病菌的生物測定試材。(8)培養(yǎng)目標(biāo)病原真菌在含細(xì)菌分泌的代謝產(chǎn)物的下層培養(yǎng)基中央接入待測病菌，于病菌適宜生長的條件下培養(yǎng)。(9)試驗結(jié)果測量病菌生長適宜天數(shù)后，在試驗下層培養(yǎng)基中測量病原真菌菌落直徑。以不接種拮抗菌的處理為空白對照，計算病原菌生長抑制率。(10)篩選拮抗細(xì)菌通過實驗結(jié)果分析比較拮抗細(xì)菌的抗菌能力，完成拮抗細(xì)菌生物活性測定，真實評價拮抗細(xì)菌對病菌的生測效果，正確篩選出抑菌效果好的拮抗菌株。請參閱圖l、圖2、圖3所示，本發(fā)明實施例1之方法依序包括獲得和培養(yǎng)待測拮抗細(xì)菌、獲得和培養(yǎng)目標(biāo)病原真菌、制作無菌濾紙平板模、制作下層PDA培養(yǎng)基、移入無菌濾紙模、制作上層NA培養(yǎng)基、培養(yǎng)拮抗細(xì)菌、移出無菌濾紙模、培養(yǎng)目標(biāo)病原真菌、試驗結(jié)果測量、篩選拮抗細(xì)菌，其中獲得和培養(yǎng)待測拮抗細(xì)菌、獲得和培養(yǎng)目標(biāo)病原真菌屬于常規(guī)的植物病理研究法，在此不再描述，其特征在于(1)制作適合病原真菌生長培養(yǎng)基(以常規(guī)的PDA培養(yǎng)基為例)和適合拮抗細(xì)菌生長培養(yǎng)基(以常規(guī)的NA培養(yǎng)基為例)。'(2)制作無菌濾紙平板模用直徑為12cm的濾紙(如高速101型)平鋪于直徑為8.9cm玻璃培養(yǎng)皿中，超出寬度約1.5cm的濾紙邊緣使之皺褶，并置于平皿中高壓滅菌，無菌、濾紙平板模成形備用。(3)制作下層PDA培養(yǎng)基，在直徑為8.9cm玻璃培養(yǎng)皿中加入10ml的PDA培養(yǎng)基為下層培養(yǎng)基，厚度為3一mm，凝固后待用。(4)移入無菌濾紙模在下層培養(yǎng)基上方移入無菌濾紙模，鈹褶處貼于培養(yǎng)皿皿壁，平板浸濕并緊貼于培養(yǎng)基。(5)制作上層NA培養(yǎng)基在無菌濾紙模上加入10ml的NA培養(yǎng)基為上層培養(yǎng)基，凝固后待用，NA培養(yǎng)基通過濾紙模與PDA培養(yǎng)基分隔。(6)培養(yǎng)待測拮抗細(xì)菌吸取100nl細(xì)菌液(一定濃度含細(xì)菌菌體的培養(yǎng)液)均勻涂抹于上層平板中，于適宜細(xì)菌生長的條件下培養(yǎng)(如28'C，黑暗)，培養(yǎng)48h后，在下層培養(yǎng)基上標(biāo)記上層培養(yǎng)基上均勻長滿拮抗細(xì)菌的范圍。(7)移出無菌濾紙模拮抗細(xì)菌培養(yǎng)48h后，細(xì)菌分泌的代謝產(chǎn)物會通過濾紙層向下層PDA培養(yǎng)基均勻擴散，移出的含上層培養(yǎng)基的濾紙模，保留含細(xì)菌分泌的代謝產(chǎn)物的下層培養(yǎng)基作為生物測定試材。(8)培養(yǎng)目標(biāo)病原真菌含細(xì)菌分泌的代謝產(chǎn)物的下層PDA培養(yǎng)基中央接入菌齡一致的待測病菌菌餅(直徑為5mm)，于適宜病菌生長的條件下培養(yǎng)(如28'C，黑暗)。(9)實驗結(jié)果測量病菌生長47d后測量菌落直徑，以不接種拮抗菌的處理為空白對照，設(shè)多個重復(fù)，計算病菌菌絲生長抑制率。(10)篩選拮抗細(xì)菌通過實驗結(jié)果分析比較拮抗細(xì)菌的抗菌能力，完成拮抗細(xì)菌生物測定，真實評價拮抗細(xì)菌對病菌的生測效果，正確篩選出抑菌效果好的拮抗菌株。以下是本發(fā)明的具體實施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是本發(fā)明不僅限于此。實施例拮抗細(xì)菌對香蕉枯蔞病菌抑菌活性比較一、材料與方法1、拮抗細(xì)菌平板對峙對病菌的拮抗作用采用PDA平板對峙生長法，點接待測的活化細(xì)菌(具有初步抑菌活性，來源于土壤)5株，并在相距2cm處接入直徑為0.5cm香蕉枯萎病菌(4號小種)菌絲塊，28'C黑暗對峙培養(yǎng)4d和7d后，測量各拮抗細(xì)菌的抑菌帶寬度，比較各菌株的抑菌活性及其穩(wěn)定性，每處理4個重復(fù)。2、拮抗細(xì)菌發(fā)酵液對病菌菌絲生長的抑制作用用無菌水洗下待測拮抗菌菌落，混勻后吸取100pl細(xì)菌液轉(zhuǎn)接于盛有150mlNB培養(yǎng)液的250ml三角瓶中培養(yǎng)3d后(28'C,140rpm)，取細(xì)菌發(fā)酵液無菌過濾后按l:2比例與PDA培養(yǎng)基(45"C)混勻后倒入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中制成平板。冷凝后于平板中央接入直徑0.5cm病菌塊，置28t黑暗培養(yǎng)。以加相同量的NB液體培養(yǎng)基為對照，每處理4個重復(fù)。分別于培養(yǎng)4d、7d后用十字交叉法測量病菌菌落直徑，計算平均直徑，比較各菌株的抑菌活性。3、拮抗細(xì)菌培養(yǎng)代謝產(chǎn)物對病菌菌絲生長的抑制作用采用雙層培養(yǎng)基濾紙夾心法，先于培養(yǎng)皿中倒入10mlPDA培養(yǎng)基為下層培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷凝后。將預(yù)先準(zhǔn)備好的直徑12cm無菌濾紙(高速101型)輕輕緊貼于PDA平板上，再向濾紙上倒入10mlPDA培養(yǎng)基為上層培養(yǎng)基。吸取100jil細(xì)菌液均勻涂抹于上層平板中，281C黑暗下培養(yǎng)48h后，撕去含拮抗細(xì)菌的上層培養(yǎng)基濾紙，并在下層培養(yǎng)基中央接入病菌塊，再于28'C黑暗條件下培養(yǎng)4d、7d后用十字交叉法測量病菌菌落直徑，計算平均直徑，比較各菌株的抑菌活性。以不接種拮抗菌發(fā)酵液的處理為對照，每處理4個重復(fù)。二、結(jié)果與分析采用平板對峙培養(yǎng)法，待測的5株細(xì)菌(菌株1~5)與病菌對峙培養(yǎng)4d后的抑菌帶寬度分別為0.83cm、0.86cm、0.81cm、0.98cm和0.75cm,以菌株4抑菌帶寬度值最大，抑菌帶寬度值由大至小依次是4>2>1>3>5，共有2個顯著性差異水平；兩者對峙培養(yǎng)7d后的抑菌帶寬度分別為0.25011、0.50cm、0.23cm、0.48cm和0.48cm，以菌株2抑菌帶寬度值最大，抑菌帶寬度值由大至小依次是2>4=5>1>3,有2個顯著性差異水平，這是由于隨著對峙培養(yǎng)時間的延長，病菌繼續(xù)朝拮抗菌方向生長，表現(xiàn)為抑菌帶寬度在不斷縮少。用平板對峙法篩選拮抗細(xì)菌，優(yōu)點是操作簡便，時間短，4d可以看出初步結(jié)果，適合拮抗細(xì)菌的初步篩選。但是采用此法在不同時間測量抑菌帶寬度，獲得的結(jié)果差異較大，試驗結(jié)果不穩(wěn)定，菌株間表現(xiàn)的差異不明顯。表1平板對峙法測定拮抗細(xì)菌對香蕉枯萎病菌生長影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>采用培養(yǎng)基帶毒法,香蕉枯萎病菌在含待測的5株細(xì)菌(菌株15)培養(yǎng)發(fā)酵液中的PDA平板中培養(yǎng)4d，病菌菌落直徑分別為2.10cm、1.69cm、1.70cm、1.96cm和1.21cm,各菌株的抑菌活性由大至小分別為5>2>3>4>1，有3個顯著性差異水平；香蕉枯萎病菌在含待測的5株細(xì)菌(菌株1~5)培養(yǎng)發(fā)酵液中的PDA平板中培養(yǎng)7d，病菌菌落直徑分別為3.27cm、2.60cm、3.08cm、3.12cm和2.08cm，各菌株的抑菌活性由大至小分別為5>2>3>4>1，有4個顯著性差異水平。采用培養(yǎng)基帶毒法，檢測細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)酵濾液的抑菌活性，是一種較為理想的方法，能真實反應(yīng)菌株之間的抗菌活性大小，但是試驗過程中較為繁瑣，試驗周期較長，有的菌株間差異不明顯。10表2培養(yǎng)基帶毒法測定拮抗細(xì)菌對香蕉枯萎病菌生長抑制效果(含拮抗細(xì)菌無菌發(fā)酵液PDA培養(yǎng)基)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>抑菌活性排序結(jié)果5>2>3>4>1,3個顯著性差異水平5>2>3>4>1，4個顯著性差異水平采用雙層培養(yǎng)基濾紙夾心法，香蕉枯萎病菌在含待測的5株細(xì)菌(菌株1~5)代謝產(chǎn)物的PDA平板中培養(yǎng)4d，病菌菌落直徑分別為1.10cm、0.81cm、0.88cm、l.OOcm和0.70cm，各菌株的抑菌活性由大至小分別為5>2>3>4>1，有5個顯著性差異水平；香蕉枯萎病菌在含待測的5株細(xì)菌代謝產(chǎn)物的PDA平板中培養(yǎng)7d，病菌菌落直徑分別為1.51cm、0.98cm、1.29cm、1.50cm和0.88cm,各菌株間差異明顯，各菌株的抑菌活性由大至小分別為5>2>3>4>1，有4個顯著性差異水平。由于拮抗細(xì)菌代謝分泌產(chǎn)物在培養(yǎng)基中通過自然力作用，均勻擴散性，病菌菌落在含拮抗細(xì)菌代謝分泌產(chǎn)物的培養(yǎng)基上生長規(guī)則，兩次測量結(jié)果一致。試驗結(jié)果誤差小，穩(wěn)定，在操作上方便，各菌株間差異明顯，試驗4~7(1可以看出與表2結(jié)果較為吻合。表3雙層培養(yǎng)基濾紙夾心法測定拮抗細(xì)菌對香蕉枯萎病菌生長影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>抑菌活性排序結(jié)果三、拮抗細(xì)菌幾種測定方法效果評價1、平板對峙法拮抗菌和病菌共培養(yǎng)需5~7d，操作簡便，但抑菌活性不穩(wěn)定，試驗誤差大，拮抗菌株間表現(xiàn)的差異最不明顯。2、培養(yǎng)基帶毒法拮抗菌發(fā)酵液培養(yǎng)2~3d，離心液無菌過濾后，無菌檢測需23d，制帶毒培養(yǎng)基，觀察有無細(xì)菌感染需23d，培養(yǎng)病菌^7d，拮抗菌株間表現(xiàn)的差異較為明顯。但過濾膜價格高，操作最為耗時耗財，有時過濾操作不當(dāng)和無菌檢測不全面易導(dǎo)試驗失敗。3、雙層培養(yǎng)基濾紙夾心法拮抗菌培養(yǎng)l~2d,培養(yǎng)病菌4~7d，拮抗菌株間表現(xiàn)的差異最為明顯。易操作，且試驗材料中濾紙便宜。待試驗的下層培養(yǎng)基常溫下存1個月，平板中拮抗細(xì)菌代謝產(chǎn)物的抗菌活性仍然穩(wěn)定，可檢測多種拮抗細(xì)菌對多種病原真菌抑菌活性，適合多種拮抗細(xì)菌抑菌譜的研究。權(quán)利要求1.一種改進(jìn)的拮抗細(xì)菌生物測定方法，其特征在于采用雙層培養(yǎng)基濾紙夾心法，將一定濃度細(xì)菌培養(yǎng)液或菌苔稀釋液均勻涂抹于上層培養(yǎng)基中，拮抗細(xì)菌在上層培養(yǎng)基生長產(chǎn)生的代謝分泌物會通過濾紙層均勻擴散到下層培養(yǎng)基中，移去濾紙及其攜帶的上層培養(yǎng)基，下層培養(yǎng)基即為含拮抗細(xì)菌代謝分泌產(chǎn)物的平板，易于進(jìn)行對多種病原真菌菌絲生長、孢子萌發(fā)及細(xì)菌生長的生物測定。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改進(jìn)的拮抗細(xì)菌生物測定方法，其特征在于在拮抗菌和病原菌己培養(yǎng)基礎(chǔ)上，按照如下步驟進(jìn)行1)根據(jù)病原真菌和拮抗細(xì)菌的種類制作適合病原真菌生長的常規(guī)培養(yǎng)基和適合拮抗細(xì)菌生長的常規(guī)培養(yǎng)基；2)制作無菌濾紙平板模用直徑為12cm的濾紙平鋪于直徑為8.9cm玻璃培養(yǎng)皿中，超出寬度1.5cm的濾紙邊緣使之皺褶，并置于平皿中高壓滅菌，無菌濾紙平板模成形備用；3)制作適合病原真菌生長的下層培養(yǎng)基，在直徑為8.9cm玻璃培養(yǎng)皿中加入10ml的適合病原真菌生長的常規(guī)培養(yǎng)基為下層培養(yǎng)基，厚度為34mm，凝固后待用；4)移入無菌濾紙模在下層培養(yǎng)基上方移入無菌濾紙模，鈹褶處貼于培養(yǎng)皿皿壁，平板處浸濕并緊貼于培養(yǎng)基；5)制作適合拮抗細(xì)菌生長的上層培養(yǎng)基在無菌濾紙模上加入10ml的適合拮抗細(xì)菌生長的常規(guī)培養(yǎng)基為上層培養(yǎng)基，凝固后待用，上層培養(yǎng)基通過濾紙模與下層培養(yǎng)基分隔；6)培養(yǎng)待測拮抗細(xì)菌吸取細(xì)菌液均勻涂抹于上層平板中，于適宜細(xì)菌生長的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，上層適合拮抗細(xì)菌生長的常規(guī)培養(yǎng)基上均勻長滿拮抗細(xì)菌；7)移出無菌濾紙模拮抗細(xì)菌培養(yǎng)48h后，細(xì)菌分泌的代謝產(chǎn)物會通過濾紙層向下層適合病原真菌生長的常規(guī)培養(yǎng)基均勻擴散，此時移出的含上層培養(yǎng)基的濾紙模，含細(xì)菌分泌的代謝產(chǎn)物的下層培養(yǎng)基可作為生物測定試材；8)培養(yǎng)目標(biāo)病原真菌在含細(xì)菌代謝分泌產(chǎn)物的下層適合病原真菌生長的常規(guī)培養(yǎng)基中央接入菌齡一致的待測病菌菌餅，于適宜病菌生長的條件下培養(yǎng)；9)實驗結(jié)果測量待測病菌生長47d后測量病菌菌落直徑；以不接種拮抗細(xì)菌的處理為空白對照，設(shè)多個重復(fù)；10)篩選拮抗細(xì)菌:通過實驗結(jié)果分析比較拮抗細(xì)菌的抑菌能力，完成拮抗細(xì)菌生物測定，真實評價拮抗細(xì)菌對病菌的生測效果，正確篩選出抑菌效果好的拮抗菌株。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的改進(jìn)的拮抗細(xì)菌生物測定方法，其特征在于所述適合病原真菌生長的常規(guī)培養(yǎng)基為常規(guī)的PDA培養(yǎng)基。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的改進(jìn)的拮抗細(xì)菌生物測定方法，其特征在于所述適合拮抗細(xì)菌生長的常規(guī)培養(yǎng)基為常規(guī)的NA培養(yǎng)基。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的改進(jìn)的拮抗細(xì)菌生物測定方法，其特征在于所述的直徑為12cm的濾紙采用高速101型。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的改進(jìn)的拮抗細(xì)菌生物測定方法，其特征在于所述步驟8)中的待測病菌菌餅的直徑為0.5cm。全文摘要本發(fā)明提供一種改進(jìn)的拮抗細(xì)菌生物測定方法——雙層培養(yǎng)基濾紙夾心法，所屬的
技術(shù)領(lǐng)域：
涉及生物農(nóng)藥研制必須采用的參試菌株生物測定方法。通過無菌濾紙平板模制作、上下層培養(yǎng)基制作、無菌濾紙模移入和移出、待測拮抗細(xì)菌和目標(biāo)病原真菌培養(yǎng)、實驗結(jié)果測量等簡易程序進(jìn)行拮抗細(xì)菌對植物病原真菌的抗菌活性測定，可合理地篩選出有應(yīng)用價值的拮抗細(xì)菌。本發(fā)明屬實施拮抗細(xì)菌生物測定的一種簡便快捷新方法，具有技術(shù)上的創(chuàng)新性，該方法能真實反應(yīng)菌株代謝產(chǎn)物的抗菌能力，具有試驗穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、材料便宜、操作簡便，實驗周期短等優(yōu)點，本發(fā)明可以實現(xiàn)多種拮抗細(xì)菌對多種病原真菌的大量測定，對研究拮抗細(xì)菌生防穩(wěn)定性也具有很好的作用。文檔編號C12Q1/04GK101381762SQ20081007198公開日2009年3月11日申請日期2008年10月24日優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日發(fā)明者杜宜新,楊秀娟,阮宏椿,陳福如,馬紅娟申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所